雞胚成纖維細(xì)胞的制作與培養(yǎng)-(2)課件

雞胚成纖維細(xì)胞的制作與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私庠?xì)胞培養(yǎng)的原理，掌握雞胚成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。實(shí)驗(yàn)用途：細(xì)胞培養(yǎng)是病毒學(xué)研究的重要手段，是進(jìn)行病毒性疾病診斷必不可少的工具。病毒能在易感的組織和單層細(xì)胞內(nèi)增殖，并可產(chǎn)生細(xì)胞病變。細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代細(xì)胞培養(yǎng)、傳代細(xì)胞培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)原理：原代細(xì)胞培養(yǎng)是體外制備細(xì)胞培養(yǎng)物的必經(jīng)過程，自供體體內(nèi)取出組織分散單個(gè)成單個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)液中為初次培養(yǎng)，從初次培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。由組織剛剛分離出來的細(xì)胞能夠分裂增殖，形成單層細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)儀器：CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、水浴箱、37℃培養(yǎng)箱實(shí)驗(yàn)材料：蛋架、酒精燈、酒精碘酊棉球、試管架、消毒水等。已滅菌的材料：細(xì)胞培養(yǎng)瓶(5-7mL)、吸管(巴氏吸管)、三角瓶、平皿若干、漏斗、4層紗布（在漏斗里面）、手術(shù)剪、鑷子（裝在鋁飯盒）、燒杯、離心管、注射器等。雞胚：9~11日齡

消化液：含0.25％胰蛋白酶（預(yù)先置于37℃溫箱中）

培養(yǎng)基：用DMEM培養(yǎng)基(含5-10%胎牛血清,100單位雙抗）

Hanks液：洗胚及吹打用實(shí)驗(yàn)方法

1.取胚及剪碎：將胚蛋氣室端向上直立于蛋座上，用碘酊酒精棉消毒氣室，以鑷子擊破卵殼，撕開卵膜、撕破絨尿膜、羊膜，取出胚胎于滅菌平皿中。剪去頭部、翅爪及內(nèi)臟，Hanks液洗去體表血液，移入滅菌燒杯中，用滅菌剪刀剪碎雞胚，使成為約1立方毫米大小的碎塊，加入2-5mLHanks液輕搖洗去體表血液，靜止1～2min，使其組織塊下沉。吸去上層懸液，依同法再洗2次，吸干Hanks液，留組織。

2.消化：先將胰酶放在37℃溫箱中預(yù)熱。將組織塊移到三角瓶中，加入量約3~5倍的0.25%胰酶（一個(gè)雞胚約5mL胰酶），然后將三角瓶放入水浴箱中消化約15-30min左右，每隔5min輕輕搖動(dòng)和觀察一次，由于胰酶作用，使細(xì)胞與細(xì)胞之間的氨基和羧基游離，待液體變混而稍稠，此時(shí)再輕搖可見組織塊懸浮在液體內(nèi)而不易下沉?xí)r或組織塊棱角變模糊則需中止消化。如再繼續(xù)消化下去，可破壞細(xì)胞膜而不易貼壁生長（細(xì)胞死悼），如果消化不夠，則細(xì)胞不易分散。3.洗滌：取出三角瓶后靜置1min，讓組織塊下沉后，吸去胰酶液，用3-5mL的Hanks液反復(fù)清洗3次，吸去胰酶，吸干上清液，留組織塊。4.吹打：加2mL含血清DMEM培養(yǎng)液，以吸管反復(fù)吹吸數(shù)次，使細(xì)胞分散，此時(shí)可見營養(yǎng)液混濁，即為細(xì)胞懸液。靜置1min后，使未沖散的組織塊下沉。5.過濾：用4層紗布將吹打后的細(xì)胞過濾到離心管中。6.離心：

2000rpm，10~15min，棄上清液，用DMEM約2ml重懸沉淀的細(xì)胞（吹打均勻）。7.細(xì)胞計(jì)數(shù)與稀釋：用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，把細(xì)胞液稀釋成50萬~70萬個(gè)/mL。8.分裝培養(yǎng)：先加入約5mLDMEM培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后將重懸的細(xì)胞移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕輕均勻（注意不要溢到瓶蓋）。蓋好瓶塞，置37℃溫箱進(jìn)行培養(yǎng)。在瓶上注明組別，日期，4h后細(xì)胞即可貼壁，24~36h生長成單層細(xì)胞，此時(shí)可更換培養(yǎng)液，并接種病毒。注意事項(xiàng)細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)玻璃器皿洗滌要求嚴(yán)格，徹底洗滌后用蒸餾水沖洗3次，再用雙蒸水沖洗3次，干燥后滅菌備用。所有的溶液都要用雙蒸水配制，所用藥品試劑要用分析純?cè)噭?，?yán)格要求無菌操作。制備細(xì)胞的整個(gè)過程嚴(yán)格無菌操作培養(yǎng)液不要太多，應(yīng)有足夠的空間保證細(xì)胞對(duì)氧的需要。放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)時(shí)，不要將蓋子擰的特別緊，并將CO2濃度控制在5%。一般2d換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞長成單層后要及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。試劑配制Hank’s液配制：

KH2PO40.06g

Nacl8.0gNaHCO30.35g

KCl0.4g

葡萄糖1.0gNa2HPO4·7H2O0.06g

酚紅0.1％1ml

加H2O至1000ml

0.1％胰酶的配制傳代細(xì)胞：0.25％原代細(xì)胞：0.1％

胰蛋白酶：0.25gHank’s100ml

用NaHCO3

調(diào)pH＝7.8（胰酶作用的最適pH）

0.02％EDTA協(xié)助消化過濾除菌DMEM培養(yǎng)基制備：

DMEM培養(yǎng)基

1000雙蒸水用濾膜過濾除菌，用前用NaHCO3調(diào)PH到7.2～7.4，并加10％犢牛血清。DMEM培養(yǎng)基

無水氯化鈣硝酸鐵.9H2O氯化鉀無水硫酸鎂氯化鈉

無水磷酸二氫鈉D-泛酸鈣

丁二酸酒石酸膽堿

丁二酸鈉葉酸肌醇煙酰胺甘氨酸核黃素鹽酸硫胺鹽酸吡哆辛葡萄糖甲硫氨酸

L-絲氨酸

L-色氨酸

L-蘇氨酸

L-酪氨酸

L-纈氨酸

L-鹽酸精氨酸