實(shí)驗(yàn)七毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電色譜

關(guān)于實(shí)驗(yàn)七毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電色譜電泳

electrophoresis是指溶液中帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的電動(dòng)現(xiàn)象。毛細(xì)管電泳

capillaryelectrophoresis是利用被分析離子在電場(chǎng)作用下移動(dòng)的速率不同而達(dá)到分離的目的，這種技術(shù)主要用來(lái)分析在毛細(xì)管緩沖溶液中能離解為離子的物質(zhì)。概念

毛細(xì)管電泳是一類以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)分離的新型液相分離分析技術(shù)。

毛細(xì)管電泳是分析科學(xué)中繼高效液相色譜之后的又一重大進(jìn)展，它使分析科學(xué)從微升水平得以進(jìn)入納升水平，并使單細(xì)胞分析成為可能。第2頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天毛細(xì)管電色譜（capillaryelectrochromatography;CEC）是毛細(xì)管電泳與液相色譜相結(jié)合形成的一種高效、快速微分離分析技術(shù)。

優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)單，試樣量少，分離效率高，成本低等。在遷移時(shí)間上的重現(xiàn)性，進(jìn)樣的準(zhǔn)確性和檢測(cè)靈敏度方面比高效液相色譜法稍遜。毛細(xì)管電色譜可以分離離子和中性分子。它是利用緩沖溶液的電滲流作為泵，使被分析的分子通過(guò)對(duì)其具有不同保留程度的第二相，達(dá)到分離的目的。第3頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.1．毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電色譜的基本理論21.1.1．雙電層和Zeta電勢(shì)第4頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.1.2．電泳

在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場(chǎng)作用下，以不同的速度或速率向其所帶電荷相反電場(chǎng)方向遷移的現(xiàn)象叫作電泳。陰離子向正極方向遷移，陽(yáng)離子向負(fù)極方向遷移，中性化合物不帶電荷，不發(fā)生電泳運(yùn)動(dòng)。在充滿自由溶液開(kāi)口管中球形粒子的電泳速率公式為：電泳淌度（μep)定義為單位場(chǎng)強(qiáng)下離子的平均電泳速率，即第5頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天在電泳過(guò)程中還存在另一種電動(dòng)現(xiàn)象，即電滲。當(dāng)高電壓通過(guò)含有緩沖溶液的毛細(xì)管柱時(shí)，體相溶液整體朝向一個(gè)方向運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生電滲流。在柱內(nèi)層氧化硅與溶質(zhì)的界面上形成雙電層是電滲流產(chǎn)生的原因。。在典型的毛細(xì)管電泳分離中，若有電滲存在，離子的洗脫順序是:首先是最快的陽(yáng)離子，緊接著是依次減慢的陽(yáng)離子，然后是全部的中性分子在一個(gè)區(qū)域出現(xiàn)，最后是最慢的陰離子，緊接著的是依次加快的陰離子。21.1.3．電滲流第6頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.1.3．電滲流

以電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生的溶液電滲流，與高效液相色譜中由高壓泵產(chǎn)生的液體流型不同：

電滲是CE的基本現(xiàn)象之一，它可以控制組分的遷移速率和方向，進(jìn)而影響CE的分離效率和重現(xiàn)性，所以電滲流控制是CE中的關(guān)鍵問(wèn)題或技術(shù)之一。第7頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.1.4.電滲流的控制影響電滲流的因素很多，直接影響因素有：1.電場(chǎng)強(qiáng)度2.溫度3.pH值4.緩沖液溶劑5.離子強(qiáng)度6.添加劑7.管壁涂層第8頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.1.5.分離原理

電泳和電滲流并存，在不考慮相互作用的前提下，粒子在毛細(xì)管內(nèi)電介質(zhì)中的遷移速率是兩種速率的矢量和：在典型的毛細(xì)管電泳分離中，溶質(zhì)的分離基于溶質(zhì)間電泳速率的差異。電滲流的速率絕對(duì)值一般大于粒子的電泳速率，并有效地成為毛細(xì)管電泳的驅(qū)動(dòng)力。溶質(zhì)從毛細(xì)管的正極端進(jìn)樣，帶正電的粒子最先流出，中性粒子次之，帶負(fù)電的粒子在中性粒子之后流出。溶質(zhì)依次通過(guò)檢測(cè)器，得到與色譜圖極為相似的電泳分離圖譜。第9頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.1.5.分離原理

毛細(xì)管電色譜由于引入了色譜機(jī)制，其保留機(jī)理包括兩個(gè)方面:

其一，如同HPLC，基于溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)間分配過(guò)程；其二，如同CE，基于溶質(zhì)電遷移過(guò)程。由于CEC既能分離電中性溶質(zhì)，又能分離帶電溶質(zhì)，對(duì)復(fù)雜的混合樣品顯示出強(qiáng)大的分離潛力。第10頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.2.毛細(xì)管電泳和電色譜儀器裝置21.2.1.儀器基本結(jié)構(gòu)一般在一根長(zhǎng)40~100cm,內(nèi)徑10~100m的毛細(xì)管柱中充入緩沖溶液，柱的兩端置于兩個(gè)緩沖池中。在兩個(gè)緩沖池之間的毛細(xì)管接有兩個(gè)鉑電極。試樣從一端進(jìn)入，而檢測(cè)器則在另一端。使用的高電壓可以反相，以能分析陰離子。第11頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.2.2.進(jìn)樣系統(tǒng)

毛細(xì)管分離通道十分細(xì)小，整個(gè)柱體積一般只有4~5μL，所需的樣品區(qū)帶只有幾納升。毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣方式一般是將毛細(xì)管的一端從緩沖液移出，放入試樣瓶中，使毛細(xì)管直接與樣品接觸，然后由重力、電場(chǎng)力或其他動(dòng)力來(lái)驅(qū)動(dòng)樣品流入管中。進(jìn)樣量可以通過(guò)控制驅(qū)動(dòng)力的大小或時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)控制。CE進(jìn)樣技術(shù)均適用于CEC。一般的進(jìn)樣方式是電動(dòng)進(jìn)樣和壓力進(jìn)樣。電動(dòng)進(jìn)樣是將毛細(xì)管柱的一端及其相應(yīng)端的電極從緩沖池中移出，放入試樣杯中，然后在一準(zhǔn)確時(shí)間范圍內(nèi)施加壓力，使試樣因離子移動(dòng)和電滲流進(jìn)入毛細(xì)管柱。壓力進(jìn)樣是用壓差使試樣溶液進(jìn)入毛細(xì)管。產(chǎn)生壓差的辦法可以采用在檢測(cè)器端抽真空，或者通過(guò)提高試樣端液面。第12頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.2.3.電源及其回路

電流回路系統(tǒng)包括高壓電源、電極、電極槽、導(dǎo)線和電解質(zhì)緩沖溶液等。CE和CEC一般采用0~±30kV連續(xù)可調(diào)的直流高壓電源。理想的電源應(yīng)具備：

1.能輸出單極直流高壓(一端接地)；

2.電壓、電流、功率輸出模式任意可選；

3.能控制電壓、電流或電功率的梯度；

4.電壓輸出精度應(yīng)高于1%。

CE的電極通常由直徑0.5~lmm的鉑絲制成。電極槽，即緩沖液瓶，通常是帶螺口的小玻璃瓶或塑料瓶(1~5mL不等)，要便于密封。緩沖液內(nèi)含電解質(zhì)，充于電極槽和毛細(xì)管中，通過(guò)電極、導(dǎo)線與電源連通，一同構(gòu)成整個(gè)電流回路。第13頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.2.4.毛細(xì)管及其溫度控制

熔融石英毛細(xì)管在CE中應(yīng)用最廣泛，熔融石英拉制得到的毛細(xì)管很脆，易折斷，一般在外表面涂有聚酰亞胺保護(hù)層，使之變得富有彈性，不易折斷。內(nèi)徑越小，表面積/體積比越大，散熱效果越好。內(nèi)徑小，樣品負(fù)載小，檢測(cè)、進(jìn)樣、清洗等操作困難。一般使用的毛細(xì)管柱內(nèi)徑在25~100μm之間，目前最常用的是50μm和75μm兩種。檢測(cè)窗口部位的外涂層剝離。焦耳熱效應(yīng)產(chǎn)生徑向溫度梯度，還會(huì)導(dǎo)致分離重現(xiàn)性差。商品儀器大多有溫度控制系統(tǒng)，主要采用風(fēng)冷和液冷兩種方式。一般采用物理吸附或化學(xué)鍵合兩種方式形成毛細(xì)管內(nèi)壁涂層，對(duì)石英毛細(xì)管進(jìn)行改性或修飾，可有效控制電滲流、抑制吸附進(jìn)而優(yōu)化分離。

第14頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.2.5.檢測(cè)系統(tǒng)第15頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.3.毛細(xì)管電泳分離模式及應(yīng)用21.3.1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillaryzoneelectrophoresis;CZE）21.3.1.1.基本操作條件毛細(xì)管區(qū)帶電泳也稱為毛細(xì)管自由溶液區(qū)帶電泳，是毛細(xì)管電泳最基本、也是應(yīng)用最廣的一種操作模式。其分離原理是基于樣品組分荷質(zhì)比的差異。需要控制的操作變量主要是電壓、緩沖液濃度、pH值和添加劑等。緩沖液的選擇通常須遵循下述要求：

1．在所選擇的pH范圍內(nèi)有合適的緩沖容量。

2．本底檢測(cè)響應(yīng)低。

3．自身的淌度低，即離子大而荷電小。第16頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.3.1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）

在CZE分離中，除了背景電解質(zhì)外，常常還在緩沖溶液中加入某些添加劑：

1.中性鹽

2.表面活性劑

3.手性添加劑

對(duì)于許多水難溶的樣品，如果在緩沖液中加入少量的有機(jī)溶劑，常常能有效改善分離度。在極端情況下，可完全使用有機(jī)溶劑，或以有機(jī)溶劑為主體，這就是非水毛細(xì)管電泳技術(shù)。圖21-6電滲流反向示意圖第17頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.3.1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）21.3.1.2.應(yīng)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳特別適合分離帶電化合物，包括無(wú)機(jī)陰離子、無(wú)機(jī)陽(yáng)離子、有機(jī)酸、胺類化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)等，不能分離中性化合物。毛細(xì)管區(qū)帶電泳3分鐘內(nèi)分離30種陰離子電泳圖

第18頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天21.3.2.毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）

毛細(xì)管凝膠電泳(capillarygelelectrophoresis;CGE)是在毛細(xì)管中充填多孔凝膠作為支持介質(zhì)進(jìn)行電泳，其分離是基于篩分機(jī)理。

CGE常用于蛋白質(zhì)，寡聚核苷酸、RNA及DNA片段的分離和測(cè)定。凝膠是毛細(xì)管電泳的理想介質(zhì)，粘度大，抗對(duì)流，能減少溶質(zhì)的擴(kuò)散，因此能限制譜帶的展寬，所得的峰型尖銳，柱效高，有可能使組分在短柱上實(shí)現(xiàn)極好的分離。常用的凝膠有聚丙烯酰胺和瓊脂糖，應(yīng)用最多的是前者。第19頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天填充柱毛細(xì)管電色譜基于填充柱的電色譜是各種電泳中最新出現(xiàn)的一種技術(shù)。它是利用電滲透驅(qū)動(dòng)極性溶劑通過(guò)反相高效液相色譜毛細(xì)管柱，利用試樣在兩相的分配進(jìn)行分離。膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜是在緩沖溶液中加入濃度高于膠束臨界濃度的表面活性劑。膠束相在分離中起到了準(zhǔn)固定相的作用，電中性的有機(jī)化合物按照它們?cè)谒嗪陀袡C(jī)相之間分配系數(shù)的差異進(jìn)行分離。該方法也可用來(lái)改善帶電有機(jī)化合物的分離選擇性。21.3.3.毛細(xì)管電色譜（CEC）將CE的高效柱和HPLC的高選擇性有機(jī)結(jié)合起來(lái)，開(kāi)辟了高效的微分離技術(shù)新途徑，它的分離過(guò)程包含了電泳和色譜兩種機(jī)制，溶質(zhì)根據(jù)他們?cè)诹鲃?dòng)相和固定相的分配系數(shù)不同和自身的電泳淌度差異而分離。第20頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MEKC）MEKC是在電泳緩沖溶液中加入表面活性劑，當(dāng)溶液中表面活性劑濃度超過(guò)臨界膠束濃度時(shí)，表面活性劑分子之間的疏水基團(tuán)聚集在一起形成膠束，成為分離體系的準(zhǔn)固定相，溶質(zhì)基于在水相和膠束相之間的分配系數(shù)不同而得到分離。第21頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MEKC）MEKC是在電泳緩沖溶液中加入表面活性劑，當(dāng)溶液中表面活性劑濃度超過(guò)臨界膠束濃度時(shí)，表面活性劑分子之間的疏水基團(tuán)聚集在一起形成膠束，成為分離體系的準(zhǔn)固定相，溶質(zhì)基于在水相和膠束相之間的分配系數(shù)不同而得到分離。

電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν電泳，負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動(dòng)；可用來(lái)分離中性物質(zhì)色譜與電泳分離模式的結(jié)合。第22頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天毛細(xì)管電動(dòng)色譜的優(yōu)點(diǎn)像高效液相色譜，能夠分離不帶電荷的物質(zhì)。像毛細(xì)管電泳法，不需要壓力泵系統(tǒng)的情況下，提供了微量體積試樣溶液的高效分離通過(guò)電滲流泵，而不是通過(guò)機(jī)械輸送流動(dòng)相通過(guò)固定相的。明顯地簡(jiǎn)化了輸送體系。電滲泵產(chǎn)生的是塞子式流動(dòng)輪廓，而不是流體動(dòng)力學(xué)輪廓，因此毛細(xì)管電色譜的分離柱效比高效液相色譜法高。第23