單倍體育種技術(shù)全省公開課一等獎省賽獲獎?wù)n件

玉米誘導(dǎo)單倍體育種技術(shù)與應(yīng)用陳紹江中國農(nóng)業(yè)大學(xué)第1頁內(nèi)容提要單倍體育種（DH）背景介紹單倍體育種基本程序國內(nèi)單倍體育種研究進(jìn)展系統(tǒng)化與工程化問題第2頁2024/4/133無融合生殖類型一、無性幼胚起源細(xì)胞發(fā)生部位和幼胚發(fā)育方式，能夠深入把無融合堅(jiān)固或無融合生殖再分為4種不一樣類型:1.無孢子形成（apospory）2.二倍性孢子形成（diplospory）3.不定胚生殖（adventitiousembryny）4.單性生殖（parthenogenesis）第3頁2024/4/134

有性生殖與各種無融合生殖方式比較第4頁2024/4/135單性生殖

孤雌生殖：在正常有性胚囊中，卵細(xì)胞未經(jīng)受精而直接發(fā)育成胚現(xiàn)象稱為單性生殖或雌核發(fā)育（gynogenesis）。由單性生殖產(chǎn)生胚或植株，都是單倍體。孤雄生殖：與雌核發(fā)育相對應(yīng)另一個單性生殖形式是雄核發(fā)育（androgenesis）。這是一個更為稀有遺傳現(xiàn)象，正常有性胚囊中卵細(xì)胞，因某種原因喪失功效，未能和精子結(jié)合，進(jìn)入胚囊一個精子占據(jù)卵細(xì)胞位置，發(fā)育為單倍體胚。第5頁產(chǎn)生玉米單倍體路徑品種間雜交自發(fā)產(chǎn)生孤雌生殖單倍體不定配子體基因ig誘導(dǎo)孤雄生殖單倍體化學(xué)和物理方法誘導(dǎo)單倍體花藥組織和花粉培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體雌穗、子房或胚珠離體培養(yǎng)孤雌生殖誘導(dǎo)系雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體一、背景介紹第6頁基本應(yīng)用：

1)育種平臺：

快速取得純系，縮短育種年限

親本與高代系純化

種質(zhì)改良育種技術(shù)遺傳純合度%世代傳統(tǒng)育種507587.5093.7596.8898.4499.287代DH技術(shù)501002代第7頁第8頁育種程序比較季DH育種進(jìn)度常規(guī)1D0S02D1測配，系選S13D2判定選擇S24D3復(fù)配，行比S3測配，系＋株選5D4預(yù)試S4判定，系株選6D5區(qū)試S5復(fù)配判定，系株選7D6區(qū)試S6復(fù)配行比8D7生試S7預(yù)試第9頁2)

遺傳研究：

突變判定，淘汰有害隱性基因

基因定位（DH群體）

生殖遺傳----雙胚苗等第10頁2024/4/13subproject2.211第11頁2024/4/13subproject2.212第12頁特點(diǎn)多------易于規(guī)?；?-----選系速度快好------純度高省------第13頁3）單倍體育種應(yīng)用情況

國內(nèi)：－250萬個單倍體以上規(guī)?；瘑伪扼w育種第14頁國外應(yīng)用先鋒、孟山都、先正達(dá)、利馬格蘭、KWS等都有大規(guī)模應(yīng)用,DH系占新選系能夠到達(dá)90%，已經(jīng)替換傳統(tǒng)選系成為主要選系方法當(dāng)代育種技術(shù)新體系三大關(guān)鍵技術(shù)單倍體育種+分子育種+轉(zhuǎn)基因

第15頁國外大規(guī)模單倍體育種第16頁二、單倍體育種基本程序第17頁基礎(chǔ)材料2n=20單倍體n=10單倍體判定加倍DH系2n=20單倍體育種程序單倍體產(chǎn)生單倍體加倍DH系評價與應(yīng)用第18頁（一）、單倍體誘導(dǎo)誘導(dǎo)母本材料誘導(dǎo)系與雜交種誘導(dǎo)機(jī)理第19頁

基礎(chǔ)材料×孤雌生殖誘導(dǎo)系

無色糊粉層紫色糊粉層無色胚芽紫色胚芽綠色植株

正常雜交籽粒準(zhǔn)單倍體籽粒

紫色糊粉層紫色糊粉層紫色胚芽無色胚芽

假單倍體單倍體

紫色植株綠色植株加倍

DH系第20頁1、基礎(chǔ)材料選擇群體遺傳組成：雜合群體：單交種，群體等分離群體：F2,F3,F4等近純合群體：自交系等種質(zhì)類型：硬粒－－－80％以上馬齒－－－90％以上第21頁2、玉米孤雌生殖誘導(dǎo)系Coe(1959)Stock6是第一個孤雌生殖誘導(dǎo)系,誘導(dǎo)率1%-2%。Lashermes(1988)孤雌生殖誘導(dǎo)系WS14,誘導(dǎo)率3.5%

。Tyrnov等(1994)孤雌生殖誘導(dǎo)系ZMS,單倍體誘導(dǎo)頻率到達(dá)2%左右。4）張銘堂、德國所用誘導(dǎo)系RWS,UH400等誘導(dǎo)率8％左右5）吉林農(nóng)科院吉誘3號6）其它研究單位也開展了研究7）中國農(nóng)業(yè)大學(xué)在BH0×Stock6后代選育出高油型孤雌生殖單倍體誘導(dǎo)系農(nóng)大高誘1號等。最近新誘導(dǎo)系農(nóng)大高誘2-5號，誘導(dǎo)率8-18%，誘導(dǎo)雜交種農(nóng)大雜誘1號，2號誘導(dǎo)率在5-10%。第22頁2024/4/13subproject2.223誘導(dǎo)系InducerRate(%)

Stock62.3Coe,1959ZMS0.6～3.4Tyrnov&Zavalishina,1984WS143.0～5.0Lashermes&Beckert,19885329C3.05～18.57Sarkar,1994KEMS6.3Shatskaya,1994MHI5.5～6.7Chalyk,1994RWS8.65～13.39Geiger&R?ber,UH4008～15Melchinger,CAUHOI1.9～9.2Liu,；Chen，第23頁農(nóng)大高誘2-5號與雜交種新系2—5號基本穩(wěn)定誘導(dǎo)率在5-18%第24頁第25頁26年7月北京上莊第26頁27年10月至2月28日海南南濱第27頁282012年12月15日海南南濱第28頁292013年02月25日海南南濱第29頁302013年02月25日海南南濱第30頁312013年02月20日海南南濱第31頁32農(nóng)大高誘5號(CAUHI5)果穗與植株生產(chǎn)上應(yīng)用誘導(dǎo)系類型第32頁33關(guān)聯(lián)群體自交系與誘導(dǎo)系CAUHI5雜交后表現(xiàn)第33頁籽粒標(biāo)識R-nj遺傳---花粉直感第34頁

果穗中單倍體第35頁單倍體產(chǎn)生生物學(xué)機(jī)理：

第36頁雄配子體發(fā)育第37頁雙受精示意圖(引自Fre′de′ricBerger等，)第38頁（二）、單倍體判定田間判定（早期）細(xì)胞遺傳學(xué)方法形態(tài)學(xué)方法

放射性方法除草劑方法分子標(biāo)識法

遺傳標(biāo)識法油份判定法★第39頁孤雌單倍體標(biāo)識R-nj第40頁根色判別第41頁

植株顏色判別第42頁（三）、單倍體加倍自然加倍與小麥、水稻等不一樣，玉米單倍體自然加倍率普通低于10％，有些材料不發(fā)生自然加倍（Zabirova,1993;Shatskaya,1994）氣體N2O加倍（A.Kato，）組培加倍藥劑化學(xué)加倍

除草劑(APM,Pronamide,Oryzalin,Trifluralin等)秋水仙素配方優(yōu)化加倍步驟優(yōu)化（時間、溫度等）第43頁

藥劑加倍除草劑：APM(amiprophosmethy1)、拿草特(pronamide）、安磺靈(oryzalin)、氟樂靈(trifluralin)等；秋水仙素各種原因影響（藥劑濃度、處理時間、處理溫度等）。第44頁田間加倍第45頁（四）、DH系第46頁第47頁第48頁三、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)單倍體研究1995開始--誘導(dǎo)技術(shù)判別與加倍DH系高效應(yīng)用單倍體育種技術(shù)體系生物學(xué)機(jī)理應(yīng)用研究理論研究遺傳學(xué)學(xué)機(jī)理花粉直感與競爭

系統(tǒng)與工程化技術(shù)優(yōu)化第49頁理論研究生物學(xué)機(jī)理：染色體排除--B染色體誘導(dǎo)系遺傳機(jī)理：遺傳方式、誘導(dǎo)基因精細(xì)定位花粉直感：油份直感效應(yīng)和當(dāng)代雜種優(yōu)勢第50頁誘導(dǎo)生物學(xué)機(jī)理：染色體干擾與排除

特殊籽粒類型發(fā)覺第51頁特殊籽粒頻率及倍性判定籽粒數(shù)頻率(%)單倍體數(shù)判定效率(%)單倍體頻率(%)可能單倍體3131.2527587.861.10特殊籽粒3551.4227778.031.11雜交籽粒2435297.410100.000.00第52頁SSR分子標(biāo)識檢測第53頁DGAT1-2測序結(jié)果第54頁玉米小孢子第二次分裂中B染色體不分離現(xiàn)象B染色體傳遞第55頁玉米染色體熒光免疫染色結(jié)果（金危危教授提供）黃綠色信號為CENH3抗體，箭頭所指為玉米B染色體（信號相對較弱）假如有B染色體說明不是單受精，誘導(dǎo)系A(chǔ)染色體消失為排除所致第56頁單倍體誘導(dǎo)機(jī)理模式圖第57頁A1:B73×UH400;A2:UH400;B不一樣子粒類型誘導(dǎo)性狀生殖遺傳機(jī)制第58頁誘導(dǎo)性狀與敗育性狀同為雄配子表示性狀A(yù):誘導(dǎo)系×常規(guī)系B:誘導(dǎo)系自交C:常規(guī)系×誘導(dǎo)系第59頁單倍體誘導(dǎo)基因作用模型?（A）誘導(dǎo)基因在雄配子中表示，并可能受到表觀修飾（用灰色表示）。其產(chǎn)物對于花粉競爭性會有影響?（B）父本染色體高度修飾可能會造成子粒中染色體消除或敗育發(fā)生。對于其余輕度修飾花粉將不會影響雙受精過程，并最終形成正常子粒。第60頁誘導(dǎo)基因分子標(biāo)識能夠用于輔助選育誘導(dǎo)系在第1和第9染色體上發(fā)覺誘導(dǎo)基因第61頁1號染色體誘導(dǎo)基因精細(xì)定位<250kbbnlg1811X68X64X41umc2390X93umc1917X22X18AC191011AC02AC205700AC208894AC206675AC205278AC186508832.15k23415678910direction★★★★★★★★★★★★★第62頁應(yīng)用研究-----

1、誘導(dǎo)技術(shù)研究誘導(dǎo)系（各種標(biāo)識）：普通型-----1-5號

高油型-----一代二代-----分子聚合育種?；?----糯、黃改、B染色體、熒光等背景誘導(dǎo)雜交種----農(nóng)大雜誘1-2號誘導(dǎo)率隱性測驗(yàn)種-----黃苗誘導(dǎo)方法：誘導(dǎo)基地第63頁誘導(dǎo)系和隱性遺傳測驗(yàn)材料第64頁分子輔助誘導(dǎo)基因與油分雙選

世代改變F4油分誘導(dǎo)率482-67.63±0.725.50483-97.48±1.0012.96484-27.37±0.627.08最優(yōu)3個株系第65頁誘導(dǎo)系與誘導(dǎo)雜交種第66頁含有良好農(nóng)藝性狀、散粉量大誘導(dǎo)系間雜交種第67頁68母本可誘導(dǎo)性：誘導(dǎo)率（Q+K）Manhattan-plot第68頁2、單倍體判別技術(shù)油份判別技術(shù)--------油份判別方法自動識別技術(shù)--------核磁自動判別熒光判別技術(shù)--------組培判別第69頁研究背景第70頁R-nj色素表示不穩(wěn)定第71頁高油誘導(dǎo)系花粉直感效應(yīng)非雜交籽粒油份>單倍體油份玉米85%左右油份存在于玉米胚之中，而油份含有一定花粉直感效應(yīng)，如以高油型誘導(dǎo)系進(jìn)行誘導(dǎo)，雙受精雜交籽粒含有較高油份，而孤雌生殖單倍體則油份較低。第72頁HO115NMB73第73頁油份判定值確實(shí)定單倍體平均油份雜交后平均油份判定效率油份判定值4.00%6.00%0.605.14%4.00%6.00%0.705.00%4.00%6.00%0.804.85%4.00%6.00%0.904.64%第74頁人工測油---速度慢

1000粒左右/天天平第75頁油份自動核磁共振測定儀判定單倍體以農(nóng)大高油高誘一號為父本與普通玉米雜交，雜交當(dāng)代籽粒含油量顯著提升，花粉直感增油率在30％以上。利用此法進(jìn)行單倍體判定，準(zhǔn)確率能夠超出90％，速度能夠到達(dá)天天2萬粒.

也能夠用于其它作物選擇與判別。第76頁YFP熒光基因誘導(dǎo)系根尖與籽粒中YFP標(biāo)識表現(xiàn)情況紅色箭頭所指為攜帶有YFP基因子粒，其余不含YFP第77頁YFP熒光標(biāo)識判定單倍體在OLYMPUSDP72體式熒光顯微鏡下，經(jīng)過測定雜交幼胚熒光強(qiáng)度判別其中單倍體。78雜合體單倍體第78頁3、單倍體加倍技術(shù)化學(xué)加倍技術(shù)--------芽苗化學(xué)加倍自然加倍技術(shù)--------自然加倍基地第79頁2024/4/1380海南單倍體育種第80頁化學(xué)加倍（加倍能夠到達(dá)散粉率30％-80%）第81頁單倍體自然加倍

秋水仙素單倍體數(shù)散粉株數(shù)散粉率%變異范圍

單倍體數(shù)散粉株數(shù)散粉率變異范圍農(nóng)大10810510.950.00-1.90662639.3923.53-56.25鄭單95810543.811.92-5.66893337.0813.21-72.22均值--2.38---38.24-變幅--2.86---2.31-不一樣基礎(chǔ)材料單倍體處理與對照散粉情況比較（）加倍效果處理后單倍體平均散粉率高于對照近10倍，普通5-6倍第82頁大規(guī)模自然加倍基地（西北）第83頁自然加倍自然加倍重點(diǎn)：條件好：確保單倍體正常生長發(fā)育環(huán)境穩(wěn)：可控性強(qiáng)------------------------------設(shè)施加倍----溫室、組培基地加倍----西北、西南、海南

第84頁4、單倍體與DH應(yīng)用和管理單倍體管理DH系管理----規(guī)模化DH系管理方法遺傳研究—抗青枯病DH群體1145×Y331（-03年）選擇方法研究親本純化與種子生產(chǎn)----第85頁第86頁資源優(yōu)化配置第87頁5、系統(tǒng)化與工程化育種單倍體技術(shù)發(fā)展階段：點(diǎn)：關(guān)鍵步驟突破-----重點(diǎn)技術(shù)線：操作程序規(guī)范-----流程化管理面：技術(shù)體系形成-----選系主導(dǎo)技術(shù)體：系統(tǒng)工程構(gòu)建-----包含與其它技術(shù)結(jié)