胚胎工程實驗技術

關于胚胎工程實驗技術

指對動物早期胚胎或配子所進行的多種顯微操作和處理技術。包括體外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干細胞培養(yǎng)等技術。即各種胚胎操作技術。研究對象：胚胎工程：主要是高等脊椎動物，尤其是哺乳動物研究水平：細胞水平定義：操作對象：早期胚胎或配子第2頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第2節(jié)胚胎工程實驗技術第3頁,共52頁，2024年2月25日，星期天一、人工授精和胚胎體外培養(yǎng)（一）人工授精：1、精子的獲取2、卵細胞的獲取3、體外授精第4頁,共52頁，2024年2月25日，星期天（一）人工授精：1、精子的獲?。孩倏刹杉课唬翰G丸、附睪、射出的精子及雌性生殖道內(nèi)。②方法：常用人工采集的方式采集精液。③精液的保存：低溫保存第5頁,共52頁，2024年2月25日，星期天（一）人工授精：2、卵細胞的獲?。孩倏刹杉课唬郝殉病⑤斅压?、子宮卵母細胞②方法：手術法：非手術法：中小型動物，如鼠、兔、羊大型動物，如牛超數(shù)排卵沖洗輸卵管采卵子宮沖卵第6頁,共52頁，2024年2月25日，星期天超排卵技術

利用促性腺激素處理，使得卵巢中有更多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出，這個過程就稱為超數(shù)排卵。第7頁,共52頁，2024年2月25日，星期天超數(shù)排卵定義：指人為注射外源性促性腺激素，促使卵巢排出更多成熟卵細胞。下丘腦促性腺激素釋放激素垂體促性腺激素卵巢排卵第8頁,共52頁，2024年2月25日，星期天卵細胞發(fā)生的激素調(diào)節(jié)垂體促卵泡刺激素（FSH）促黃體生成激素（LH）促進卵泡細胞生長發(fā)育促進卵泡細胞釋放更多雌激素促進卵泡生長下丘腦促性腺激素釋放激素釋放卵細胞卵巢第9頁,共52頁，2024年2月25日，星期天（一）人工授精：3、體外授精：獲取的卵細胞培養(yǎng)液MⅡ中卵母細胞獲取的精液精子精漿離心分離精子獲能培養(yǎng)獲能的精子培養(yǎng)液法顯微注射法受精卵第10頁,共52頁，2024年2月25日，星期天一、人工授精和胚胎體外培養(yǎng)（二）體外培養(yǎng)受精卵發(fā)育培養(yǎng)液由于不同時期的胚胎生理代謝不同，故需配置一系列含有不同成分的培養(yǎng)液（CO2、O2、AA、核苷酸、無機鹽、能源物質、維生素、激素、動物血清等。）早期胚胎冷凍保存植入受體第11頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

胚胎體外培養(yǎng)是胚胎工程的核心技術，但是由于哺乳動物胚胎發(fā)育條件異常復雜，因此，只能培養(yǎng)不同階段的胚胎，目前還無從受精卵培養(yǎng)到新生兒的全體外培養(yǎng)。第12頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

指將雌性動物體內(nèi)的早期胚胎，或者通過體外受精及其他方式獲得的胚胎，移植到同種的、生理狀態(tài)相同的其他雌性動物體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育為新個體的技術。二、胚胎移植技術1、定義：第13頁,共52頁，2024年2月25日，星期天1、定義：良種雌性動物體內(nèi)的早期胚胎體外授精或其他方式獲得的胚胎（超數(shù)排卵獲得多個胚胎）植入其他雌性動物供體發(fā)育個體受體二、胚胎移植技術條件：生產(chǎn)價值高、性狀優(yōu)良條件：同種、同期發(fā)情、健康胚胎來源第14頁,共52頁，2024年2月25日，星期天胚胎的來源：雌性動物的早期胚胎或體外受精及其他方式得到的胚胎。供體：提供胚胎的個體。受體：接受胚胎的個體。受體的條件：同種、生理狀態(tài)相同。第15頁,共52頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)體內(nèi)授精超數(shù)排卵2、胚胎的來源：二、胚胎移植技術體外授精供體多個卵細胞多個早期胚胎取出手術法非手術法多個受精卵早期胚胎第16頁,共52頁，2024年2月25日，星期天3、胚胎植入：二、胚胎移植技術手術法：非手術法：取出輸卵管和子宮，注入胚胎通過一定的器械，注入胚胎第17頁,共52頁，2024年2月25日，星期天（7）胚胎的移植方法一：手術法具體做法：引出受體子宮和卵巢，將胚胎注入子宮角，縫合創(chuàng)口。方法二：非手術法將裝有胚胎的移植管送入受體母牛子宮的相應部位，注入胚胎。第18頁,共52頁，2024年2月25日，星期天4、基本程序：以牛為例第19頁,共52頁，2024年2月25日，星期天供體母牛良種公牛受體母牛同期發(fā)情處理超數(shù)排卵精子受精卵早期胚胎收集胚胎沖胚發(fā)育檢測健康胚胎胚胎移植保存手術法非手術法分娩胚胎移植后代體內(nèi)授精多個卵細胞第20頁,共52頁，2024年2月25日，星期天良種母牛卵母細胞的體外培養(yǎng)良種公牛精子體外獲能體外受精良種牛體外受精胚胎胚胎移植受體牛良種犢牛成熟期牛屠宰加工廠市場采集卵巢中的卵母細胞“試管?！惫S化生產(chǎn)的技術流程圖超數(shù)排卵有性生殖第21頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

試管動物與克隆動物相比生殖方式：技術手段：有性生殖核移植技術、胚胎移植體外受精胚胎移植無性生殖第22頁,共52頁，2024年2月25日，星期天5、胚胎移植的現(xiàn)狀和意義1)保持供體優(yōu)良特性(加速育種工作和品種改良)2)節(jié)約成本\費用(大量節(jié)省購買種畜的費用)；3)大規(guī)模繁殖(一胎多產(chǎn))；4)

保存品種資源和保護瀕危物種；5)充分發(fā)揮雌性個體的繁殖潛力,縮短供體本身的繁殖周期。第23頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第24頁,共52頁，2024年2月25日，星期天三、胚胎分割優(yōu)勢:可成倍增加胚胎數(shù)量，可以快速繁殖良種畜。概念:將早期胚胎切割成2等份，4等份或8等份等，經(jīng)移植獲得同卵雙胎或多胎的技術。第25頁,共52頁，2024年2月25日，星期天一）胚胎分割技術研究概況

胚胎分割技術開始于Nicholas（1942）對大鼠2-細胞卵裂球的分離和培養(yǎng)。其后，Tarkowski等研究了小鼠1/4,2/4,3/4卵裂球的發(fā)展規(guī)律,得到了世界上首例半胚來源的活體動物。20世紀70年代以來,隨著胚胎培養(yǎng)及移植技術的發(fā)展和提高,哺乳動物胚胎分割技術取得了突破性進展。目前胚胎分割的研究方向也正向著簡單化和實用化發(fā)展。我國1986年張涌等首次利用胚胎分割方法獲得同卵雙生小鼠，1987年又獲得同卵雙生山羊。1986年竇忠英等獲得分割胚牛犢，1990年又獲得奶牛四分胚后代。1987年譚麗玲等獲得同卵雙生犢。第26頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共52頁，2024年2月25日，星期天特點：

后代具有相同的遺傳物質，克隆選擇的胚胎：發(fā)育良好的，形態(tài)正常的桑椹胚或囊胚使用的主要儀器：

體視顯微鏡、顯微操作儀、切割刀、切割針注意:

將內(nèi)細胞團均等分裂第28頁,共52頁，2024年2月25日，星期天二）胚胎分割的基本程序切割器具的準備；胚胎的預處理；胚胎的分割；分割胚的培養(yǎng)；分割胚的移植；第29頁,共52頁，2024年2月25日，星期天1.切割器具體視顯微鏡；顯微操作儀；胚胎固定管；胚胎分割針；第30頁,共52頁，2024年2月25日，星期天2.胚胎的預處理用鏈霉蛋白酶處理鏈霉蛋白酶的作用：使透明帶軟化、變薄或去除第31頁,共52頁，2024年2月25日，星期天3.胚胎的分割方法酶解法：用鏈霉蛋白酶處理機械法：用分割針切開透明帶第32頁,共52頁，2024年2月25日，星期天胚胎分割的基本操作選擇良好的桑椹胚或囊胚移入培養(yǎng)皿中，用分割針或分割刀片將其切開，吸出其中的半個胚胎注入透明帶中或直接移植給受體。第33頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共52頁，2024年2月25日，星期天4.分割胚的培養(yǎng)；

原因：早期胚胎切割后發(fā)育能力低，一般是經(jīng)包埋后移植到中間受體的輸卵管中培養(yǎng)幾天至囊胚，再從輸卵管中回收胚胎，最后移植給受體。方法：體外培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)（需瓊脂包埋）第35頁,共52頁，2024年2月25日，星期天瓊脂包埋的作用固定胚胎便于回收第36頁,共52頁，2024年2月25日，星期天分割胚的移植要求：胚胎分割后可以直接移植給受體，也可以進行超低溫冷凍保存。為提高冷凍胚胎移植后的受胎率，分割的胚胎需要在體內(nèi)或體外培養(yǎng)到桑椹或囊胚階段，再進行冷凍。第37頁,共52頁，2024年2月25日，星期天受精卵分裂

早期胚胎胚胎分割基本過程代孕母牛植入植入分割第38頁,共52頁，2024年2月25日，星期天胚胎分割的基本過程胚胎移入培養(yǎng)液分割胚胎（機械法、酶處理）移植胚胎給受體著床產(chǎn)仔第39頁,共52頁，2024年2月25日，星期天三）胚胎分割技術的應用應用：在畜牧方面：擴大優(yōu)良家畜的數(shù)量在研究方面：培養(yǎng)遺傳特性相同的實驗動物性別鑒定存在問題：如：早期胚胎細胞的分化和定位的發(fā)育機制不同階段胚胎細胞的分化時間和發(fā)育潛力第40頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共52頁，2024年2月25日，星期天四、胚胎干細胞核移植技術1.概念：（胚胎干細胞）：簡稱ES或EK細胞，是由早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細胞。第42頁,共52頁，2024年2月25日，星期天2.特點:1)形態(tài)：體積小、細胞核大、核仁明顯。

2)功能：具有發(fā)育的全能性；是一種高度未分化的細胞，可分化為成年動物體內(nèi)任何一種組織和器官。

3）應用：在體外培養(yǎng)的條件下，可以增殖而不發(fā)生分化；對它可以進行冷凍保存，也可以進行遺傳改造。3.主要用途：

(1)治療人類的某些頑癥

(2)培育出人造組織器官，用于器官移植

(3)是研究體外細胞分化的理想材料第43頁,共52頁，2024年2月25日，星期天1.飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)體系的建立飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的構成胚胎成纖維細胞作用：抑制細胞分化成纖維細胞（fibroblast）：是疏松結締組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質細胞(mesenchymalcell)分化而來。細胞較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構，細胞核卵圓形，核仁大而明顯。細胞功能活動旺盛，細胞質弱嗜堿性，具明顯的蛋白質合成和分泌活動。成纖維細胞對不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損以及骨創(chuàng)傷的修復有著十分重要的作用。飼養(yǎng)層細胞（feederlayer）：在正常機體內(nèi)，細胞除了獲得一些血液來的營養(yǎng)外，還在細胞與細胞之間互換特殊的物質，用于分裂分化和營養(yǎng)等。因而，在細胞體外培養(yǎng)中，除了正常的培養(yǎng)基外，先培養(yǎng)一層特殊的細胞，然后再在其上接種要實驗的細胞，這樣更能模擬體內(nèi)環(huán)境。這些特殊的細胞就是飼養(yǎng)層細胞，通常是成纖維類細胞，這些細胞可以提供實驗細胞更好的營養(yǎng)，有的分化研究則是必須有飼養(yǎng)層細胞。

第44頁,共52頁，2024年2月25日，星期天2.胚胎干細胞的獲得時期：囊胚或囊胚期以前如小鼠：桑椹胚、囊胚人體：囊胚、原始生殖細胞培養(yǎng)：置于含飼養(yǎng)層的培養(yǎng)液中培養(yǎng)方法：原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)的作用：抑制胚胎干細胞分化第45頁,共52頁，2024年2月25日，星期天一）胚胎干細胞核移植程序飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)體系的建