具有不對稱膜囊泡用于高效多肽藥物的釋放分析研究 功能材料專業(yè)

目錄TOC\h\z\u\t"標(biāo)題2,1,標(biāo)題3,2,標(biāo)題4,3"31194摘要 1307271.前言 2159981.1引言 2289441.2聚合物囊泡的組成 3114271.3聚合物囊泡的制備方法和載藥機(jī)理 442231.4課題提出 4122572.實(shí)驗(yàn)部分 512302.1材料與試劑 5289262.2儀器與表征 579312.3聚合物囊泡包載LTX-315(PS-LTX-315)制備條件的篩選 5253542.3.1制備納米粒與靜置交聯(lián)時的轉(zhuǎn)速篩選 5316732.3.2溶液pH的篩選 6220892.3.3理論載藥量的篩選 679802.3.4納米粒在FBS條件下的穩(wěn)定性和稀釋穩(wěn)定性（納米粒濃度是20ug/ml）以及GSH條件下的響應(yīng)性 7101062.3.5A6修飾包載LTX-315囊泡（A6-PS-LTX-315)的制備 7244782.4細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT實(shí)驗(yàn)） 756873.結(jié)果與討論 878883.1聚合物囊泡包載多肽藥LTX-315的制備條件的篩選 8254793.1.1制備納米粒以及搖床中靜置交聯(lián)轉(zhuǎn)速的篩選 837913.1.2溶液pH的篩選 1086683.1.3理論載藥量的篩選 13262323.1.4納米粒在FBS條件下的穩(wěn)定性和稀釋穩(wěn)定性（納米粒濃度是20ug/ml）以及GSH條件下的響應(yīng)性 15107623.1.5A6修飾的載LTX-315的囊泡（A6-PS-LTX-315)的制備 16192143.2A6-PS-LTX-315的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT實(shí)驗(yàn)） 1712844.結(jié)論 188079參考文獻(xiàn) 2022617致謝 21

具有不對稱膜囊泡用于高效裝載多肽藥物摘要生物藥物相比化療藥物具有更低的毒副作用和廣闊的發(fā)展前景。但這類藥物容易被蛋白酶降解，生物利用率降低，腫瘤的穿透能力也差，使其發(fā)展受到阻礙。為了解決這個問題，我們基于實(shí)驗(yàn)室所特有的DTC平臺技術(shù)，設(shè)計(jì)了具有不對稱膜結(jié)構(gòu)的囊泡mPEG-P(TMC-co-DTC)-KD10，該囊泡親水內(nèi)膜由帶負(fù)電的天冬氨酸組成。通過溶液置換法制備得到載陽離子抗菌肽LTX-315的囊泡。為了增強(qiáng)納米囊泡的腫瘤特異性，我們在PEG的末端修飾了靶向配體A6，從而形成高效裝載多肽藥物的自交聯(lián)穩(wěn)定的靶向囊泡。本文研究了溶液pH、攪拌轉(zhuǎn)速、理論載藥量以及靶向聚合物配比等條件對藥物包載的影響，針對多肽藥物的載藥量、囊泡粒徑及其分布情況篩選出最佳條件。此外，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A6修飾的載藥囊泡比無靶向囊泡在殺死B16F10黑色素瘤細(xì)胞上表現(xiàn)出更優(yōu)異的殺傷效果。關(guān)鍵詞：不對稱膜囊泡；陽離子抗菌肽；LTX-315；細(xì)胞毒性AbstractBiologicaldrugsareadvantageouscomparedtochemodrugsowingtotheirlowsideeffectsandhighspecificity,showinghighpotentialforcancertherapy.However,thesedrugscanbeeasilydegradedbyenzymesinvivo,havepoorpenetrationabilityandlowbioavailability,whichhindertheirfurtherdevelopment.Inordertosolvetheproblems,basedonDTCtechnologyplatformwedesignedandsynthetizedchimaericpolymersomesfromcopolymerPEG-P(TMC-co-DTC)-KD10,inwhichnegativelychargedpolyasparticacidformstheinnershell.Duringtheformationofpolymersomes,cationicantimicrobialpeptideLTX-315wasencapsulatedinsidethepolymersomes.Toenhancetumorspecificity,tumortargetingligandA6peptidewasanchoredonthepolymersomesurfacetoformLTX-315loaded,self-crosslinkedstablepolymersomes.Inthisthesis,theeffectofpH,agitationspeed,drugloadinginfeedandtargetingpolymercontentonthefinaldrugloadingcontent(DLC)wasstudied.ThebestconditionswerescreenedoutforDLC,sizeanddistributionofpolymersomes.Inaddition,MTTassayresultsdisplayedthatA6modifiedLTX-315loadedpolymersomesshowedsuperiorcytotoxicityonB16F10melanomacellstonon-targetedpolymersomes.Keywords:Chimearicpolymersomes,Cationicantimicrobialpeptide,LTX-315,Cytotoxicity1.前言1.1引言近年來，惡性腫瘤對人類的威脅日趨嚴(yán)峻，對社會經(jīng)濟(jì)也產(chǎn)生巨大的影響。手術(shù)、放療與化療是現(xiàn)階段臨床上治療癌癥的主要方法。[1]化療藥物雖應(yīng)用廣泛，能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長，卻無法選擇性識別腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞，產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用。此外，在治療過程中腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，也會大大限制了化療藥物在癌癥治療中的作用。相比于傳統(tǒng)的化療藥物，生物藥物如蛋白質(zhì)、核酸、多肽藥物等因其具有更低的毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，受到研究者的青睞，多肽藥物與其他的生物藥相比，其結(jié)構(gòu)簡單，合成技術(shù)簡便。目前研究發(fā)現(xiàn)，許多生物陽離子活性肽（ACPS）具有抗癌活性，它們通過靜電作用與癌細(xì)胞膜相互作用或通過與細(xì)胞內(nèi)靶的相互作用殺死癌細(xì)胞。在這些生物活性肽中，LTX-315（(CKKWWKKW(Dip)K-NH2)一種9肽陽離子溶瘤肽表現(xiàn)出良好的抗癌活性和腫瘤治療能力[2]，它可以刺激抗癌免疫應(yīng)答，逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的耐藥性。它有潛力作為一種新型的抗癌藥物，而且目前正在處于臨床的I期/Ⅱ期研究[3]。然而多肽藥物在體內(nèi)很容易被生物蛋白酶降解，生物利用率比較低，腫瘤的穿透能力也比較差。為了克服這些缺點(diǎn)，使多肽藥物得到更好的應(yīng)用，納米藥物載體的優(yōu)越性能受到越來越多的關(guān)注與研究[4]。納米藥物載體包括聚合物膠束、脂質(zhì)體、納米凝膠、聚合物囊泡等。這些納米藥物載體的粒徑通常在20-200nm，這使得它們可以利用EPR效應(yīng)，有效地將抗癌藥物定向輸送到癌癥細(xì)胞[5]?？拱┧幬镆虼吮粍拥馗患谀[瘤組織中，并大大減小了毒副作用，降低對正常細(xì)胞的傷害。迄今為止，12種納米藥物已經(jīng)在臨床中投入使用，此外有1000多種納米藥物也正處于臨床試驗(yàn)的不同階段[6]。二十世紀(jì)后期，AdiEisenberg和DennisDischer教授研究并提出了聚合物囊泡的結(jié)構(gòu)，引發(fā)了人們對聚合物囊泡進(jìn)行了大量研究。尤其是它作為納米藥物載體的巨大潛力，正受到越來越多的關(guān)注。聚合物囊泡由兩親性聚合物在水溶液中自組裝形成，較于脂質(zhì)體擁有更好的穩(wěn)定性和機(jī)械性能，其親水內(nèi)腔適用于包裹各種親水性藥物。此外，聚合物的多樣性賦予了囊泡結(jié)構(gòu)不同的性能，例如生物可降解性、刺激響應(yīng)性以及體內(nèi)循環(huán)穩(wěn)定性等[7,8]。在囊泡表面修飾上腫瘤細(xì)胞特異性的靶向分子，可以使其在體內(nèi)循環(huán)時，通過配體-受體介導(dǎo)進(jìn)入靶向部位，于腫瘤組織中特異性聚集并釋放抗癌藥物，從而達(dá)到靶向治療的目的，減小對正常器官的傷害。目前，全球范圍的研究者們已經(jīng)在聚合物囊泡應(yīng)用于納米藥物方面取得了豐碩的成果，針對不同的需求，開發(fā)出了刺激響應(yīng)性囊泡、腫瘤主動靶向囊泡、循環(huán)穩(wěn)定的囊泡、生物可降解囊泡、具有不對稱膜型囊泡等眾多功能性囊泡，為囊泡納米藥物的臨床發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。1.2聚合物囊泡的組成結(jié)合LTX-315的親水性和帶正電的性質(zhì)，我們選取了聚合物囊泡作為這次畢業(yè)設(shè)計(jì)所用的納米載體。聚合物囊泡是由兩親性的聚合物在水溶液中自組裝而成的納米粒子，它具有可以包裹疏水藥物的疏水的雙分子膜層，和可以包載親水藥物的內(nèi)腔。調(diào)節(jié)聚合物親疏水鏈段的比例可形成不同結(jié)構(gòu)的自組裝體，例如薄層結(jié)構(gòu)、棒型膠束、球型膠束、管型囊泡和球型囊泡等。通常情況下，當(dāng)聚合物親水段占總分子量的20%~40%時，聚合物傾向于自組裝形成囊泡結(jié)構(gòu)[9]。不對稱膜囊泡區(qū)別于一般的囊泡結(jié)構(gòu)，它的內(nèi)外殼由不同的兩親性聚合物組成，較長的親水鏈傾向于排列在囊泡的外殼，而較短的親水鏈傾向于排列在囊泡的內(nèi)殼。利用這種特殊結(jié)構(gòu)，我們可以控制聚合物性質(zhì)和分子量來提高囊泡的載藥能力。在本論文中，基于我們課題組特有的DTC平臺技術(shù)載體，我們選用了內(nèi)膜由天冬氨酸修飾的聚合物載體來自組裝成一種不對稱膜囊泡，利用它帶負(fù)電的性質(zhì)包載LTX-315。1.3聚合物囊泡的制備方法和載藥機(jī)理實(shí)驗(yàn)室制備聚合物囊泡的主要方法有溶劑置換法、溶劑揮發(fā)法、電形成法、薄膜水化法和直接溶解法[10]。而最常用的方法是溶液置換法：先將聚合物溶于良溶劑中，例如DMF、DMSO；然后將聚合物溶液加入水相中，使兩親性的聚合物自發(fā)地組裝成囊泡；最后利用透析等方法將溶解聚合物的溶劑和未包載進(jìn)囊泡中的自由藥除去。聚合物囊泡載藥方法的選擇需要結(jié)合聚合物的性質(zhì)，所包載的藥物的性質(zhì)以及溶劑等外在條件。當(dāng)囊泡包載疏水藥物時，一般會利用疏水膜通過疏水相互作用將藥物進(jìn)行包載，例如我們課題組報(bào)道過的PEG-P(DTC-CL)聚合物包載紫杉醇。而囊泡包載親水藥物時，主要利用離子梯度法或靜電作用等。多肽藥物或帶有羧基或氨基的小分子抗癌藥物可以利用靜電或氫鍵作用包載在囊泡中。而不對稱膜囊泡結(jié)構(gòu)對這類藥物的包載效果具有優(yōu)異的特點(diǎn)，它不僅僅能提高這類藥物的載藥量，還能保護(hù)藥物免被機(jī)體過早清除[11]。我們課題組曾報(bào)道過這類囊泡PEG-P(TMC-DTC)-PEI對培美曲塞二鈉（PEM）[12]高效包載并產(chǎn)生了優(yōu)異的抗腫瘤活性。1.4課題提出聚合物囊泡因其可控的聚合物性質(zhì)與分子量，能產(chǎn)生更厚的疏水膜，可穩(wěn)定地裝載親水或疏水藥物，延長體內(nèi)循環(huán)時間，在腫瘤藥物的控制釋放上具有巨大的潛力。但在實(shí)際應(yīng)用時，囊泡的細(xì)胞選擇性差、包載率低、聚合物的生物不可降解以及囊泡在人體血液循環(huán)中的不穩(wěn)定等問題限制了囊泡納米藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。因此，制備更為優(yōu)質(zhì)穩(wěn)定的囊泡是本次設(shè)計(jì)的目標(biāo)。我們選取聚合物mPEG-P(TMC-co-DTC)-KD10來制備囊泡，在囊泡結(jié)構(gòu)中，PEG鏈段位于囊泡的外表面，憑借其鏈柔順性、優(yōu)異的生物可適性以及細(xì)胞和蛋白不易吸附等特點(diǎn)，大大延長了囊泡在生命體內(nèi)循環(huán)的時間。而在完全可生物降解的疏水段PTMC中引入含有二硫戊環(huán)的DTC，可使得聚合物載體自交聯(lián)形成穩(wěn)定囊泡并保持其在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性，在到達(dá)腫瘤部位后在腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH作用下能夠快速響應(yīng)并釋放藥物。最后由有天冬氨酸修飾的內(nèi)膜具有負(fù)電的載體可以通過靜電作用與帶有正電的LTX-315多肽藥很好地作用在一起，穩(wěn)定地對這種陽離子活性肽進(jìn)行包載。2.實(shí)驗(yàn)部分2.1材料與試劑所用聚合物mPEG-P(TMC-co-DTC)-KD10，A6-PEG-P(TMC-co-DTC)由周程師兄提供；LTX-315（98.49%，強(qiáng)耀生物）；谷胱甘肽（GSH，99%，Roche）；N-2羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（99%，阿拉丁）；以下試劑均從上海國藥有限公司購買后直接使用：二甲亞砜（DMSO），N,N-二甲基甲酰胺（DMF），二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O），十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O），氫氧化鈉（NaOH），透析袋（MWCO:3500Da，Spectrum），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，Sigma）。2.2儀器與表征囊泡粒徑和粒徑分布通過ZetasizerNano-ZS動態(tài)光散射儀（英國Malvern公司）測定，溫度為25℃，采用He/Ne激光光源和背折射檢測器，波長為633nm。聚合物囊泡的包封率和載藥量由UH5300雙光束分光光度計(jì)（日本HITACHI公司）進(jìn)行測定，使用紫外檢測器。美國ScientificIndustries生產(chǎn)的多用途旋渦混合器Vortex-Genie2,可調(diào)速度控制，能從低速振動到高速旋渦混合，將藥品混合均勻。2.3聚合物囊泡包載LTX-315(PS-LTX-315)制備條件的篩選2.3.1制備納米粒與靜置交聯(lián)時的轉(zhuǎn)速篩選將兩份100μL的mPEG-P(TMC-co-DTC)-KD10聚合物的DMSO溶液(10mg/mL)在37℃水浴下分別加入到靜置和轉(zhuǎn)速250rpm攪拌下的900μL的Hepes溶液中（10mM，pH6.8），然后將其放置在0rpm，37℃的搖床中靜置孵育一天。同時，將相同條件制備的兩種不同轉(zhuǎn)速的納米粒放入200rpm,37℃的搖床中孵育一天。次日用DLS觀察囊泡形成情況后將囊泡溶液放入透析袋（MWCO:3500Da）在Hepes緩沖溶液（10mM，pH7.4）中透析6h，每1h換一次透析介質(zhì)，即得聚合物囊泡，再對其進(jìn)行一次DLS測試。2.3.2溶液pH的篩選配制不同的Hepes緩沖溶液，用2M的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，分別得到pH分別為5.3，6.4與6.8的溶液。在37℃水浴中，將100μL聚合物溶液緩緩注入900μLpH5.3的Hepes緩沖溶液，并按照同樣的方法在pH6.4與6.8的溶液中操作。在水浴37℃條件下，將17.5μLLTX-315的水溶液（5mg/mL）注入900μLpH為5.3的Hepes溶液中，攪拌三分鐘后再將100μL聚合物溶液緩緩注入，完成載藥，并按照同樣的操作，完成pH6.4與6.8條件下的載藥。將上述的六個樣品用DLS測試觀察后放入0rpm，37℃搖床靜止一天。次日透析處理后再進(jìn)行一次DLS測試，觀察得到的囊泡。配置20，40，60，80，100和120mg/mL的多肽藥溶液，以水作為背景，用紫外分光光度計(jì)測得標(biāo)曲。然后以制備的聚合物囊泡空殼作為背景，對載藥的樣品進(jìn)行測試，從而計(jì)算得到實(shí)際的包封率和載藥量。2.3.3理論載藥量的篩選分別取10.5μL、22.2μL以及35.2μL的LTX-315（5mg/mL）溶液按照之前的方法，在pH6.8的Hepes溶液中制備納米粒，得到理論載藥量分別為5%，10%與15%的囊泡，在透析前后進(jìn)行DLS測試，透析完成后進(jìn)行紫外的測試得到實(shí)際的包封率和載藥量。2.3.4納米粒在FBS條件下的穩(wěn)定性和稀釋穩(wěn)定性（納米粒濃度是20ug/ml）以及GSH條件下的響應(yīng)性將900μL透析后的15%載藥量的PS-LTX-315囊泡中加入100μLFBS，混合均勻后在200rpm,37℃的搖床中放置24h，次日對其進(jìn)行DLS測試。另取20μL透析后15%載藥量的PS-LTX-315囊泡加入980μLHepes緩沖溶液使囊泡稀釋至20μg/mL，靜置半小時后進(jìn)行DLS測試。最后在N2保護(hù)下在1mL15%載藥量的PS-LTX-315囊泡中加入3.04mgGSH，溶解后在37℃搖床中靜置12h后DLS測試。另外，測試時需要一組15%載藥量透析后的PS-LTX-315囊泡作為對照組。2.3.5A6修飾包載LTX-315囊泡（A6-PS-LTX-315)的制備A6-PS-LTX-315通過靜電吸附法制備。簡要概述為，將100μL（10mg/mL）按照預(yù)定比例（3/7，mol/mol）混合的A6-PEG-P(TMC-co-DTC)和PEG-P(TMC-co-DTC)-KD10的DMSO溶液，勻速的加入到含有LTX-315多肽藥的Hepes緩沖溶液（10mM，pH6.8)中形成囊泡。孵育20h后，在Hepes緩沖溶劑中透析以除去有機(jī)溶劑和游離藥物，即為載藥交聯(lián)囊泡XA6-PS-LTX-315，X表示混合聚合物中A6-PEG-P(TMC-co-DTC)的摩爾分?jǐn)?shù)，無A6的非靶向囊泡為PS-LTX-315。2.4細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT實(shí)驗(yàn)）將80μL的B16F10細(xì)胞懸浮液以2×103/孔的密度鋪于96孔板中孵育24h，加入設(shè)定濃度的30%A6-PS-LTX-315和PS-LTX-315（最終孔內(nèi)LTX-315濃度為0.1-80μg/mL）。在培養(yǎng)箱連續(xù)孵育60h后，每孔加入10μL的MTT溶液（5mg/mL）。培養(yǎng)4h后，吸走培養(yǎng)基，加入150μL的DMSO將活細(xì)胞與MTT作用形成的紫色甲瓚結(jié)晶溶解。然后通過酶標(biāo)儀測得每孔在570nm處的紫外吸光度值。每組設(shè)置5個復(fù)孔。細(xì)胞存活率是比較各孔在570nm處的紫外吸光度和只用PBS處理的對照細(xì)胞的570nm的吸光度而得到。3.結(jié)果與討論3.1聚合物囊泡包載多肽藥LTX-315的制備條件的篩選本次畢業(yè)設(shè)計(jì)我們選用了聚合物mPEG-P(TMC-co-DTC)-KD10，以水溶性的陽離子多肽藥物L(fēng)TX-315為模型藥物，通過溶液置換法制備了包載LTX-315的不對稱膜囊泡，系統(tǒng)地研究了攪拌、溶液pH、靶向聚合物配比、理論載藥量等參數(shù)對囊泡的影響并以納米載體的粒徑及其分布、穩(wěn)定性、載藥量為標(biāo)準(zhǔn)篩選制備納米藥物載體的最佳條件。3.1.1制備納米粒以及搖床中靜置交聯(lián)轉(zhuǎn)速的篩選在水浴37℃中，聚合物mPEG-P(TMC-co-DTC)-KD10初始濃度10mg\ml，在靜止和攪拌條件下制備出囊泡空殼并在不同轉(zhuǎn)速搖床中靜置交聯(lián)24h，并對透析前后的納米粒粒徑和分布進(jìn)行DLS測試。投料比（%）攪拌速度（rpm）搖床速度（rpm）緩沖溶液pHSize(d.nm)PDISize(d.nm)PDI透析前透析后0006.432.80.0932.80.15025006.428.30.0828.30.14002006.433.10.1031.00.10表1納米粒在不同轉(zhuǎn)速條件下囊泡的粒徑及分布圖1不同轉(zhuǎn)速條件下透析前囊泡的粒徑分布圖圖2不同轉(zhuǎn)速條件下透析后的囊泡粒徑分布圖由上述數(shù)據(jù)分析可得，不同條件下得到的納米粒較為接近。但在靜置條件下制備囊泡可獲得相對更大的粒徑，這可能更有利于后續(xù)包載更多的多肽藥物。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作中，我們選取0rpm作為制備納米粒的攪拌轉(zhuǎn)速及搖床中靜置交聯(lián)轉(zhuǎn)速。3.1.2溶液pH的篩選在37℃水浴條件下，聚合物初始濃度10mg/mL，理論載藥量8%，制備出緩沖溶液pH為5.3，6.4以及6.8的囊泡空殼和載藥納米粒，在透析前后對其粒徑和分布進(jìn)行DLS測試。投料比（%）緩沖溶液pHSize(d/nm)PDISize(d/nm)PDI透析前透析后05.330.20.1931.60.1606.433.50.1734.30.2506.833.50.0933.70.1385.328.40.0740.00.3186.432.30.1239.50.3786.832.70.0928.30.12表2不同pH條件下囊泡空殼及載藥的粒徑及其分布圖3不同pH的緩沖溶液中制備的囊泡粒徑分布圖圖4不同pH條件下制備的囊泡空殼透析后的粒徑分布圖圖5不同pH的緩沖溶液中囊泡載藥后的粒徑分布圖圖6不同pH條件下囊泡載藥透析后的粒徑分布圖由表格中的數(shù)據(jù)可知，無論是空殼還是載藥的囊泡，pH為6.8的納米粒在粒徑分布上的表現(xiàn)都優(yōu)于另外兩者。尤其是載藥的囊泡中，pH為5.3和6.4的納米粒在透析后PDI變化極大，通過分布曲線可發(fā)現(xiàn)，這兩個樣品中的囊泡在透析后發(fā)生了團(tuán)聚，這是我們所不希望看到的。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們選取pH為6.8的Hepes緩沖溶液作為水相環(huán)境來制備納米粒子。3.1.3理論載藥量的篩選在37℃水浴及pH6.8的Hepes緩沖溶液中，制備理論載藥量分別為0%、5%、10%以及15%的囊泡在透析前后進(jìn)行DLS測試，透析完成后進(jìn)行紫外的測試得到實(shí)際的包封率和載藥量。表3不同載藥量的囊泡透析前后的粒徑及其包封率投料比（%）Size（d/nm）PDISize(d/nm)PDI透析前透析后包封率（%）029.50.0927.90.030529.10.1028.20.1397.51032.00.1029.50.1095.11535.00.1633.30.1692.6圖7不同載藥量的囊泡在透析之前的粒徑分布圖圖8不同載藥量囊泡在透析后的粒徑分布圖從包封率測試可知，15%的理論載藥量是可以達(dá)到的。此外，根據(jù)納米粒的粒徑和分布來看，15%載藥量的囊泡粒徑遠(yuǎn)大于5%和10%，雖然在2000nm處有吸收，但比例相對而言較小。囊泡粒徑隨載藥量從0%到15%不斷增大，10%的囊泡載藥量遠(yuǎn)未飽和。當(dāng)嘗試進(jìn)行20%載藥量的實(shí)驗(yàn)時，囊泡則直接發(fā)生了團(tuán)聚。以上說明我們選取的聚合物mPEG-P(TMC-co-DTC)-KD10可以用來制備15%載藥量的囊泡，且15%的載藥量接近于理論上的最大值。3.1.4納米粒在FBS條件下的穩(wěn)定性和稀釋穩(wěn)定性（納米粒濃度是20ug/ml）以及GSH條件下的響應(yīng)性分別制備含10%FBS，10mM/mLGSH和緩沖溶液稀釋50倍的PS-LTX-315，并用DLS測試觀察納米粒。將結(jié)果與PS-LTX-315的對照組相比，得到納米粒的穩(wěn)定性和響應(yīng)性結(jié)論。圖9納米粒在FBS條件下的穩(wěn)定性和稀釋穩(wěn)定性圖10納米粒在GSH條件下的響應(yīng)性從圖中我們可以知道，在10%的FBS條件下，納米?？梢苑€(wěn)定的存在，10nm左右的粒子應(yīng)該是FBS里的蛋白質(zhì)。納米粒用PB稀釋50倍后（濃度是20ug/ml）也能穩(wěn)定存在，加入10mM谷胱甘肽GSH模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下，GSH觸發(fā)了DTC中二硫鍵斷裂，囊泡發(fā)生了解交聯(lián)。3.1.5A6修飾的載LTX-315的囊泡（A6-PS-LTX-315)的制備在37℃水浴條件下將100μL（10mg/mL）按照預(yù)定比例（30：70）混合的A6-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)-KD10的DMSO溶液滴加至含有LTX-315多肽藥的Hepes緩沖溶液（pH6.8)中形成囊泡。在透析前后進(jìn)行DLS測試，并在透析后用紫外分析測得其包封率。表4A6修飾囊泡的粒徑及包封率的對比樣品Size(d/nm)PDISize(d/nm)PDI透析前透析后包封率（%）0%A615%31535.00.1633.30.1692.630%A615%31549.20.1244.20.1464.7圖9A6聚合物修飾囊泡透析前后的粒徑分布圖經(jīng)A6修飾的A6-PS-LTX-315囊泡相比于無A6的囊泡能產(chǎn)生粒徑更大囊泡結(jié)構(gòu)，在粒徑的分布上也表現(xiàn)的更加優(yōu)異。雖然缺少了30%的PEG-P(TMC-DTC)-KD10包載LTX-315，但64.7%的包封率也還算是差強(qiáng)人意。除此之外，44.2nm左右的粒徑也有助于囊泡擁有更大的親水內(nèi)腔進(jìn)行藥物包載。3.2A6-PS-LTX-315的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT實(shí)驗(yàn)）經(jīng)過MTT實(shí)驗(yàn)，我們探究了A6-PS-LTX-315和PS-LTX-315對B16F10的毒性以及靶向性的抗癌效果。通過測定不同濃度下A6-PS-LTX-315對B16F10細(xì)胞的毒性，從而繪制曲線擬合計(jì)算出其半致死的濃度（IC50）為11.0μg/mL,遠(yuǎn)低于PS-LTX-315組的半致死濃度43.4μg/mL。因此可以得到結(jié)論，我們制備的A6-PS-LTX-315納米藥物對B16F10細(xì)胞具有選擇性殺傷效果，A6具有優(yōu)異的靶向性。值得注意的是，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，LTX-315在血清中會很快降解，因此無法在有血清存在的條件下對細(xì)胞進(jìn)行有效殺傷。而我們的載藥囊泡卻能夠在10%血清存在下對細(xì)胞進(jìn)行有效的抑制，說明我們設(shè)計(jì)的藥物遞送體系是有效的。圖10A6-PS-LTX-315和PS-LTX-315對B16F10細(xì)胞的毒性4.結(jié)論在本論文中，我們設(shè)計(jì)了mPEG-P(TMC-co-DTC)-KD10來制備不對稱膜囊泡包載生物活性肽LTX-315，并對囊泡制備過程中的條件如載藥量，溶液pH、靶向因子的修飾進(jìn)行了研究，能得到如下結(jié)論：在攪拌子0rpm的條件下制備的納米粒子更大一些且在粒徑分布上更為集中，在靜置搖床中交聯(lián)24h后的囊泡相比于200rpm搖床中交聯(lián)更為穩(wěn)定。在pH為5.3或6.4的緩沖溶液中制備的納米粒子在透析后會發(fā)生團(tuán)聚，說明這兩種條件下制備的納米粒子穩(wěn)定性較差，所以我們選取pH為6.8的緩沖溶液作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的水相條件。在載藥量實(shí)驗(yàn)中，15%載藥量的聚合物囊泡包封率與5%和10%載藥量的囊泡均相差無幾，都能達(dá)到90%以上。此外，在數(shù)次實(shí)驗(yàn)中15%的囊泡在透析后都會的穩(wěn)定性會較10%的囊泡差一些。而20%羅丹明標(biāo)記的LTX-315在載藥實(shí)驗(yàn)中會由于藥量過多會直接發(fā)生團(tuán)聚，因此我們推測15%接近于載藥量理論上的最大值。值得高興的是，囊泡在穩(wěn)定性與響應(yīng)性實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)良好，有利于納米粒延長在體內(nèi)循環(huán)時間并在細(xì)胞內(nèi)GSH作用下快速釋放。囊泡表面經(jīng)A6修飾后會使得囊泡更大一些，粒徑從33nm變成了44nm，更穩(wěn)定地對生物活性肽進(jìn)行包載。且在MTT實(shí)驗(yàn)中，相比于未修飾的囊泡，A6-PS-LTX-315對B16F10細(xì)胞具有選擇殺傷性，靶向效果顯著。雖然生物活性肽仍處于臨床試驗(yàn)的階段，還沒能造福癌癥患者。但它的低毒副作用，使生物活性肽成為飽受化療折磨的癌癥患者們所翹首以盼的福音。此外，簡單的結(jié)構(gòu)和合成，能大大減小多肽藥物的造價，也方便了科研工作的深入與探索。雖然多肽藥物還面臨著種種阻礙，但不斷發(fā)展的納米載藥技術(shù)很可能解決這些難題。癌癥逐年攀升的發(fā)病率與致死率，也促使著人們投入更大的精力到抗癌的工作中去。相信在將來，隨著科技的不斷進(jìn)步，不僅僅是多肽藥物能得到臨床上的應(yīng)用，各種新穎的藥劑與療法都會得到巨大的發(fā)展，為人類帶來健康與幸福。

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