第8章-酶通論課件

第8章酶通論Enzyme酶的發(fā)現(xiàn)及研究歷史人們對(duì)酶的認(rèn)識(shí)起源于生產(chǎn)與生活實(shí)踐。夏禹時(shí)代，人們掌握了釀酒技術(shù)。公元前12世紀(jì)周朝，人們釀酒，制作飴糖和醬。春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期已知用麴(曲)治療消化不良的疾病。酶者，酒母也酵素的發(fā)現(xiàn)

enzyme("inyeast")enzyme是希臘文en=in，zyme=yeast什么是酶？酶是生物催化劑生物體一切生化反應(yīng)都需酶催化才能進(jìn)行！性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)人造催化劑定義：由活細(xì)胞產(chǎn)生的、有高度專一性和 高效催化作用的生物大分子。一、酶催化作用的特點(diǎn)

1.提高反應(yīng)速度，不改變平衡點(diǎn);2.只起催化作用，本身不消耗；

3.降低反應(yīng)的活化能。（一）與一般催化劑相同的特點(diǎn)

活化能(activationenergy)

指在一定溫度下，1mol底物全部進(jìn)入活化態(tài)所需要的自由能單位：KJ/mol酶催化反應(yīng)的實(shí)質(zhì)：降低反應(yīng)的活化能1.

易失活（溫和性）（二）生物催化劑的特點(diǎn)常溫、常壓、中性

除個(gè)別RNA為催化自身反應(yīng)的酶外，其余所有的酶都是蛋白質(zhì)。2.高效性且無(wú)副反應(yīng)反應(yīng)速度是無(wú)酶催化/普通人造催化劑催化反應(yīng)速度的106——1016倍。酶的催化雙氧水裂解3.專一性Specificity:酶對(duì)催化的反應(yīng)和反應(yīng)物有 嚴(yán)格的選擇性。底物（Substrate):

酶作用的物質(zhì)。

（1）酶濃度的可調(diào)性（2）通過(guò)激素調(diào)節(jié)酶活性（3）反饋抑制調(diào)節(jié)酶活性（4）抑制劑和激活劑（5）別構(gòu)調(diào)控、共價(jià)修飾、同工酶等4.可調(diào)節(jié)性二、酶的化學(xué)本質(zhì)及分類(lèi)①經(jīng)酸堿水解終產(chǎn)物是AA②能被蛋白酶水解而失活③酶可變性失活④酶是兩性電解質(zhì)⑤具有不能通過(guò)半透膜等膠體性質(zhì)⑥具有蛋白質(zhì)的化學(xué)呈色反應(yīng)化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)（一）酶的化學(xué)本質(zhì)1982年T.Cech發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了真正的RNA催化劑。

單純酶：只有蛋白質(zhì)結(jié)合酶（綴合酶）：脫輔酶+輔助因子輔助因子輔基輔酶{與酶結(jié)合緊與酶結(jié)合松全酶（二）酶的化學(xué)組成羧肽酶NADPH—脫氫酶的輔酶過(guò)氧化氫酶結(jié)合酶中：?jiǎn)为?dú)酶蛋白或輔助因子沒(méi)有催化活性一種酶蛋白一般只與一種輔助因子結(jié)合同種輔助因子可與不同的酶蛋白結(jié)合

酶蛋白：決定反應(yīng)的專一性輔助因子：傳遞電子、原子或某些 化學(xué)基團(tuán)的作用monomericenzyme：一般由一條肽鏈組成oligomericenzyme：為寡聚蛋白，≥2個(gè)亞基multienzymecomplex：幾種酶靠非共價(jià)鍵 彼此嵌合而成。由數(shù)個(gè)獨(dú)立的酶組合起來(lái)形成絡(luò)合體，催化一系列反應(yīng)。（如糖代謝、脂代謝）（三）單體酶、寡聚酶、多酶復(fù)合體根據(jù)酶蛋白分子的特點(diǎn)：三、酶的命名和分類(lèi)（一）習(xí)慣命名法根據(jù)其催化底物來(lái)命名；根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來(lái)命名；結(jié)合上述兩個(gè)原則來(lái)命名，有時(shí)在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來(lái)源或其它特點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)

命名簡(jiǎn)單應(yīng)用歷史較長(zhǎng)，使用方便缺點(diǎn)

一名數(shù)酶、一酶數(shù)名為了適應(yīng)酶學(xué)發(fā)展的新情況，國(guó)際酶學(xué)會(huì)議于1961年提出一個(gè)新的系統(tǒng)命名法及分類(lèi)原則，已被國(guó)際生化協(xié)會(huì)采用。（二）國(guó)際系統(tǒng)命名法：系統(tǒng)名稱包括底物名稱、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個(gè)酶字。底物1：底物2+反應(yīng)性質(zhì)+酶乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸：NAD+氧化還原酶當(dāng)?shù)孜餅樗畷r(shí)，可省略

系統(tǒng)名：包括所有底物的名稱和反應(yīng)類(lèi)型。乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸：NAD+氧化還原酶

慣用名：只取較重要的底物名稱和反應(yīng)類(lèi)型。乳酸：NAD+氧化還原酶乳酸脫氫酶對(duì)于催化水解反應(yīng)的酶一般在酶的名稱上省去反應(yīng)類(lèi)型。（三）國(guó)際系統(tǒng)分類(lèi)編號(hào)

1961年國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)（EnzymeCommittee,EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類(lèi)型和機(jī)理，把酶分成6大類(lèi)：氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)，催化氫的轉(zhuǎn)移或電子傳遞。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。1、氧化還原酶

OxidoreductaseAH2+B（O2）A+BH2（H2O2，H2O）（四）六大類(lèi)酶的特征（1）脫氫酶類(lèi)：催化直接從底物上脫氫的反應(yīng)AH2+BA+BH2（需輔酶Ⅰ或輔酶Ⅱ）（2）氧化酶類(lèi)①催化底物脫氫，氧化生成H2O2：AH2+O2A+H2O2（需FAD或FMN）②催化底物脫氫，氧化生成H2O：2AH2+O22A+2H2O（3）過(guò)氧化物酶ROO+H2O2RO+H2O+O2（4）加氧酶（雙加氧酶和單加氧酶）O2+OHOHC=OC=OOHOH（順，順-已二烯二酸）RH+O2+還原型輔助因子ROH+H2O+氧化型輔助因子（又稱羥化酶）轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。根據(jù)X分類(lèi)：轉(zhuǎn)移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烴基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。例如，谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。2、轉(zhuǎn)移酶

TransferaseA·X+BA+B·X水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)：3、水解酶

hydrolaseAB+H2OAOH+BH裂合酶催化從底物分子中移去一個(gè)基團(tuán)或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。4、裂合酶

Lyase異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過(guò)程。

例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)5、異構(gòu)酶

IsomeraseABPP合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N以及C-S鍵的形成反應(yīng)。這類(lèi)反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。丙酮酸+CO2

草酰乙酸6、合成酶

LigaseorSynthetaseA+B+ATPA·B+ADP+Pi酶的系統(tǒng)編號(hào)：4位數(shù)字第一位：代表六大類(lèi)反應(yīng)類(lèi)型第二位：亞類(lèi)（作用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)）第三位：亞亞類(lèi)（精確表示底物/產(chǎn)物的性質(zhì)）第四位：在亞亞類(lèi)中的序號(hào)乳酸脫氫酶

EC1.1.1.27第1大類(lèi)，氧化還原酶第1亞類(lèi)，氧化基團(tuán)CHOH第1亞亞類(lèi)，H受體為NAD+該酶在亞亞類(lèi)中的編號(hào)—指酶對(duì)底物的選擇性，也稱特異性。結(jié)構(gòu)專一性立體異構(gòu)專一性絕對(duì)專一性相對(duì)專一性族專一性鍵專一性旋光異構(gòu)專一性幾何異構(gòu)專一性四、酶的專一性（一）酶的專一性（1）鎖鑰學(xué)說(shuō)——?jiǎng)傂詷?gòu)象（2）誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)（3）結(jié)構(gòu)性質(zhì)互補(bǔ)學(xué)說(shuō)

——靜電效應(yīng)、極性相同（4）三點(diǎn)附著學(xué)說(shuō)

——立體異構(gòu)專一性的酶（二）與酶專一性有關(guān)的學(xué)說(shuō)鎖鑰學(xué)說(shuō)認(rèn)為整個(gè)酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對(duì)一把鎖一樣誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)酶表面并沒(méi)有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀.

（Koshland，1958）：當(dāng)?shù)孜锖兔附佑|時(shí)，可誘導(dǎo)酶分子的構(gòu)象變化，使酶活性中心的各種基團(tuán)處于和底物互補(bǔ)契合的正確空間位置，有利于催化。羧肽酶的誘導(dǎo)契合模式“三點(diǎn)結(jié)合”的催化理論酶與底物的結(jié)合處至少有三個(gè)點(diǎn)，而且只有一種情況是完全結(jié)合的形式。只有這種情況下，不對(duì)稱催化作用才能實(shí)現(xiàn)。（一）酶活力與酶促反應(yīng)速度酶活力就是酶催化反應(yīng)的能力

——能催化多快的反應(yīng)

通常以測(cè)出的酶促反應(yīng)速度表示

五、酶的活力測(cè)定和分離純化單位時(shí)間內(nèi)底物的減少或產(chǎn)物的增加1.酶促反應(yīng)速度的測(cè)定方法產(chǎn)物濃度變化曲線用哪一個(gè)速度來(lái)表示酶促反應(yīng)的速度特征呢？反應(yīng)初速度Vo反應(yīng)初速度表示酶活力2.活力單位(U)酶單位（U）：在一定條件下、一定時(shí)間內(nèi)、將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。如：每小時(shí)催化1克底物每小時(shí)催化1ml某濃度溶液每分鐘催化1ug底物一定時(shí)間一定量底物一定條件下在標(biāo)準(zhǔn)條件下（25℃，最適pH和最適底物濃度）一分鐘內(nèi)催化1微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。

1IU=1mol/min——酶活力單位標(biāo)準(zhǔn)化（1）國(guó)際單位（IU）在標(biāo)準(zhǔn)條件下（25℃，最適pH和最適底物濃度）每秒鐘催化1摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。

1Kat=1mol/s=60×106IU——酶活力單位標(biāo)準(zhǔn)化（2）Kat每mg酶蛋白所含的酶活力單位數(shù)。

u/mg酶蛋白酶產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)中常使用，一定程度上代表酶的純度。（3）比活力

(specificactivity)一定條件下：每秒鐘、每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)或每微摩爾酶分子轉(zhuǎn)換底物的微摩爾數(shù)一秒內(nèi)1摩爾的酶可催化幾摩爾的底物（4）轉(zhuǎn)換數(shù)（turnovernumber）酶活力測(cè)定實(shí)例①確定反應(yīng)條件

20℃、pH=7，底物濃度

6g/l（過(guò)量），加入2mg固體脂肪酶②確定活力單位

每小時(shí)催化1克底物1u=1g/h③測(cè)反應(yīng)初速度

作產(chǎn)物甘油隨時(shí)間增加的曲線，量出反應(yīng)初速度值，換算為脂肪的消耗速度。如8g/h④換算活力

8g/h

/

1g/h=8u⑤計(jì)算比活

8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白脂肪脂肪酶甘油+脂肪酸測(cè)定完成一定反應(yīng)所需的時(shí)間測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)酶催化的化學(xué)反應(yīng)量（1）分光光度法：利用底物/產(chǎn)物光吸收性質(zhì)不同選擇適當(dāng)波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定。（2）熒光法：利用底物/產(chǎn)物熒光性質(zhì)的差別。紫外/可見(jiàn)光3.酶活力的測(cè)定方法（3）同位素測(cè)定方法：放射性同位素標(biāo)記底物，經(jīng)酶作用得到相應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)適當(dāng)分離，測(cè)定產(chǎn)物脈沖數(shù)即可。（4）電化學(xué)法：包括pH測(cè)定法，離子選擇電極法等。前者跟蹤反應(yīng)過(guò)程中H+的變化，后者用氧電極測(cè)定一些耗氧的酶反應(yīng)。（二）酶的分離和純化衡量分離提純效果的兩個(gè)指標(biāo)：①總活力的回收——是表示提純過(guò)程中酶的損失情況②比活力提高的倍數(shù)——是表示提純方法的有效程度分離純化方法同蛋白質(zhì)純化類(lèi)似：1.選材：酶含量豐富的新鮮生物材料2.破碎：因材料而異3.抽提：低溫下以水或低鹽緩沖液抽提4.分離及純化：粗分級(jí)，細(xì)分級(jí)分離5.結(jié)晶6.保存：低溫下酶粉可長(zhǎng)期保存注意低濃度酶溶液易變性酶的制備過(guò)程中，每步都應(yīng)進(jìn)行鑒定常用的鑒定指標(biāo)為：回收率％＝每次總活力×100/第一次總活力純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力

產(chǎn)率酶的純度鑒定：聚丙烯酰胺凝膠電泳法等電聚焦電泳法六、核酶（ribozyme)（一）核酶：具有催化活性的RNA(1)1982年，Cech首先發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)

L19RNA既有RNA酶活性，又有

RNA聚合酶活性。

隨后的研究表明：

L19RNA具備酶促催化的幾個(gè)特征：

高度的底物專一性遵循Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的敏感性

(2)1992年，Piccirilli等發(fā)現(xiàn)L19RNA具有氨酰酯酶的活性，催化氨酰酯水解。

(3)L19RNA還有限制性內(nèi)切酶作用：

-CpUpCpUpN-+G-CpUpCpU+GpN

(4)1997年，Zhang和Cech用人造的RNA分子催化合成了肽鏈，表明RNA具有肽基轉(zhuǎn)移酶活性。

(5)原核生物RNaseP和兔肌1，4--葡聚糖分枝酶均包括RNA+蛋白組分，起催化作用的都是RNA。（二）核酶的種類(lèi)（自我催化）

自我剪切：是轉(zhuǎn)錄后加工方式之一（self-cleavage）

自我剪接（self-splicing）

需要鳥(niǎo)苷和Mg2+參與不需要鳥(niǎo)苷的參與剪切與連接催化分子內(nèi)反應(yīng)核酶的典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：

三個(gè)螺旋

13個(gè)保守堿基

剪切點(diǎn)：GUN

RNA既能攜帶遺傳信息又有生物催化功能。——RNA可能早于蛋白質(zhì)和DNA，是生命起源中首先出現(xiàn)的生物大分子切割癌基因、致病病毒基因（三）核酶的研究意義與應(yīng)用前景是具有催化作用的抗體本質(zhì)是免疫球蛋白

——在易變區(qū)被賦予酶的屬性，又被稱為催化性抗體?；鶓B(tài)底物過(guò)渡態(tài)底物七、抗體酶（abzyme)第一代抗體酶

（過(guò)渡態(tài)底物的抗體）

1986年，Schultz與Lerner同時(shí)得到了具有催化活性的抗體；

第二代抗體酶

（引入法）

將催化基團(tuán)及輔助因子引入到抗原抗體結(jié)合部位。第三代抗體酶

（拷貝法）

酶抗體抗抗體酶工程：酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用。普通酶工程、化學(xué)酶工程、生物酶工程普通酶工程—單純生物提取化學(xué)酶工程1、微生物發(fā)酵得到粗酶2、對(duì)天然酶進(jìn)行化學(xué)修飾、固定化處理，利用化學(xué)合成等手段來(lái)改善酶性能。八、酶工程簡(jiǎn)介

A修飾酶的功能基團(tuán)：親核的Ser、Cys、Thr、Lys、His，親電的Tyr、Trp

可氧化的Tyr、Trp、Met——經(jīng)過(guò)修飾的酶穩(wěn)定性好。（1）化學(xué)修飾酶B交聯(lián)反應(yīng)：用雙功能試劑使酶分