附件1：廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)猴寄生蟲病防治技術(shù)規(guī)范》（征求意見稿）

Q/LB.□XXXXX-XXXX目次TOC\o"1-1"\h前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14診斷方法 25防治要求 36驅(qū)治方法 47監(jiān)測(cè) 48檔案管理 6附錄A（規(guī)范性）試劑的配制 7附錄B（資料性）腸道溶組織內(nèi)阿米巴特異性引物序列及檢測(cè)結(jié)果圖示 8附錄C（規(guī)范性）常用寄生蟲藥防治藥物及使用規(guī)定 10附錄D（規(guī)范性）操作規(guī)范 11參考文獻(xiàn) 12前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由本標(biāo)準(zhǔn)由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所。本文件主要起草人：謝永平、賀會(huì)利、馮世文、吳翠蘭、陶立、李軍、彭昊、鐘舒紅、馬春霞。實(shí)驗(yàn)猴寄生蟲病防治技術(shù)規(guī)范范圍本文件界定了實(shí)驗(yàn)猴寄生蟲病防治涉及的術(shù)語(yǔ)和定義，規(guī)定了人工馴繁養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)猴寄生蟲病的診斷方法、防治要求、驅(qū)治方法和監(jiān)測(cè)等內(nèi)容。本標(biāo)準(zhǔn)適用于廣西行政區(qū)域內(nèi)人工馴繁養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)猴寄生蟲病的防治。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18448.2-2008實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲檢測(cè)方法GB/T18448.7-2008實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘧原蟲檢測(cè)方法GB/T18448.9-2008實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道溶組織內(nèi)阿米巴檢測(cè)方法GB18596-2001畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)GB19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫NY/T1168-2006畜禽糞便無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)范NY/T1949-2010隱孢子蟲卵囊檢測(cè)技術(shù)改良抗酸染色法T/CALAS106-2021實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)腸小袋纖毛蟲核酸檢測(cè)方法術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

實(shí)驗(yàn)猴laboratorymonkey由人工飼育，對(duì)其攜帶的微生物進(jìn)行控制，遺傳背景明確或者來(lái)源清楚的，用于科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)、檢定以及其他科學(xué)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)猴主要包括食蟹猴和獼猴。

寄生蟲病parasitosis由動(dòng)物界包括原生動(dòng)物的各種寄生性的無(wú)脊椎物種（統(tǒng)稱寄生蟲）引起的疾病。

優(yōu)勢(shì)蟲種superiorityparasite在一定地區(qū)，某一種動(dòng)物所感染的寄生蟲蟲種當(dāng)中，感染分布廣、且危害嚴(yán)重的主要寄生蟲蟲種。

蠕蟲病helminthosis由吸蟲、絳蟲、線蟲、棘頭蟲引起的寄生蟲病。

原蟲病protozoosis由溶組織內(nèi)阿米巴、結(jié)腸小袋纖毛蟲、球蟲、隱孢子蟲等引起的寄生蟲病。

體外寄生蟲ectoparasite寄生于動(dòng)物體外并暫時(shí)性吸取營(yíng)養(yǎng)的寄生蟲。如螨、虱等。診斷方法直接涂片法在載玻片上滴加一滴生理鹽水，用竹簽挑取少許被檢實(shí)驗(yàn)猴新鮮糞便，或者用刀片刮下少許皮屑，將糞便或者皮屑在生理鹽水中涂抹均勻，置于光學(xué)顯微鏡下檢查，或解剖動(dòng)物后立即用接種環(huán)挑取新鮮小腸、盲腸、結(jié)腸內(nèi)容物或病變組織，分別與生理鹽水混合涂成薄而均勻的薄膜，蓋上蓋玻片后于顯微鏡下檢查。此方法適用于大多數(shù)蟲卵檢測(cè)。水洗沉淀法取被檢糞便10～15g于塑料杯中，加水20mL～30mL攪拌成混懸液，用60目銅篩過濾到100mL三角燒杯中，再加入適量蒸餾水充分?jǐn)嚢杌靹?，靜置15min，倒去上清液，向沉渣中再加入蒸餾水，調(diào)勻、靜置15min。重復(fù)3～4次，直至上層液變清。最后倒去上清液，取沉渣涂片鏡檢。此方法適用于大多數(shù)蟲卵檢測(cè)。盧氏碘液染色法取少許新鮮糞便或用吸管吸取4.2水洗沉淀法的量杯底部沉淀物1滴，加盧氏碘液工作液（按附錄A進(jìn)行）1滴，攪勻，蓋上蓋玻片后，在10×和40×光學(xué)顯微鏡下測(cè)量觀察。此方法適用于溶組織內(nèi)阿米巴、結(jié)腸小袋纖毛蟲、鞭毛蟲等原蟲檢測(cè)。飽和蔗糖漂浮離心法取被檢糞便5g～10g于塑料杯中，加入10mL～20mL自來(lái)水充分?jǐn)噭?，?jīng)過60目銅絲篩過濾，濾液裝入離心管中，3000rpm離心5min，棄上清，加入適量配置好的飽和蔗糖溶液（按附錄A進(jìn)行），充分?jǐn)嚢?，使下層沉淀和蔗糖液充分混勻?000rpm離心5min～10min。用鐵絲吊環(huán)蘸取表層液膜，涂于載玻片上，制片后于10×和40×光學(xué)顯微鏡下觀察、測(cè)量。此方法適用于隱孢子蟲、鞭蟲的檢測(cè)。蟲體濃集法取病料于試管內(nèi)，加入10％氫氧化鈉自熱浸泡過夜或加熱煮沸3min～5min，使皮屑溶解，蟲體沉淀管內(nèi)，靜置20min，棄上清，吸取沉淀，涂于載玻片上，在10×和40×光學(xué)顯微鏡下測(cè)量觀察。此方法適用于螨蟲檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法取待檢實(shí)新鮮糞便2.0g～5.0g，置滅菌燒杯充分?jǐn)噭?，稱取攪拌后的糞便樣本100mg～300mg至2mL離心管中，按糞便基因組DNA提取說明書提取模板DNA。按照LAMP擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒配制反應(yīng)體系，將已配制好、分裝完畢的反應(yīng)試管置于實(shí)時(shí)濁度儀(LA-320C，日本榮研公司)密閉進(jìn)行，濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增情況，反應(yīng)程序?yàn)?3℃保持60min，之后85℃滅活5min。儀器通過讀取反應(yīng)管的濁度值繪制濁度曲線，在陰陽(yáng)性對(duì)照成立的情況下，樣品反應(yīng)管出現(xiàn)濁度上升曲線的為可檢測(cè)出其目的基因，判為陽(yáng)性，反之為陰性。防治要求人員要求防控的技術(shù)人員要經(jīng)過相關(guān)的技術(shù)培訓(xùn)，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，每年體檢一次，做好人畜防護(hù)安全工作。設(shè)施、設(shè)備要求藥浴池要防滲漏，要求建在地勢(shì)較低處，并遠(yuǎn)離人畜飲水水源。藥浴、藥淋設(shè)備應(yīng)按操作要求使用。驅(qū)蟲前、浴前、淋前要求先進(jìn)行小群試驗(yàn)，確認(rèn)安全后方可大群驅(qū)蟲、藥浴或藥淋。引進(jìn)猴要求必須從外場(chǎng)引進(jìn)猴群時(shí)，要確認(rèn)產(chǎn)地為非疫區(qū)。引進(jìn)后隔離飼養(yǎng)45d以上，進(jìn)行觀察、檢疫、監(jiān)測(cè)，并進(jìn)行一次驅(qū)蟲，收集糞便進(jìn)行發(fā)酵處理。確認(rèn)為健康后方可與健康猴混群。藥物使用要求藥物配制、使用劑量和使用方法要嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。要嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行休藥期，對(duì)未規(guī)定休藥期的藥物，休藥期不應(yīng)少于28d。飼養(yǎng)管理要求幼猴與成年猴應(yīng)分開飼養(yǎng)，以減少感染機(jī)會(huì)。供給全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料，合理補(bǔ)充青料和必要的添加劑，增強(qiáng)猴只抵抗力。病猴應(yīng)及時(shí)隔離治療，嚴(yán)禁混群飼養(yǎng)，以防感染傳播。其他要求驅(qū)蟲過程中，應(yīng)跟蹤觀察，發(fā)現(xiàn)中毒、傷殘猴應(yīng)及時(shí)采取解毒等治療措施，具體治療措施按附錄D進(jìn)行。驅(qū)蟲藥物的選擇藥物的選擇和使用必須符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》、《中華人民共和國(guó)獸藥規(guī)范》、《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（第一冊(cè)）、（第二冊(cè)）、《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的相關(guān)規(guī)定。所用獸藥必須來(lái)自具有《獸藥生產(chǎn)許可證》和產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)的生產(chǎn)企業(yè)，或者具有《進(jìn)口獸藥許可證》的供應(yīng)商。所用獸藥的標(biāo)簽應(yīng)符合《獸藥管理?xiàng)l例》的規(guī)定。選用的藥物要符合高效、廣譜、安全、價(jià)廉、使用方便的原則。定期預(yù)防性驅(qū)蟲，要選擇對(duì)優(yōu)勢(shì)蟲種均有效的藥物，如一種藥物不能滿足要求，可以選擇2種或2種以上藥物同時(shí)使用，但要注意藥物配伍禁忌，盡量選擇長(zhǎng)效驅(qū)蟲藥制劑。圈舍滅蟲及廢棄物無(wú)害化處理圈舍滅蟲定期在空舍條件下，對(duì)圈舍墻壁、地面、圍欄、用具、飼喂工具等噴灑殺蟲藥，能進(jìn)行火焰消毒的耐高溫設(shè)施選用火焰消毒法，以殺滅圈舍內(nèi)的寄生蟲卵?？膳c投藥、藥浴、藥淋同步進(jìn)行對(duì)圈舍墻壁、地面、圍欄、用具、飼喂工具等噴灑殺蟲藥或火焰消毒，也可以根據(jù)發(fā)病情況或具體情況隨時(shí)進(jìn)行。廢棄物無(wú)害化處理圈舍內(nèi)糞便要及時(shí)清除，糞便集中堆積發(fā)酵處理，利用生物熱殺滅各種寄生蟲和蟲卵，達(dá)到消滅傳染源，保障人畜健康及環(huán)境安全。糞便處理應(yīng)符合NY/T1168的規(guī)定；污水處理符合GB18596的規(guī)定。病猴尸體及廢棄物按《病死及病害動(dòng)物無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)范》規(guī)定執(zhí)行，嚴(yán)禁將未經(jīng)處理的病猴尸體、廢棄物直接喂犬或隨地拋棄。驅(qū)治方法蠕蟲病采用高效驅(qū)蟲藥每年全群驅(qū)蟲，一年進(jìn)行三次，第一次在春季（3～4月），第二次在夏季（7～8月），氣溫較高，猴群在室外運(yùn)動(dòng)頻繁時(shí)期進(jìn)行，第三次在秋冬季（11～12月）。常用防治藥物及使用規(guī)定按附錄C進(jìn)行。原蟲病采用高效抗驅(qū)蟲藥每年全群驅(qū)蟲，一年進(jìn)行2～4次，春季（3～4月），秋季（9～10月），根據(jù)寄生蟲的流行情況適當(dāng)調(diào)整。常用防治藥物及使用規(guī)定按附錄C進(jìn)行。螨蟲病發(fā)現(xiàn)病猴后及時(shí)隔離治療，選擇長(zhǎng)效驅(qū)蟲藥，一年進(jìn)行三次，分別在1月、3月、10月進(jìn)行驅(qū)蟲，至少用藥2次，用藥間隔7d～8d。常用防治藥物及使用規(guī)定按附錄C進(jìn)行。監(jiān)測(cè)抽樣數(shù)量及比例猴群監(jiān)測(cè)（以猴群為單位），抽樣數(shù)量為猴數(shù)量的5％～10％,其中幼猴30％，種猴40％，青年（商品用）猴30％。對(duì)規(guī)模小于100只的猴群，抽樣數(shù)量不應(yīng)少于10只。監(jiān)測(cè)時(shí)間蠕蟲及原蟲在驅(qū)蟲前1周內(nèi)或驅(qū)蟲后7d～15d內(nèi)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)出售的商品猴群隨時(shí)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。螨蟲等體外寄生蟲在每年秋末春初，冬季高發(fā)季節(jié)監(jiān)測(cè)。監(jiān)測(cè)方法蠕蟲采用糞便檢查孕卵節(jié)片、幼蟲和蟲卵的方法，對(duì)病死猴可采用全身性蠕蟲學(xué)檢查法；原蟲采用直接直接涂片法、水洗沉淀法、盧氏碘液染色法、飽和蔗糖漂浮離心法等，其中溶組織內(nèi)阿米巴可采用溶組織內(nèi)阿米巴核酸檢測(cè)方法（見附錄B），結(jié)腸小袋纖毛蟲按T/CALAS106-2021進(jìn)行檢測(cè)，弓形蟲按照GB/T18448.2進(jìn)行檢測(cè)，瘧原蟲按照GB/T18448.7進(jìn)行檢測(cè)；體外寄生蟲采用直接檢查法、蟲體濃集法等。監(jiān)測(cè)指標(biāo)及計(jì)算方法防治（驅(qū)蟲）密度防治（驅(qū)蟲）密度按式（1）計(jì)算： M％=Q1Y1×100 式中：M—防治（驅(qū)蟲）密度；Q1—防治（驅(qū)蟲）猴數(shù)；Y1—猴群總數(shù)量。感染率感染率按式（2）計(jì)算： G％=Y2Y3×100 式中：G—感染率；Y2—感染某種蟲的猴數(shù)量；Y3—抽檢猴的數(shù)量。蟲卵（包囊）減少率蟲卵（包囊）減少率按式（3）計(jì)算： C％=Q2-Q3Q2×100 式中：C—蟲卵（包囊）減少率；Q2—驅(qū)蟲前每克糞便中的蟲卵（包囊）數(shù)；Q3—驅(qū)蟲后每克糞便中的蟲卵（包囊）數(shù)。蟲卵轉(zhuǎn)陰數(shù)蟲卵（包囊）轉(zhuǎn)陰數(shù)按式（4）計(jì)算： Y％=Y4Y3×100 式中：Y—蟲卵（包囊）轉(zhuǎn)陰率；Y3—抽檢猴的數(shù)量；Y4—轉(zhuǎn)陰猴的數(shù)量。監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)根據(jù)監(jiān)測(cè)指標(biāo)及計(jì)算結(jié)果，了解實(shí)驗(yàn)猴寄生蟲流行情況，指導(dǎo)驅(qū)蟲并對(duì)驅(qū)蟲效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。檔案管理建立防治檔案，檔案記錄內(nèi)容包括防治數(shù)量、用藥品種、使用劑量、環(huán)境與糞便無(wú)害化處理、發(fā)病率、病死率及死亡原因、診治情況等。

（規(guī)范性）

試劑的配制盧氏碘液儲(chǔ)存液配制方法按照GB/T18448.9-2001的規(guī)定進(jìn)行配制。盧氏碘液工作液配制方法取A.1儲(chǔ)存液5mL，加入20mL生理鹽水，混勻后儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶中，隨用隨取。飽和蔗糖溶液配制方法按照NY/T1949-2010中附錄A的規(guī)定進(jìn)行配制。

（資料性）

腸道溶組織內(nèi)阿米巴特異性引物序列及檢測(cè)結(jié)果圖示溶組織內(nèi)阿米巴引物擴(kuò)增的目的基因16SrRNA基因溶組織內(nèi)阿米巴外引物amb-F3：GGCGCGTAAATTACCCAAamb-B3：GCGTTTTAATCACAACAACTT溶組織內(nèi)阿米巴內(nèi)引物amb-FIP：CCTTCAAGACATGCTTACGCACCAACAGATAGAAGAGGTAGTGACamb-BIP：GAGTAAGAAGCAAAGAGTCTTACGATTGGAGCTGGAATTACCG溶組織內(nèi)阿米巴環(huán)引物L(fēng)B:AATCAATTGGAGGGCAAGTCTG試劑無(wú)Rnase去離子水的配制去離子水加入0.1％的DEPC(焦碳酸二乙酯)混合均勻，室溫靜置過夜，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。糞便基因組DNA試劑盒用于糞便基因組DNA的提取試劑（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供），或其他等效產(chǎn)品。Loopamp?擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒Loopamp?擴(kuò)增反應(yīng)試劑（榮研生物科技（中國(guó)）有限公司提供），或其他等效產(chǎn)品。陽(yáng)性對(duì)照用限制性內(nèi)切酶HindⅢ消化λ噬菌體DNA后，取其片段（6.557bp）重組入質(zhì)粒所得。陰性對(duì)照陰性對(duì)照使用滅菌去離子水。操作程序待檢樣品DNA提取將糞便樣本稱取100mg～300mg至2mL離心管中，按糞便基因組DNA提取說明書提取模板DNA，獲得50μLDNA。所提取的模板DNA，直接放入PCR管中進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)或置-20℃保存?zhèn)溆谩AMP樣品反應(yīng)體系配制LAMP樣品反應(yīng)體系2×反應(yīng)緩沖液12.5μLBstDNA聚合酶1μLamb-F35pmolamb-B35pmolLB20pmolamb-FIP40pmolamb-BIP40pmol去離子水（DW）補(bǔ)足23μL。分裝后，放入微量離心機(jī)中離心數(shù)秒（瞬時(shí)離心），以此作為預(yù)混溶液，配制好的預(yù)混溶液立即使用。對(duì)照反應(yīng)體系2×反應(yīng)緩沖液12.5μL引物溶液DNA2.5μLBstDNA聚合酶1μL去離子水（DW）補(bǔ)足23μL。預(yù)混溶液與樣本溶液混合添加樣本溶液（溶組織內(nèi)阿米巴DNA）2μL，使總量達(dá)到25μL，對(duì)照反應(yīng)中，陰性對(duì)照使用去離子水2μL，陽(yáng)性對(duì)照使用陽(yáng)性對(duì)照DNA2μL，合上蓋子輕擊使溶液充分混勻后瞬時(shí)離心。上機(jī)檢測(cè)將已配制好、分裝完畢的反應(yīng)試管置于實(shí)時(shí)濁度儀(LA-320C，日本榮研公司)密閉進(jìn)行，濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增情況，反應(yīng)程序?yàn)?3℃保持60min，之后85℃滅活5min。結(jié)果判定實(shí)時(shí)濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)擴(kuò)增情況，儀器通過讀取反應(yīng)管的濁度值繪制濁度曲線，在陰陽(yáng)性對(duì)照成立的情況下，樣品反應(yīng)管出現(xiàn)濁度上升曲線的為陽(yáng)性結(jié)果，沒有出現(xiàn)濁度上升曲線的為陰性結(jié)果(見圖B.1)LAMP檢測(cè)結(jié)果圖示LAMP檢測(cè)結(jié)果見圖B.1。圖B.1腸道溶組織內(nèi)阿米巴LAMP檢測(cè)結(jié)果圖

（規(guī)范性）

常用寄生蟲藥防治藥物及使用規(guī)定表C.1給出了常用寄生蟲藥防治藥物及使用規(guī)定。常用寄生蟲藥防治藥物及使用規(guī)定寄生蟲病名稱選擇的藥物名稱制劑用法與用量吸蟲病絳蟲病吡喹酮praziquantelum片劑內(nèi)服，一次量，（5～10）mg/kg體重丙硫苯咪唑albendazole片劑內(nèi)服，一次量，（3～5）mg/kg體重線蟲病伊維菌素ivermectin片劑內(nèi)服，一次量，0.2mg/kg體重注射液皮下注射，一次量，0.2mg/kg體重丙硫苯咪唑albendazole片劑內(nèi)服，一次量，（3～5）mg/kg體重溶組織內(nèi)阿米巴病結(jié)腸小袋纖毛蟲病瘧原蟲病甲硝噠唑metronidazole片劑內(nèi)服，一次量，（25～35）mg/kg體重。連用5～10d?；虬凑照f明書使用氯喹vioform片劑內(nèi)服，一次量，5mg/kg體重，連用14d。或按照說明書使用青蒿素（artemisinin）中藥方制內(nèi)服，一次量，（5～10）g，連用（5～10）d?；虬凑照f明書使用球蟲病隱孢子蟲病氨丙啉amprolium粉劑內(nèi)服，一次量，（10～20）mg/kg體重，連用（5～10）d?；虬凑照f明書使用艾草wormwood中藥方制內(nèi)服，一次量，（5～10）g，連用（5～10）d。或按照說明書使用螨蟲病虱病伊維菌素ivermectin片劑內(nèi)服，一次量，0.2mg/kg體重注射液皮下注射，一次量，0.2mg/kg體重溴氰菊酯decamethrin溶液藥浴、噴淋，（5～8）mg/L二嗪農(nóng)dimpylate溶液藥浴，初浴濃度為100mg/L,補(bǔ)充液濃度為300mg/L解毒藥阿托品atropine注射液皮下注射，中度中毒，每次（0.5～1）mg，隔（30～60）min1次；對(duì)嚴(yán)重中毒，每次靜注（1～2）mg，隔（15～30）min一次，至病情穩(wěn)定后，逐漸減量。消毒藥石灰Calx粉劑配成10％～20％乳劑噴灑或者干撒二氧化氯ChlorineDioxide片劑噴灑，配成（20～50）mg/L水溶液

（規(guī)范性）

操作規(guī)范檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施采樣和制樣過程采樣和制樣工具，應(yīng)清洗干凈，121℃，15min～20min滅菌，一套清潔工具僅限于一個(gè)樣品使用。存放樣品的容器應(yīng)該經(jīng)過清洗、滅菌，或?yàn)闇缇淮涡匀萜?。檢測(cè)過程PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分出試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品制備區(qū)、產(chǎn)