生物芯片與高通量篩選技術

關于生物芯片與高通量篩選技術主要內(nèi)容生物芯片

基因芯片（DNA芯片）

蛋白質(zhì)芯片（ProteinChips）

細胞芯片 組織芯片高通量篩選第2頁,共42頁，2024年2月25日，星期天生物芯片生物芯片(biochip)是指采用微量點樣等方式,將核酸片段、多肽分子、組織切片和細胞等生物樣品有序地固定于支持物(如玻片、硅片、尼龍膜等載體)的表面,組成密集二維陣列,然后與已標記的待測生物樣品中的靶分子進行雜交、或用免疫組織化學、原位雜交等技術使待檢分子可視化,最后通過特定的儀器如激光共聚焦掃描儀或電荷偶聯(lián)攝影像機(CCD)對可視化信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析,從而判斷樣品中靶分子的相對數(shù)量。由于常用玻片/硅片作為固相支持物,且在制備過程模擬計算機芯片的制備技術,所以稱之為生物芯片技術。第3頁,共42頁，2024年2月25日，星期天生物芯片根據(jù)芯片上固定的生物物質(zhì)的不同,生物芯片分為基因芯片(Genechip)、蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)、細胞芯片(cellchip)、組織芯片(tissuechip);如芯片上固定的是寡核苷酸或DNA,就稱為基因芯片或DNA微陣列(DMAMicroarray);又如芯片上固定的是組織,就稱為組織芯片。第4頁,共42頁，2024年2月25日，星期天基因芯片（GeneChips）定義：就是按特定的排列方式固定有大量基因探針/基因片段的硅片、玻片、塑料?；蛐酒夹g是高效地大規(guī)劃獲取相關生物信息的重要手段。應用領域:

主要有基因表達譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突變及多態(tài)性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預測、藥物篩選、基因測序。第5頁,共42頁，2024年2月25日，星期天基因芯片作用原理采用高速打印或光刻合成技術可在硅片、玻璃或尼龍膜上制造DNA微陣列即基因芯片；樣品DNA/RNA通過PCR擴增、體外轉錄等技術摻入熒光標記分子,與微陣列雜交后通過熒光掃描儀器掃描及計算機分析即可獲得樣品中大量基因序列及表達的信息。第6頁,共42頁，2024年2月25日，星期天FlowchartofcDNAmicroarray第7頁,共42頁，2024年2月25日，星期天基因制備方法分為兩大類:一類是原位合成;一類是直接點樣；原位合成適用于寡核苷酸;直接點樣多用于大片段DNA,有時也用于寡核苷酸,甚至mRNA。原位合成有兩種途徑。一是光刻法;一是壓電打印法。光刻法可以合成30nt左右,打印法可以合成40250nt,光刻法每步縮合率較低,一般說噴印法特異性應比光刻法高。此外,噴印法不需特殊的合成試劑。與原位合成法比較點樣法較簡單,只需將預先制備好的寡核苷酸或cDNA等樣品通過自動點樣裝置點于經(jīng)特殊處理的玻離片或其它材料上即可。第8頁,共42頁，2024年2月25日，星期天芯片的種類電子芯片：帶有陽電荷的硅芯片、芯片經(jīng)熱氧化,制成1mm×1mm的陣列、每個陣列含多個微電極,在每個電極上通過氧化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。將連接鏈親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上,在電場作用下生物素標記的探針即可結合在特定電極上。三維芯片：三維生物芯片實質(zhì)上是一塊顯微鏡載玻片,其上有10,000個聚乙烯酰胺凝膠條,每個凝膠條可用于靶DNA,RNA和蛋白質(zhì)的分析。先把已知化合物加在凝膠條上,再用3cm長的微型玻璃毛細管將待測樣品加到凝膠條上。每個毛細管能把小到012nl的體積打到凝膠上。第9頁,共42頁，2024年2月25日，星期天基因芯片應用基因表達譜分析新基因發(fā)現(xiàn)基因突變及多態(tài)性分析基因組文庫作圖疾病診斷和預測藥物篩選基因測序第10頁,共42頁，2024年2月25日，星期天基因表達譜分析基因芯片技術可清楚地直接快速地檢測出以1:300,000水平出現(xiàn)的mRNA,且易于同時檢測成千上萬的基因。Lockhart等人對芯片技術定量檢測基因表達及其敏感性、特異性進行了研究。在陣列的雜交實驗中,從克隆cDNA文庫或直接從細胞mRNA制備標記RNA靶,用于雜交的RNA靶通過體外轉錄反應摻入熒光素標記的核糖核苷酸制備,然后隨機地將該RNA靶裂解為平均50—100個堿基大小的片段,樣品與陣列雜交30分鐘到22小時,陣列的熒光影像用特制的掃描共聚焦顯微鏡檢測。第11頁,共42頁，2024年2月25日，星期天新基因發(fā)現(xiàn)定量檢測大量基因表達水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療靶等方面是很有價值的。如該技術在炎癥性疾病類風濕性關節(jié)炎(RA)和炎癥性腸病(IBD)的基因表達研究中,由RAIBD組織制備探針,用Cy3和Cy5熒光素標記,然后與靶cDNA微陣列雜交,可檢測出炎癥疾病誘導的基因如TNF－

或粒細胞集落刺激因子,同時發(fā)現(xiàn)一些以前未發(fā)現(xiàn)的基因如HME基因和黑色素瘤生長刺激因子。第12頁,共42頁，2024年2月25日，星期天DNA序列分析人類基因組計劃的實施促進了更高效率的、能夠自動化操作的測序方法的發(fā)展。芯片技術中雜交測序(SBH)技術及鄰堆雜交(CSH)技術一種新的高效快速測序方法。用含65，536個8聚寡核苷酸的微陣列,采用SBH技術,可測定200bp長DNA序列,采用67,108,864個13個聚寡核苷酸的微陣列,可對數(shù)千個堿基長的DNA測序。SBH技術的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長度的增加而提高,但微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長度的增加則提高了微陣列的復雜性,降低了雜交準確性。CSH技術彌補了SBH技術存在的弊端,CSH技術的應用增加了微陣列中寡核苷酸的有效長度,加強了序列準確性,可進行較長的DNA測序。第13頁,共42頁，2024年2月25日，星期天突變體和多態(tài)性的檢測SHB技術可大規(guī)模地檢測和分析DNA的變異及多態(tài)性。Guo等人利用結合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸(ASOs)微陣列建立了簡單快速的基因多態(tài)性分析方法。將ASOs共價固定于玻璃載片上,采用PCR擴增基因組DNA,其一條引物用熒光素標記,另一條引物用生物素標記,分離兩條互補的DNA鏈,將熒光素標記DNA鏈與微陣列雜交,通過熒光掃描檢測雜交模式,即可測定PCR產(chǎn)物存在的多種多態(tài)性,該方法對人的酪氨酸酶基因第4個外顯子內(nèi)含有的5個單堿基突變進行分析,結果顯示單堿基錯配與完全匹配的雜交模式非常易于區(qū)別。這種方法可快速、定量地獲得基因信息。第14頁,共42頁，2024年2月25日，星期天疾病診斷和預測CancerArray

腫瘤基因芯片

生長因子基因芯片

腫瘤轉移基因芯片染色體穩(wěn)定和DNA修復基因芯片雄性激素信號通路與前列腺癌基因芯片腫瘤信號轉導基因芯片

腫瘤藥物耐受和代謝基因芯片血管生成基因芯片乳腺癌和雌激素受體信號通路基因芯片癌通路發(fā)現(xiàn)者基因芯片第15頁,共42頁，2024年2月25日，星期天基因芯片－狀況自從1996年美國Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于藥物篩選和實驗室試驗用的生物芯片。美國的Hyseq公司、Syntexi公司、Nanogen公司、Incyte公司及日本、歐洲各國都積極開展DNA芯片研究工作；摩托羅拉、惠普、IBM等跨國公司也相繼投以巨資開展芯片研究。預計在今后五年內(nèi)生物芯片銷售可達200-300億美元；據(jù)《財富》雜志預測(97.3)，在21世紀，生物芯片對人類的影響將可能超過微電子芯片。第16頁,共42頁，2024年2月25日，星期天基因芯片－狀況我國在生物芯片研究方面剛剛起步，98年10月，中科院將基因芯片列為“”九五”特別支持項目，利用中科院在微電子技術、生化技術、物理檢測技術方面的優(yōu)勢，組織跨所、跨學科合作?，F(xiàn)在在微陣列芯片和基于MEBS的芯片方面有大的突破，在DNA芯片設計、基片修飾、探針固定、樣品標記、雜交和檢測等方面的技術都有較大的進展，已研制出肝癌基因差異表達芯片、乙肝病毒多態(tài)性檢測芯片、多種惡性腫瘤病毒基因芯片等有一定實用意義的基因芯片和DNA芯片檢測儀樣機。第17頁,共42頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片技術是指把制備好的蛋白質(zhì)樣品固定于經(jīng)化學修飾的玻片、硅片等載體上,蛋白質(zhì)與載體表面結合,同時仍保留蛋白質(zhì)的物化性質(zhì)和生物活性。蛋白質(zhì)芯片是高通量、微型化和自動化的蛋白質(zhì)分析技術。蛋白質(zhì)芯片主要分兩種: 1）一種類似于ＤＮＡ芯片,即在固相支持物表面高密度排列的探針蛋白點陣,可特異地捕獲樣品中的靶蛋白,然后通過檢測器對靶蛋白進行定性或定量分析。

2）另一種就是微型化的凝膠電泳板。在電場作用下,樣品中的蛋白質(zhì)通過芯片上的孔道分離開來,經(jīng)噴霧直接進入質(zhì)譜儀中進行檢測,以確定樣品中蛋白質(zhì)的分子量及種類。第18頁,共42頁，2024年2月25日，星期天抗體蛋白質(zhì)芯片原理第19頁,共42頁，2024年2月25日，星期天原理蛋白質(zhì)芯片是將已知蛋白點印在固定于不同種類支持介質(zhì)上,制成由高密度的蛋白質(zhì)或多肽分子的微陣列組成蛋白微陣列,其中每個分子的位置及序列為已知,并將待測蛋白質(zhì)與該芯片進行孵育反應,再將熒光標記的蛋白質(zhì)與芯片蛋白質(zhì)復合物反應,當熒光標記的靶分子與芯片上的分子結合后,可通過激光掃描系統(tǒng)或電荷偶聯(lián)照像系統(tǒng)(ＣＣＤ）,對熒光信號的強度進行檢測,進一步對雜交結果進行量化分析,檢測蛋白質(zhì)的存在情況。第20頁,共42頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共42頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)芯片應用第22頁,共42頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)芯片應用疾病診斷和療效判定研究蛋白質(zhì)的相互作用發(fā)現(xiàn)藥物或毒物作用靶位和作用機制第23頁,共42頁，2024年2月25日，星期天發(fā)展日開發(fā)出廉價蛋白質(zhì)芯片：開發(fā)成功可迅速檢測癌癥等疾病的廉價蛋白質(zhì)芯片。把目前數(shù)十萬日元一個的蛋白質(zhì)芯片價格降到了僅為幾千日元。預計這種芯片在4年內(nèi)可以使用。光學蛋白質(zhì)芯片是一種基于橢圓偏振光原理，利用抗原和抗體以及受體與配體特異性的結合，將分子間的相互作用轉換為可直接讀取的灰度值，對檢測樣品進行定量檢測的方法。它由于無須對探針分子進行標記，因此有利于對蛋白質(zhì)進行活性分析。應用后冠心病檢測加速。第24頁,共42頁，2024年2月25日，星期天發(fā)展中國科學家研制的丙型肝炎蛋白質(zhì)芯片獲國家藥監(jiān)局頒發(fā)的生物制品一類新藥證書。這不僅是我國的第一個獲新藥證書的硅基材料蛋白質(zhì)芯片，也是迄今為止世界上惟一得到政府藥品監(jiān)督管理機構頒發(fā)新藥證書的蛋白質(zhì)芯片。兩英寸大小的蛋白質(zhì)芯片已由深圳益生堂生物企業(yè)有限公司投產(chǎn)。只需要２微升（一滴血的十分之一）血清或血漿，１小時后就能檢測出結果。而每次的檢測費用只有１００元左右。第25頁,共42頁，2024年2月25日，星期天細胞芯片新型的細胞芯片,其原理是應用細胞膜表面不同的抗原物質(zhì),與結合在玻片上的不同抗體發(fā)生特異性結合,通過自動捕獲能力將所獲細胞固定在特定區(qū)域,以此對淋巴瘤細胞進行診斷和分類。細胞芯片的制作:每種抗體與pH10－12的Tris2HCl緩沖液等體積稀釋,通過生物芯片點樣儀自動點樣,將8種抗體分別點在醛基玻片上的各自區(qū)域,每一抗體點4個點,直徑約2mm左右,形成4×8微陣列。點樣后迅速將玻片置于濕盒中,4℃冰箱水化,過夜。第26頁,共42頁，2024年2月25日，星期天細胞芯片應用疾病診斷胸腔液中淋巴瘤細胞檢測第27頁,共42頁，2024年2月25日，星期天發(fā)展最近出現(xiàn)了一種細胞微陣列芯片，他是將不同的質(zhì)粒DNA點在玻璃片上做成質(zhì)粒DNA芯片，接著在脂質(zhì)轉染試劑處理好的芯片上培養(yǎng)細胞，被轉染的細胞因此獲得了外源DNA賦予的新性狀，因此也稱為反向轉染(reversetransfection).這種技術不但可以用于cDNA、融合肽或RNA分子的分析，而且還可以用于研究一些細胞因子、化學抑制劑或放射性標記對基因表達的影響.第28頁,共42頁，2024年2月25日，星期天組織芯片Kononen等(1998)年在《自然》雜志上首次報道了組織芯片這一高通量的技術。組織芯片技術可以將數(shù)十個甚至上千個不同個體的臨床組織標本按預先設計的順序排列在一張玻片進行分析研究，是一種高通量、多樣本的分析工具。它使科研人員第一次有可能同時對幾百甚至上千種正?；蚣膊∫约凹膊“l(fā)展不同階段的自然病理生理狀態(tài)下的組織樣本，進行某一個或多個特定的基因，或與其相關的表達產(chǎn)物的研究。第29頁,共42頁，2024年2月25日，星期天應用如Kononen等使用標準免疫組化方法利用組織芯片技術研究了645例各種乳腺癌組織標本，試驗數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)病理切片相應研究結果完全一致；同時他們還發(fā)現(xiàn)有關p53等6種基因的檢測結果表明，新鮮與石蠟包埋的組織標本的檢測結果沒有差異。Hedenfalk等結合組織芯片技術和基因芯片技術檢測了原發(fā)性乳腺癌及組織標本。Hoos等用組織芯片技術對59例成纖維細胞瘤進行免疫表型分析。Mucci等用組織芯片證實了神經(jīng)內(nèi)分泌因素與前列腺癌進展的關系。第30頁,共42頁，2024年2月25日，星期天高通量篩選（HighThroughputScreen，HTS）第31頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

新藥發(fā)現(xiàn)第32頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

細胞分析平臺HTS第33頁,共42頁，2024年2月25日，星期天HTS90年代初期,一個實驗室采用傳統(tǒng)的方法,借助20余種藥物作用靶位,一年內(nèi)僅能篩選75000個樣品;到了1997年HTS發(fā)展的初期,采用100余種靶位,每年可篩選1000000個樣品;而到1999年,由于HTS的進一步完善,每天的篩選量就高達100000種化合物[2],因而,稱之為超高通量篩選(ultrahigh-throughputscreening)。這種新的飛躍,將大大加速新藥發(fā)現(xiàn)的速度。第34頁,共42頁，2024年2月25日，星期天HTS高通量藥物篩選技術是20世紀80年代后期發(fā)展起來的一種用于尋找新藥的高新技術,由于該技術的快速、高效等特點,受到國際藥物研究機構的極大重視。高通量藥物篩選技術是將多種技術方法有機結合而形成的新的技術體系,它以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎,以微板形式作為實驗工具載體,以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行實驗過程,以靈敏快速的檢測儀器采集實驗數(shù)據(jù),以計算機對實驗獲得的數(shù)據(jù)進行分析處理,在同一時間內(nèi)對數(shù)以千、萬計的樣品進行檢測,并以相應的數(shù)據(jù)庫支持整個技術體系的正常運轉。第35頁,共42頁，2024年2月25日，星期天HTS原理高通量篩選分析通常在96孔板上進行,采用自動化技術對流體進行分配并對微孔板進行處理,化合物、藥物活性的檢測在微孔板中進行,這種分析模式至今仍被廣泛采用,但許多研究機構已轉向384孔板或孔數(shù)更高、體積更小的分析模式?，F(xiàn)今,國外許多制藥公司已把高通量篩選作為發(fā)現(xiàn)先導化合物的主要手段。典型的高通量篩選模式為每次篩選1000個化合物；而超高通量篩選可每天篩選10萬多個化合物。隨著分析容量的增大,分析檢測技術、液體處理及自動化,還有連續(xù)流動以及信息處理已成為制約高通量篩選發(fā)展的瓶頸。因此,為減少成本和降低操作費用,高通量篩選須向自動化、分析微量化方向發(fā)展。第36頁,共42頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共42頁，2024年2月25日，星期天HTS的樣品采用HTS進行篩選的樣品主要有組合化學庫、天然化合物、化學合成化合物、反義核酸、肽核酸、可溶性蛋白等。目前已將生物芯片技術用于HTS藥物篩選研究,如正在改進Caliper′s顯