釀酒酵母中提高乙醇產(chǎn)量的工程拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和蔗糖代謝動(dòng)力學(xué)的研究

1介紹釀酒酵母主要以?xún)煞N方式代謝蔗糖。在第一個(gè)也是占主導(dǎo)地位代謝中，蔗糖被SUC2基因編碼胞外轉(zhuǎn)化酶水解,水解產(chǎn)生葡萄糖和果糖經(jīng)過(guò)由HXT基因家族組員編碼己糖轉(zhuǎn)運(yùn)子幫助擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。在第二種代謝中，蔗糖經(jīng)過(guò)質(zhì)子同向運(yùn)輸機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞并在胞內(nèi)水解。胞內(nèi)和胞外轉(zhuǎn)化酶都是由同一基因（SUC2）編碼。

1、研究從胞外空間到胞內(nèi)蔗糖水解重新定位能否用于提升蔗糖乙醇產(chǎn)量；2、對(duì)于只能利用胞內(nèi)轉(zhuǎn)化酶菌株，是否有其它步驟提升其蔗糖利用率。釀酒酵母中提高乙醇產(chǎn)量的工程拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和蔗糖代謝動(dòng)力學(xué)的研究第1頁(yè)2材料與方法2.1酵母菌株及保養(yǎng)用于該研究釀酒酵母菌株是CEN.PK族同源體系。2.2菌株構(gòu)建參考菌株CEN.PK113-7D(SUC2)改良iSUC2菌株IMI056、IMM007、IMM008、IMM009。釀酒酵母中提高乙醇產(chǎn)量的工程拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和蔗糖代謝動(dòng)力學(xué)的研究第2頁(yè)2.3培養(yǎng)基和培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)：含有100ml合成培養(yǎng)基500ml搖瓶置于200rpm

Innova震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。50%蔗糖溶液在轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基之前經(jīng)過(guò)過(guò)濾滅菌。厭氧培養(yǎng)培養(yǎng)基需添加溶于乙醇麥角甾醇（10mg/l）和吐溫80（420mg/l）。在800rpm、30℃2L試驗(yàn)室生物反應(yīng)器中進(jìn)行厭氧恒化發(fā)酵。有效容積用電子傳感器和廢水泵保持在1.0L。pH經(jīng)過(guò)自動(dòng)添加2MKOH保持在5.0。培養(yǎng)過(guò)程中以500ml/min噴入氮?dú)猓?lt;10ppm氧氣）。在生物反應(yīng)器中，使用氯化橡膠管子和氟橡膠O型圈，培養(yǎng)器皿用氮?dú)鉀_洗。釀酒酵母中提高乙醇產(chǎn)量的工程拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和蔗糖代謝動(dòng)力學(xué)的研究第3頁(yè)2.4分析方法將液體培養(yǎng)基離心處理后取得上清液、殘留糖分上清液和培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)HPLC分析，HPLC用是60℃、5mMH2SO4作為流動(dòng)相，流速為0.6ml/minAminexHPX-87H離子交換柱。乙醇、甘油、琥珀酸鹽和乳酸鹽由Waters2410相差檢測(cè)儀檢測(cè)。丙酮酸和醋酸鹽是由Waters2487紫外檢測(cè)儀214nm處檢測(cè)得到蒸發(fā)得到乙醇濃縮物。釀酒酵母中提高乙醇產(chǎn)量的工程拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和蔗糖代謝動(dòng)力學(xué)的研究第4頁(yè)2.5轉(zhuǎn)化酶試驗(yàn)在恒化器中選出細(xì)胞，沖洗兩次，在冷水中重新懸浮。胞外轉(zhuǎn)化酶活性由葡萄糖發(fā)酵測(cè)得。在30℃、含有150mM蔗糖、50mM氟化鈉50mMTris-丁二酸緩沖(pH5.0)中進(jìn)行細(xì)胞孵育。為測(cè)轉(zhuǎn)化酶總活力，細(xì)胞用乙醇、10%TritonX-100和甲苯(1:4:1)滲透，沖洗兩次，并在30℃、含100mM蔗糖50mMTris-丁二酸緩沖(pH5.0)中孵育。全部試驗(yàn)一式三份，確保標(biāo)準(zhǔn)誤差<10%釀酒酵母中提高乙醇產(chǎn)量的工程拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和蔗糖代謝動(dòng)力學(xué)的研究第5頁(yè)2.6蔗糖質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)蔗糖吸收中質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)取決于酵母懸浮液中對(duì)pH改變統(tǒng)計(jì)。酵母細(xì)胞懸浮在細(xì)胞濃度為25g/lK-鄰苯二甲酸酯緩沖液（pH5.0）中，并存放在總體積為5ml水夾套容器中。懸浮物在30℃下由磁力攪拌器混合。蔗糖引發(fā)pH改變由pH傳感器監(jiān)控。為了計(jì)算質(zhì)子吸收率，用100-500nmolNaOH細(xì)胞懸浮液做一標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。蔗糖引發(fā)最初質(zhì)子吸收率由蔗糖添加后第一個(gè)10-20s斜率減去蔗糖添加前質(zhì)子吸收率。全部試驗(yàn)一式三份，確保標(biāo)準(zhǔn)誤差<15%。釀酒酵母中提高乙醇產(chǎn)量的工程拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和蔗糖代謝動(dòng)力學(xué)的研究第6頁(yè)2.7微列陣處理和分析DNA芯片分析采取S98酵母基因芯片陣列法，細(xì)胞直接從恒化器中轉(zhuǎn)移到液氮中，經(jīng)過(guò)15ug完整RNA與一個(gè)環(huán)cDNA綜合體試劑盒組成成份就能合成一個(gè)雙股cDNA綜合體。在試管轉(zhuǎn)錄之前利用基因芯片樣品清理模塊純化雙鏈cDNA，并標(biāo)明是基因芯片IVT標(biāo)識(shí)試劑盒。最終，在15ug生物?；痗RNA分裂和雜交之前用基因芯片樣品凈化模塊純化標(biāo)識(shí)cRNA。陣列圖像和過(guò)濾數(shù)據(jù)采集和定量是由Affymetrix基因芯片操作系統(tǒng)軟件（1.2版）來(lái)完成。添加在MicrosoftExce中微陣列顯著性分析（SAM）2.23A版本用于比較在蔗糖限制條件下IMI056和IMM007復(fù)制陣列試驗(yàn)。釀酒酵母中提高乙醇產(chǎn)量的工程拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和蔗糖代謝動(dòng)力學(xué)的研究第7頁(yè)3.1蔗糖代謝拓?fù)鋵W(xué)：影響生物量和乙醇產(chǎn)量理論分析只采取胞內(nèi)水解路徑菌株乙醇產(chǎn)量增加與采取胞外路徑菌株產(chǎn)量有以下關(guān)系（1）YSucE，intra=0.75YSucE，extra+0.25YSucE，max（2）R=0.75+1/YSucE，extra其中R=YSucE，intra/YSucE，extra在參考菌株CEN.PK113-7D厭氧蔗糖限制性恒化培養(yǎng)中，蔗糖乙醇產(chǎn)量為2.96mol/mol。假設(shè)該菌株胞內(nèi)蔗糖水解作用可忽略，則乙醇產(chǎn)量與YSucE，extra一致。這表明胞內(nèi)水解作用轉(zhuǎn)變可使乙醇產(chǎn)量提升8.7%。釀酒酵母中提高乙醇產(chǎn)量的工程拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和蔗糖代謝動(dòng)力學(xué)的研究第8頁(yè)3.2SUC2基因工程引發(fā)胞液中轉(zhuǎn)化酶重定位在工程菌株‘iSUC2’IMI056和參考菌株CEN.PK113-7D(SUC2)中轉(zhuǎn)化酶定位是經(jīng)過(guò)比較總和胞外蔗糖水解活性來(lái)分析。在對(duì)照菌株中90%總轉(zhuǎn)化酶活性來(lái)自于胞外，在iSUC2中94%轉(zhuǎn)化酶活性來(lái)自于胞內(nèi)（表3）。iSUC2菌株總轉(zhuǎn)化酶活性比對(duì)照菌株高，可能是因?yàn)楸硎緄SUC2基因ADH1開(kāi)啟子應(yīng)用。在iSUC2菌株IMI056中發(fā)覺(jué)在胞外有低轉(zhuǎn)化酶活性（表3），可能是因?yàn)橐恍┌麅?nèi)轉(zhuǎn)化酶釋放或是其它未知低活性胞外蔗糖水解酶。釀酒酵母中提高乙醇產(chǎn)量的工程拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和蔗糖代謝動(dòng)力學(xué)的研究第9頁(yè)6%90%蔗糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)最適動(dòng)力學(xué)妨礙蔗糖胞內(nèi)水解代謝一些胞內(nèi)轉(zhuǎn)化酶釋放或是其它未知低活性胞外蔗糖水解酶

釀酒酵母中提高乙醇產(chǎn)量的工程拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和蔗糖代謝動(dòng)力學(xué)的研究第10頁(yè)3.3轉(zhuǎn)化酶胞質(zhì)表示對(duì)生長(zhǎng)化學(xué)計(jì)量學(xué)輕微影響iSUC2菌株生物產(chǎn)量只比SUC2對(duì)照菌株低6±2%（表3）。這個(gè)差異遠(yuǎn)小于胞內(nèi)蔗糖完全水解??時(shí)預(yù)測(cè)25%差異。與兩種菌株生物產(chǎn)量微小差異相一致，工程菌乙醇產(chǎn)量只有一個(gè)微小增加（表3）。工程菌IMI056(1.8g/l)恒化培養(yǎng)中蔗糖殘余濃度比對(duì)照菌株CEN.PK113-7D(<0.1g/l)要高很多。這表明蔗糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)最適動(dòng)力學(xué)阻止了高效蔗糖胞內(nèi)水解代謝。釀酒酵母中提高乙醇產(chǎn)量的工程拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和蔗糖代謝動(dòng)力學(xué)的研究第11頁(yè)3.4提升蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)量和乙醇產(chǎn)量恒化培養(yǎng)試驗(yàn)室進(jìn)展提升一個(gè)數(shù)量級(jí)從2g/l降低到大約0.1g/l釀酒酵母中提高乙醇產(chǎn)量的工程拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和蔗糖代謝動(dòng)力學(xué)的研究第12頁(yè)3.5AGT1對(duì)提升改良iSUC2菌株蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)上主要作用為研究AGT1在提升蔗糖質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)方面所設(shè)計(jì)原因，改良iSUC2菌株IMM007中敲出AGT1。轉(zhuǎn)運(yùn)體在改良菌株中仍表現(xiàn)出二分之一蔗糖質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)量，該轉(zhuǎn)運(yùn)體正確整合了AGT1基因轉(zhuǎn)座子。染色體DNA診療PCR擴(kuò)增顯示出改良iSUC2菌株中全部AGT1重復(fù)片段，去除改良iSUC2菌株中全部AGT1重復(fù)片段時(shí)，它蔗糖質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)能力快速下降。釀酒酵母中提高乙醇產(chǎn)量的工程拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和蔗糖代謝動(dòng)力學(xué)的研究第13頁(yè)在胞內(nèi)蔗糖水解作用和有效地蔗糖發(fā)酵中Agt1p蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體存在

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