細(xì)胞原代培養(yǎng)與傳代

關(guān)于細(xì)胞原代培養(yǎng)與傳代細(xì)胞培養(yǎng)定義定義：

模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，將細(xì)胞從機(jī)體中取出，在人工條件下使其生存、生長(zhǎng)、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過(guò)程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問(wèn)題的研究。優(yōu)點(diǎn)：1．活細(xì)胞：同時(shí)、大量、均一性、重復(fù)性；2．可控制：各種物理、化學(xué)、生物等因素可調(diào)控；3．研究方法多樣：倒置、熒光、電子、激光共焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記；4．應(yīng)用廣：不同物種、不同年齡、不同組織、正?；虍惓＃[瘤）；缺點(diǎn)：人工所模擬的條件與體內(nèi)實(shí)際情況仍不完全相同；當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中，時(shí)間久了，必然發(fā)生變化。

第2頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念

傳代：細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開(kāi)接種到新的培養(yǎng)器皿中。

原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。

第3頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天接觸抑制（Contactinhibition）細(xì)胞相互接觸時(shí)，將停止增長(zhǎng)；細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的G0期；轉(zhuǎn)化的細(xì)胞卻可以繼續(xù)生長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞重疊堆積生長(zhǎng)。第4頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天體外培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力不是無(wú)限的，傳代次數(shù)有一定的界限，稱為“Hayflick極限”。傳代次數(shù)與物種壽命有關(guān)：小鼠壽命3年，傳代12次；龜壽命200年，傳代140次。傳代次數(shù)與個(gè)體年齡成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病兒童，2-10代。

細(xì)胞傳代次數(shù)（PassageNumber）第5頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天

原代培養(yǎng)

（primary

culture）從動(dòng)物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。生長(zhǎng)緩慢，繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長(zhǎng)。

克?。╟lone）亦稱無(wú)性繁殖系或無(wú)性系。對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，克隆是指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。

細(xì)胞系（cell

line）從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下可無(wú)限繁殖

細(xì)胞株（cell

strain）從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過(guò)程中其特征始終保持。原代培養(yǎng)與細(xì)胞系第6頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿原代培養(yǎng)期傳代期衰退期第7頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天第8頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天

TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)TheEuropeanCollectionofAnimalCellCulture(ECACC)NationalInstituteofHealth(NIH),USANationalCancerInstitute(NCI),USA細(xì)胞系資源第9頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天有限細(xì)胞系，無(wú)限細(xì)胞系

細(xì)胞系

cellline細(xì)胞株

cellstrain

第10頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)細(xì)胞的特性

培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式貼附生長(zhǎng)：必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見(jiàn)于各種實(shí)體瘤細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)：于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。見(jiàn)于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞第11頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天

每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）第12頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時(shí)第13頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）第14頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天第15頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天第16頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天潛伏期此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)話動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。第17頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。第18頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性第19頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天第20頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、細(xì)胞培養(yǎng)基本要求常用儀器設(shè)備培養(yǎng)器皿培養(yǎng)基血清其他細(xì)胞培養(yǎng)試劑第21頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件1細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要2細(xì)胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4

滲透壓

3無(wú)污染

4無(wú)毒第22頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板，凍存管第23頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時(shí)）。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過(guò)濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過(guò)法除菌超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無(wú)菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒

第24頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天

超凈臺(tái)

超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。

第25頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天濾器第26頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天第27頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。第28頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天第29頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天自動(dòng)雙重純水蒸餾器純水儀第30頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶標(biāo)儀微孔板震蕩器第31頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天CultureflaskCulturePlate

培養(yǎng)器皿第32頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天

浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干常用玻璃器皿清洗第33頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天

清潔液的配制第34頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格便宜。缺點(diǎn)是配制過(guò)程繁瑣，質(zhì)量不易控制液體培養(yǎng)基是由專(zhuān)業(yè)廠家按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)?；a(chǎn)，不僅質(zhì)量得到保證，而且使用十分方便常用的培養(yǎng)基種類(lèi)RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、McCoys5A、M199、F12等第35頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的選擇沒(méi)有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考：

建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購(gòu)買(mǎi)細(xì)胞株時(shí)咨詢。其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。

第36頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天血清使用注意事項(xiàng)血清必須貯存于–20～-70℃，若存放于4℃，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。如果一次無(wú)法用完一瓶，可將40～45ml分裝于無(wú)菌50ml離心管中，由于血清結(jié)凍時(shí)體積會(huì)增加約10%，必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。

血清解凍步驟(逐步解凍法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝。在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。熱滅活（heat-inactivation）是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍之血清。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份(complement)去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沉淀物之顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。

勿將血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會(huì)因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)第37頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin)造成，這些凝絮沉淀物不會(huì)影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沉淀物，可用離心3000rpm,5min去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾。不建議用過(guò)濾步驟去除這些凝絮沉淀物，因?yàn)闀?huì)阻塞過(guò)濾膜。

顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過(guò)熱處理之血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”，常會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37℃中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37℃環(huán)境下，又會(huì)使此沉淀物增多，更會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測(cè)，又沒(méi)有污染。一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影響細(xì)胞之生長(zhǎng)，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號(hào)的血清。

血清沉淀物

第38頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天如何避免沉淀物的產(chǎn)生?

解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。

解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

請(qǐng)勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無(wú)須做此步驟。

若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。第39頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天谷氨酰胺谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時(shí)，要重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，以便臨時(shí)加入培養(yǎng)液內(nèi)使用終濃度為1-4mM一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mM（29.22g/L）配制方法為：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫30℃），過(guò)濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入0.5-2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mM第40頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天酚紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH指示紅色表示中性pH黃色代表酸性pH紫色表示堿性pH在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅因?yàn)橐延幸恍┭芯勘砻鳎悍蛹t能模擬類(lèi)固醇激素（尤其是雌激素）樣作用第41頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無(wú)Ca2+、Mg2+的緩沖液

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20

加水至1000ml

細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制第42頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定第43頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100單位／毫升第44頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的配制RPMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.0g

青、鏈霉素各100單位／毫升

加三蒸水至1000ml,過(guò)濾除菌。

調(diào)節(jié)pH值至7.2

加血清（終濃度10％）

第45頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞消化液分離組織和分散細(xì)胞常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液，單獨(dú)或混合使用胰蛋白酶溶液主要作用：使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散消化細(xì)胞時(shí)，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用EDTA·4Na溶液一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價(jià)格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。

注意：使用EDTA處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)第46頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞換液與傳代細(xì)胞凍存與復(fù)蘇第47頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個(gè)孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺(tái)。用消過(guò)毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開(kāi)皮膚，剖腹取出子宮置于無(wú)菌平皿中。用消過(guò)毒的剪刀剪開(kāi)子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污切割：用平衡鹽溶液將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清消化、接種培養(yǎng)：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），與組織塊混勻。置37℃水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動(dòng)一下試管），靜止，吸去上清，加入5～10ml細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)第48頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天第49頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天換液：全量換液和半量換液換液時(shí)機(jī)的選擇：培養(yǎng)液pH值：細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)積累增多，pH值下降，營(yíng)養(yǎng)液酸化變黃，。細(xì)胞狀態(tài)細(xì)胞換液第50頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞傳代原代細(xì)胞傳代以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株細(xì)胞系傳代以得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)接觸抑制營(yíng)養(yǎng)枯竭將培養(yǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)器皿中消化下來(lái)，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的器皿中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同，在一代中，細(xì)胞培增3～6次第51頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞傳代方法

根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種。1.懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類(lèi)細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。3貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。第52頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法：1.吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2.加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置2-10min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。3.吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4.用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。5.加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。6.將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第53頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。第54頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。第55頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞凍存冷凍保存要點(diǎn)冷凍過(guò)程要緩慢：4℃30－60分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時(shí)（或過(guò)夜）→液氮長(zhǎng)期保存或使用程序降溫盒，每秒下降1℃凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力大于90％，無(wú)微生物污染。細(xì)胞濃度控制在：5x106－2x107/ml。常用細(xì)胞冷凍保存液5%或10％DMSO＋完全培養(yǎng)液10％甘油＋完全培養(yǎng)液第56頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。第57頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞凍存方法1預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基10%DMSO2取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉?用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106～5×106細(xì)胞/ml)3加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。4年后，存活率可達(dá)80％一90％。DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。第58頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞復(fù)蘇快速解凍凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過(guò)3分鐘）解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過(guò)離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中第59頁(yè),共63頁(yè)，2024年2月25日，星期天收到細(xì)胞的處理方式(一)

1.收到細(xì)胞株包裹時(shí)，請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請(qǐng)立即通知。細(xì)胞株請(qǐng)盡速開(kāi)始培養(yǎng)，或立即冷凍保存(置于–70°C，隔夜后，移到液氮)。

2.冷凍細(xì)胞解凍程序:

2.1.依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類(lèi)、血清種類(lèi)和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無(wú)法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類(lèi)，若因?qū)嶒?yàn)需要，必須有所不同時(shí)，務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細(xì)胞適應(yīng)后，方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)。

2.2.FBS(fetalbovineserum,胚牛血清),