HEK293T細胞培養(yǎng)課件

細胞培養(yǎng)技術主要內容細胞簡介1細胞培養(yǎng)技術平臺2HEK293T細胞的培養(yǎng)具體方法與步驟3細胞培養(yǎng)的常見問題與解決方案4細胞間的操作注意事項5細胞簡介細胞是生命活動的基本單位1665年英國學者RobertHooke，用自制的顯微鏡觀察軟木的薄片，第一次發(fā)現(xiàn)植物的細胞結構，并首次借用拉丁文Cella（小室）詞.細胞簡介細胞是生命活動的基本單位1983-39德國植物學家施萊登和動物學家施旺確立了“細胞學說”的基本原則1、細胞是有機體，動植物都是由細胞發(fā)育來的2、每個細胞都作為一個相對的獨立單位，有自己的“生命”

3、新的細胞可以通過老的細胞繁殖產生

細胞培養(yǎng)技術平臺藥物篩選基因診療治病機理組織工程基因診斷試管嬰兒培養(yǎng)細胞能做什么細胞的培養(yǎng)具體方法與步驟細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)(cellculture)的含義，簡單地說即是把來自機體的組織經分散成為單個細胞，放在類似于體內的體外環(huán)境中生存，使其不斷生長、繁殖或傳代，借以觀察細胞的生長、繁殖、衰老等生命現(xiàn)象。細胞培養(yǎng)技術在遺傳學、免疫學、腫瘤學、病毒學、分子生物學等領域已得到廣泛的應用原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)具體方法與步驟原代培養(yǎng)

用直接從機體獲得的細胞進行的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。這種培養(yǎng)過程主要是采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動物體內取出，經酶消化處理，使分散成單個細胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長和繁殖。原代培養(yǎng)是建立各種細胞系的第一步。細胞的培養(yǎng)具體方法與步驟傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或其他比率轉移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化，把細胞分散成單細胞再傳代，而懸浮型生長細胞則用直接傳代法或離心法傳代。HEK293T和HEK293細胞HEK293細胞簡介HEK293細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)HEK293T和HEK293細胞HEK293細胞簡介HEK293細胞株是轉染腺病毒E1A基因的人胚腎上皮細胞，由于容易轉染且容易培養(yǎng)，常被用于轉染試驗。

HEK293THEK293SV40大T抗原瞬時轉染穩(wěn)定轉染轉染效率更高HEK293T和HEK293細胞瞬時轉染

在瞬時轉染中重組DNA導入感染性強的細胞系已獲得目的基因暫時但高水平的表達。轉染的DNA不必整合進宿主染色體，當用大量的樣品需要在短時間內分析時，尤其是在轉然后的1-4天內收獲細胞，所得的溶解產物用于檢測目的基因的表達，可以采用瞬時表達的方式。穩(wěn)定轉染這種細胞系中轉染的目的基因整合到宿主染色體DNA中并指導適量的目的蛋白的合成。一般來說轉染細胞的效率要比瞬時轉染的效率低1-2個數(shù)量級。HEK293細胞HEK293細胞生長條件完全培養(yǎng)基10%的胎牛血清DMEM(4.0mML-谷氨酰胺4500mg/ml葡萄糖)1%雙抗(1000units/Lpenicillin1000mg/Lstreptomycin)37℃5%CO2無菌技術制定好實驗計劃和操作程序（準備好實驗過程中的一切用品）洗手和著裝（75%酒精消毒）進入超凈臺中的所有物品均需消毒操作野消毒細胞培養(yǎng)耗材HEK293細胞的傳代待細胞的融合率達到90%時進行傳代。棄去舊細胞液4℃遇冷的DPBS（不含Ca2+、Mg2+）4ml沖洗后棄液加入0.05%（37

℃預溫

）胰酶消化加入12ml完全培養(yǎng)基（37℃預溫）將細胞從細胞瓶底部沖下1:4傳代即取3ml細胞懸液加入有9ml完全培養(yǎng)基的新細胞瓶中

放入37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)HEK293細胞的傳代加入0.05%胰酶消化1剛加入胰酶細胞還是致密單層2細胞開始皺縮但不明顯，仍維持細胞正常形態(tài)3細胞明顯皺縮變小，細胞間隙增大不再致密，部分細胞維持正常形態(tài)，部分細胞皺縮變圓4細胞基本皺縮變圓，此時細胞吹打可下。5如消化過頭，會見到許多細胞脫落隨棄去的胰酶溶液流失。HEK293細胞的傳代

HEK293細胞的凍存隨著傳代的次數(shù)增加，293細胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降，出現(xiàn)突變等。所以要在細胞購進時就進行大量凍存，以保證實驗的穩(wěn)定性和持續(xù)性。在細胞對數(shù)生長期進行凍存，增加細胞復蘇成活率。原則：慢凍HEK293細胞的凍存凍存前的準備DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)：試驗前置室溫下。0.05%的胰酶消化液：37℃預溫。程序凍存盒（加250ml異丙醇）、二甲基亞砜(DMSO)、2ml細胞凍存管（標記細胞名稱、代數(shù)、日期）、DPBS（不含鈣鎂）HEK293細胞的凍存凍存前的準備HEK293細胞凍存步驟配制細胞凍存液

取50ml無菌離心管，于超凈臺內，加入適量DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，再逐滴加入二甲基亞砜(DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置室溫下待用。HEK293細胞凍存步驟

取準備凍存的細胞，棄去培養(yǎng)基，以DPBS2-3ml洗細胞一次加入0.5-1.0ml0.05%的胰酶消化加入新鮮培養(yǎng)基10-12ml吹打成細胞懸液收集細胞懸液至50ml無菌離心管，1000rpm，5min離心.棄上清，加入適量培養(yǎng)基取與細胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細胞懸液，DMSO最后濃度為10%HEK293細胞凍存步驟

細胞濃度為1～5×106cells/ml（細胞計數(shù)），分裝于已標示完全之細胞凍存管中將細胞凍存管放入程序凍存盒中（已加250ml異丙醇），置-80℃超低溫冰箱第二天將細胞放入液氮灌，并記錄HEK293細胞凍存步驟細胞凍存的注意事項欲冷凍保存之細胞應在生長良好且存活率高之狀態(tài)冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色，以小體積分裝，4℃避光保存低溫損傷主要發(fā)生在0℃～-60℃這一溫度區(qū)內，這一溫度范圍內不宜過久HEK293細胞的復蘇當細胞傳代次數(shù)過多(超過50代)，細胞狀態(tài)變差時或細胞出現(xiàn)污染事故時，需要丟棄并對開始凍存的細胞進行復蘇原則：快復HEK293細胞的復蘇復蘇前的準備DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)：試驗前置室溫下將水浴鍋預熱至37℃取新培養(yǎng)瓶（75cm2），標記細胞編號、時間，加入10mlDMEM培養(yǎng)基(37℃預熱)，潤濕底面HEK293細胞復蘇步驟

根據(jù)凍存記錄從液氮灌中取出凍存的細胞迅速投入已經預熱至37℃的水浴鍋中，并快速晃動，在1-2min內使完全融化用酒精擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內，有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶輕輕混勻，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)次日換液細胞培養(yǎng)的常見問題與解決方案一、細胞培養(yǎng)污染問題二、何時須更換培養(yǎng)基三、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基四、細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應馬上去除DMSO細胞污染問題與解決方案細胞污染細胞培養(yǎng)中最大的敵人污染包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成份和造成細胞不純的異物（真菌、細菌、病毒和支原體）、化學物質及細胞細胞污染問題與解決方案細胞污染的原因無菌操作技術不當操作室環(huán)境不佳培養(yǎng)基或者血清的污染細胞污染問題與解決方案細胞的細菌污染最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以。革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、假單胞菌等。其中又以白色葡萄球菌較常見。細菌污染后，會很快出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有少數(shù)培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。細胞污染問題與解決方案細胞的細菌污染檢測16SRNAPCR法

細胞污染問題與解決方案常見的細菌污染白色鏈球菌污染以及革蘭氏染色圖片細胞污染問題與解決方案細胞的真菌污染梅雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染。污染培養(yǎng)細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。真菌污染后，霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。細胞污染問題與解決方案細胞的真菌污染檢測鏡檢有絲狀物細胞污染問題與解決方案常見的真菌污染真菌污染霉菌污染細胞污染問題與解決方案細胞的支原體污染細胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率達到63%，因而細胞培養(yǎng)過程中被支原體污染是一個世界性的難題細胞被支原體污染后，細胞內的DNA、RNA及蛋白表達發(fā)生改變，而細胞的生長率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細胞被支原體污染一般難以察覺。細胞污染問題與解決方案細胞的支原體污染檢測試劑盒檢測法：目前已有專門做支原體檢測的試劑盒，可以用細胞滴片進行檢測間接免疫熒光法和免疫印跡：簡便、快速、特異性細胞污染問題與解決方案常見的支原體污染支原體污染的電鏡下圖片細胞污染問題與解決方案細胞污染的解決方法控制環(huán)境污染；嚴格實驗操作原則上棄掉加抗生素

污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。細胞污染問題與解決方案細胞污染的解決方法加抗生素細胞污染問題與解決方案何時需更換細胞液視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可細胞污染問題與解決方案何時需更換細胞液視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可細胞污染問題與解決方案可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基不能，每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活細胞污染問題與解決方案細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應馬上去除DMSO除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。細胞間的操作注意事項未經許可，任何人不得進入細胞間。不得在細胞間內做任何與試驗無關之事。不得攜帶任何與實驗無關或可能導致污染的物品進入細胞間。必須隨時保持細胞間的整潔、衛(wèi)生，及時清理雜物、垃圾。所有設備、物品，使用后必須及時歸位。進入細胞間必須更換細胞間專用拖鞋與工作服。不得將細胞間專用拖鞋與工作服傳出細胞間外。進入細胞間必須養(yǎng)成隨手關門習慣。操作期間，細胞間外門和中門必須處于關閉狀態(tài)。LOGO細胞間的操作注意事項操凈工作臺實驗前和試驗后的滅菌，打開紫外燈15-20分鐘。試驗操作期間，應戴手套。并注意隨時用75%酒精消毒雙手。實驗操作期間，操凈工作臺的風機應處于打開狀態(tài)。操作結束后，關閉擋板、關閉風機。凡是帶入操凈工作臺內的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶等到額瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面。使用倒置顯微鏡前，用75%酒精擦拭消毒載物臺使用二氧化碳培養(yǎng)箱時，應盡量縮短開門時間，減少開門次數(shù)。每次倒置顯微鏡觀察細胞后，用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當旋松瓶蓋，再放入放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。LOGO細胞間的操作注意事項每一個人操作結束后，必須及時清理操凈工作臺內的物品，不得在工作臺內留置或堆積雜物。清理操凈工作臺后，用75%酒精擦拭消毒操凈工作臺面。每一個操作結束后，必須及使用84消毒液消毒管道，并