生物催化與生物轉(zhuǎn)化

關(guān)于生物催化與生物轉(zhuǎn)化第一章概論一微生物的多樣性和微生物資源的開拓1微生物的生境：指微生物在自然界中存在的場所，包括土壤、水域、動(dòng)物、植物、極端環(huán)境、特殊環(huán)境和大氣2多樣性的廣度人們在實(shí)驗(yàn)室所設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件還不能重復(fù)生境中的條件3原核生物是未曾觀察到的多數(shù)分布、數(shù)目和組分：原核生物的數(shù)目估計(jì)為（4-6）×1030個(gè)細(xì)胞，含碳量是植物含碳量的60%-100%4活的但不能夠培養(yǎng)的微生物長時(shí)期低溫保存在無營養(yǎng)料的鹽水中的霍亂弧菌和大腸桿菌第2頁,共129頁，2024年2月25日，星期天5已知的菌種來源和菌種保藏中心二改進(jìn)培養(yǎng)方法和尋找新類型微生物及其產(chǎn)物1新類型微生物的分離取樣預(yù)處理選擇性培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)例如；抗生素生產(chǎn)菌的發(fā)展趨勢放線菌細(xì)菌霉菌真菌極端環(huán)境和特殊環(huán)境中的微生物藻類2富集培養(yǎng)樣品富集培養(yǎng)活的菌株純化菌株分離菌種第3頁,共129頁，2024年2月25日，星期天所需菌種產(chǎn)品3代謝產(chǎn)物的篩選（1）篩選的要求；建立專一性的模型，操作簡便，能進(jìn)行高通量篩選（2）篩選方法抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成：內(nèi)酰胺酶抑制劑；以細(xì)胞壁模擬三肽逆轉(zhuǎn)糖肽抗生素，從而篩選新的抗生素抑制真菌的抗生素：根據(jù)真菌細(xì)胞壁合成篩選抑制劑根據(jù)代謝途徑的有無而設(shè)計(jì)篩選方法殺蟲、殺螨、殺球孢蟲抗生素除草劑：以枯草桿菌為模型，在合成培養(yǎng)基中菌的生長受到抑制，但在谷氨酰胺存在時(shí)不受抑制第4頁,共129頁，2024年2月25日，星期天酶抑制劑和生理活性物質(zhì)血管緊張肽原血管緊張肽I血管緊張肽酶原血管緊張肽II血管緊張肽受體血管收縮第5頁,共129頁，2024年2月25日，星期天治療愛滋?。汉Y選抑制愛滋病毒復(fù)制的HIV核糖核酸酶抑制劑腫瘤篩選的兩種模型：以DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶為靶酶的模型；DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)中的抑制劑模型二生境中微生物基因組DNA的開拓1從土壤和水樣提取DNA及多樣性研究

16SrRNA序列分析得到的系統(tǒng)進(jìn)化樹從生境中取樣：能代表自然環(huán)境中的多樣性微生物2土壤微生物DNA的文庫構(gòu)建步驟土壤偏基因組DNABAC載體轉(zhuǎn)化E.coli第6頁,共129頁，2024年2月25日，星期天注意事項(xiàng)：（1）偏基因組文庫：土壤微生物群體的基因組（2）系統(tǒng)進(jìn)化樹的比較分析：基因水平和氨基酸水平（3）從文庫中篩選生物活性物質(zhì)（4）組合生物合成（5）聚酮體化合物第7頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第二章微生物工程的發(fā)展與趨向一微生物工程發(fā)展的幾個(gè)里程碑抗生素工業(yè)生產(chǎn)帶動(dòng)了生化工程的建立大罐無菌深層發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化的興起可的松類激素的合成（黑根霉）微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸谷氨酸、賴氨酸固定化技術(shù)補(bǔ)充：固定化酶和固定化細(xì)胞的差異蛋白酶抑制劑和其他酶抑制劑

50多種具有專一性和特殊結(jié)構(gòu)的蛋白酶、多肽酶等抑制劑第8頁,共129頁，2024年2月25日，星期天基因工程技術(shù)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、面包酵母、畢赤酵母、漢遜酵母菌、黑曲霉、乳酸菌二微生物代謝產(chǎn)物的類型初級代謝產(chǎn)物：氨基酸、核苷酸、維生素、有機(jī)酸、脂肪酸、乙醇次級代謝產(chǎn)物：抗生素、毒素、胞外多糖、植物堿轉(zhuǎn)化產(chǎn)物：甾體、烷烴、芳烴、雜環(huán)化合物三微生物工程面臨的形勢微生物工程與化學(xué)合成工業(yè)的競爭第9頁,共129頁，2024年2月25日，星期天農(nóng)業(yè)生物工程對微生物工程與化學(xué)工業(yè)的沖擊第10頁,共129頁，2024年2月25日，星期天四微生物工程的發(fā)展方向提高現(xiàn)有微生物發(fā)酵工業(yè)水平（1）抗性菌株的選育（2）前體的應(yīng)用（3）增加合成操縱子拷貝（4）關(guān)鍵基因的過量表達(dá)利用重組DNA技術(shù)內(nèi)酰胺類抗生素、蝦青素、孕烯醇酮和孕甾酮開拓極端酶古細(xì)菌的菌種中存在新的代謝途徑，可能產(chǎn)生具有新的活力和用途的酶。第11頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第2章生物轉(zhuǎn)化操作與轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型一、生物轉(zhuǎn)化的一般操作1生物轉(zhuǎn)化的催化劑生長中的菌體休止菌體酶固定化酶固定化菌體2生物轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)反應(yīng)專一性區(qū)域?qū)Ｒ恍缘?7頁,共129頁，2024年2月25日，星期天立體專一性

3操作步驟4矛盾的解決誘導(dǎo)酶基因工程菌二生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的類型甾體的生物轉(zhuǎn)化第一個(gè)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的生物轉(zhuǎn)化第18頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共129頁，2024年2月25日，星期天紫蘿酮的羥基化：光學(xué)活性2-羥基胡蘿卜素合成的起始原料第20頁,共129頁，2024年2月25日，星期天烷烴的雙端氧化：通過突變，可使氧化受阻，獲得烷烴的雙端氧化氧化脫氨：轉(zhuǎn)化頭孢菌素C為7-氨基頭孢烷酸所依據(jù)的反應(yīng)，包括D-氨基酸氧化脫氨，所產(chǎn)生的酮基中間產(chǎn)物，再經(jīng)細(xì)菌?；傅淖饔?，最后產(chǎn)生7-ACA。環(huán)氧化反應(yīng)第21頁,共129頁，2024年2月25日，星期天C-C鍵的脫氫：多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)第22頁,共129頁，2024年2月25日，星期天碳鏈氧化降解：降解甾體物質(zhì)側(cè)鏈的一個(gè)重要反應(yīng)，可用于制備天然芳香物質(zhì)。第23頁,共129頁，2024年2月25日，星期天碳雙鍵加水反應(yīng)（1）采用固定化的Aspergilluswentii中丁烯二酸酶催化反丁烯二酸產(chǎn)生蘋果酸，產(chǎn)量達(dá)237g/L,轉(zhuǎn)化率為82%。（2）采用Rhizobium催化立體專一性加水反應(yīng)生產(chǎn)治療心臟病藥物L(fēng)-肉堿，產(chǎn)量達(dá)300g/L,轉(zhuǎn)化率為95%第24頁,共129頁，2024年2月25日，星期天碳雙鍵加氨第25頁,共129頁，2024年2月25日，星期天腈水化酶脫氨用?；傅?6頁,共129頁，2024年2月25日，星期天生物轉(zhuǎn)化茚為1,2羥基茚：AIDS蛋白酶抑制劑的半合成部分結(jié)構(gòu)第27頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共129頁，2024年2月25日，星期天

第三章膽固醇合成抑制藥物的生物轉(zhuǎn)化一膽固醇合成抑制劑的作用機(jī)制1膽固醇生物合成途徑第29頁,共129頁，2024年2月25日，星期天2常見的膽固醇合成抑制劑HMG-CoA還原酶抑制劑：洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀對還原酶有競爭性抑制作用第30頁,共129頁，2024年2月25日，星期天二4種膽固醇合成抑制劑的合成途徑第31頁,共129頁，2024年2月25日，星期天三美伐他汀生物轉(zhuǎn)化為普伐他汀Hosobuchi等采用S.carbophilusSANK6285轉(zhuǎn)化美伐他汀存在底物的誘導(dǎo)（羥基化活力）和抑制作用。Matsuoka等觀察到美伐他汀轉(zhuǎn)化為普伐他汀是由細(xì)胞色素P450催化。四用ActinomaduraSP.

進(jìn)行轉(zhuǎn)化第32頁,共129頁，2024年2月25日，星期天五辛伐他汀的生物轉(zhuǎn)化高濃度抑制產(chǎn)物形成營養(yǎng)養(yǎng)料第33頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第四章內(nèi)酰胺抗生素母核的生物轉(zhuǎn)化16-APA的生成大部分的半合成青霉素由6-APA合成，后者主要由酶法或化學(xué)法降解青霉素而來。第34頁,共129頁，2024年2月25日，星期天

化學(xué)法和酶法相比，酶法更具有優(yōu)越性，使用的酶為青霉素酰化酶，又稱青霉素酰胺酶，按照優(yōu)先水解青霉素的能力又分為：青霉素G?；福嗝顾豓?；负桶逼S青霉素酶。（A）產(chǎn)生菌及其培養(yǎng)和性質(zhì)PGA最常用于工業(yè)化生產(chǎn)的是大腸桿菌、巨大芽孢桿菌、淡紫灰鏈霉菌、無色桿菌、游動(dòng)放線菌、產(chǎn)黑假單孢菌和產(chǎn)黃青霉菌。廣泛應(yīng)用的大腸桿菌一般培養(yǎng)基含營養(yǎng)肉湯、玉米浸出液、胨、葡萄糖和苯乙酸。PGA的底物專一性非常寬。PVA主要由曲霉和Epidermophytoninterdigitale產(chǎn)生，屬于胞內(nèi)酶氨芐青霉素?；钢饕杉賳捂呔鷮偕a(chǎn)（B）育種與基因工程多年來主要靠傳統(tǒng)誘變技術(shù)處理?；蚬こ叹甑臉?gòu)建是通過改變調(diào)節(jié)區(qū)域的堿基、SD與ATG之間的距離提高PGA的表達(dá)水平，PGA的表達(dá)是溫度敏感型的，受葡萄糖阻遏和苯乙第35頁,共129頁，2024年2月25日，星期天酸誘導(dǎo)，受細(xì)胞生長速度的影響。（C）PGA和PVA基因的表達(dá)和翻譯加工底物青霉素G的疏水側(cè)鏈結(jié)合位點(diǎn)是A亞基的Met168區(qū)域；催化位點(diǎn)在B亞基的Ser290。第36頁,共129頁，2024年2月25日，星期天2青霉素?；傅募兓盁岱€(wěn)定性第37頁,共129頁，2024年2月25日，星期天3青霉素酰化酶的固定化固定化可維持高活力和專一性，控制污染，還可長期使用。第38頁,共129頁，2024年2月25日，星期天5日本旭化成公司固定化?；ㄉa(chǎn)6-APA巨大芽孢桿菌B-400的該酶能水解青霉素G苯乙酰7-ADCA、阿莫西林Cephalexin、Cephalothin，但不能水解青霉素V。固定化的方法菌株肉湯培養(yǎng)基中36度培養(yǎng)30-40小時(shí)用醋酸調(diào)pH6.0CeliteNo560吸附硫酸氨沉淀Sephadex凝膠脫鹽固定于胺化多孔聚丙烯腈第39頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共129頁，2024年2月25日，星期天6固定化菌體用于APA的生產(chǎn)菌種改良和培養(yǎng)條件優(yōu)化細(xì)胞固定化技術(shù)：多種固定化材料進(jìn)行比較以殼聚糖最好。運(yùn)轉(zhuǎn)的穩(wěn)定性：采用分批攪拌反應(yīng)器固定化基因工程菌株7國內(nèi)青霉素G酰化酶生產(chǎn)6-APA的工藝和設(shè)備利用固定化基因工程改造的大腸桿菌轉(zhuǎn)化青霉素G：活力仍需誘導(dǎo)，受葡萄糖阻遏，對溫度敏感利用巨大芽孢桿菌的固定化酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化：采用對流控制的模式操作，縮短了反映器內(nèi)的裂解反應(yīng)時(shí)間，采用聚砜中空纖維膜和平板膜第42頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共129頁，2024年2月25日，星期天二7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸（7-ADCA）和7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）的生產(chǎn)1、7-ACA和7-ADCA是半合成頭孢菌素的母核，前者由青霉素G和青霉素V經(jīng)青霉素?；该撊?cè)鏈而來，后者由7-苯乙酰胺脫乙酰氧基頭孢烷酸或7-苯氧乙酰胺脫乙酰氧基頭孢烷酸脫區(qū)側(cè)鏈而來。2、固定化青霉素酰化酶生產(chǎn)7-ADCA第44頁,共129頁，2024年2月25日，星期天3、直接發(fā)酵生產(chǎn)7-ADCA第45頁,共129頁，2024年2月25日，星期天荷蘭的Gist-Brocades公司在1994年申請了兩項(xiàng)專利，提供生產(chǎn)7-ACDA的方法第46頁,共129頁，2024年2月25日，星期天三酶法轉(zhuǎn)化頭孢菌素C為7-ACA半合成抗生素是一類高效、廣譜抗生素，內(nèi)酰胺類抗生素的銷售值占抗生素總量的78.3%,其中頭孢霉素又占了70%,年消耗量早1600-2000噸之間.頭孢菌素類抗生素的前體為7-ACA.我國生產(chǎn)的第一個(gè)品種頭孢噻吩后,先后研制了11各品種,實(shí)際生產(chǎn)品種僅有8種,但處于產(chǎn)量小、品種少、70%依賴進(jìn)口的狀態(tài)。半合成頭孢菌素抗生素的母核7-ACA的生產(chǎn)是發(fā)展這類抗生素的主要原料，其起始合成的物質(zhì)為頭孢菌素C第47頁,共129頁，2024年2月25日，星期天化學(xué)裂解法：主要方法，工藝成熟，7-ACA的收率在80%以上，但所使用的劇毒化學(xué)品、超低溫等條件，必然提高能耗和設(shè)備要求一步法轉(zhuǎn)化CPC生成7-ACA的研制一步裂解法需要CPC?；?，多數(shù)產(chǎn)生菌從土壤中分離，但是活力均比較低。許多人試圖通過對野生型的CPC?；高M(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造來提高它對CPC的酶解活力，同時(shí)增加它的表達(dá)量。例如使CPC?；傅?69位的甲硫氨酸變?yōu)槔野彼幔?05位的半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸，可使活力提高60%且表達(dá)量升高2-3倍對CPC酰化酶進(jìn)行純化和固定化兩步法轉(zhuǎn)化CPC生成7-ACA的研制D-氨基酸氧化酶脫氨、脫羧；GL-7-ACA?；该撊ノ於；?8頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第49頁,共129頁，2024年2月25日，星期天（1）DAO的存在，固定化及副反應(yīng)微生物來源的DAO與FAD結(jié)合比較牢固，在工業(yè)上有良好的應(yīng)用前景。DAO易失活，細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性較高，經(jīng)透性化處理的三角酵母細(xì)胞通過戊二醛和殼多糖相連，可以用于轉(zhuǎn)化。采用多孔性的樹脂固定化純化的DAO酶表觀活力很高。副反應(yīng)的干擾第50頁,共129頁，2024年2月25日，星期天DAO基因的克隆，不同表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)和在CPC轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用第51頁,共129頁，2024年2月25日，星期天GA宿主菌的改造和發(fā)酵條件的優(yōu)化大多數(shù)產(chǎn)生GA的野生型假單孢菌屬于G-，產(chǎn)酶高峰一般出現(xiàn)在對數(shù)生長末期，屬胞內(nèi)酶。野生型產(chǎn)生菌活力較低，可經(jīng)誘變、篩選獲得高產(chǎn)和組成型菌株。第52頁,共129頁，2024年2月25日，星期天GA基因工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化（1）溫度（2）補(bǔ)料：流加補(bǔ)糖；定時(shí)補(bǔ)充低濃度的葡萄糖（3）調(diào)節(jié)pH和通氣量（4）高密度發(fā)酵DAO與GA產(chǎn)生菌細(xì)胞對CPC實(shí)行共轉(zhuǎn)化DAO產(chǎn)生菌與GA工程菌的細(xì)胞共固定對CPC實(shí)行共轉(zhuǎn)化DAO與GA兩酶共固定化對CPC實(shí)行共轉(zhuǎn)化兩酶基因在同一宿主中克隆、表達(dá)并對CPC實(shí)行共轉(zhuǎn)化第53頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第54頁,共129頁，2024年2月25日，星期天直接發(fā)酵生產(chǎn)7-ACA的基因工程菌的構(gòu)建努力構(gòu)建產(chǎn)黃頂孢霉或產(chǎn)黃青霉基因工程菌直接發(fā)酵生產(chǎn)7-ACA提高關(guān)鍵酶的基因劑量，增加合成CPC的產(chǎn)量。Conder等人的方法第55頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第56頁,共129頁，2024年2月25日，星期天7-ACA合成的關(guān)鍵技術(shù)通過透性化、pH和加熱等細(xì)胞預(yù)處理方法提高了三角酵母DAO的表觀活力，并消除了過氧化氫酶、酯酶等雜酶的干擾。通過宿主菌染色體上的ampC基因鈍化而克服了內(nèi)酰胺酶的破壞作用。成功解決了CPC發(fā)酵提煉精制液直接用于酶促轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵問題在線控制與檢測第57頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第五章長鏈二元酸的生物轉(zhuǎn)化正構(gòu)烷烴發(fā)酵生產(chǎn)單一長鏈二元酸合成麝香類物質(zhì)單一長鏈二元酸是高級麝香型香料、醫(yī)藥、合成纖維、工程塑料的中間體原料?；瘜W(xué)合成具備一定的困難，1972和1978年日本科學(xué)家報(bào)道采用陰溝假絲酵母合成二元酸，16碳二元酸最高得率為54g/L.我國采用熱帶假絲酵母誘發(fā)多倍體突變株，其中休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化最高產(chǎn)量可達(dá)109g/L。以單一長鏈二元酸作為中間原料，經(jīng)2-4步化學(xué)反應(yīng)可合成各種類型名貴的麝香型香料和藥品。要研制單一長鏈二元酸，國內(nèi)外無現(xiàn)存原料、菌種和工藝，需要解決的問題主要有：單一正構(gòu)烷烴的分離篩選對各種長度碳鏈都有氧化能力的菌種尋找適合工業(yè)化生產(chǎn)、得率高的發(fā)酵條件和轉(zhuǎn)化條件第58頁,共129頁，2024年2月25日，星期天單一二元酸合成麝香型香料藥物的反應(yīng)路線正構(gòu)烷烴的蒸餾用單管精餾塔對錦西石油六廠出品的12-18碳的混合油為原料進(jìn)行精餾，收集各種單一純烷烴，純度在95%以上，回收率在80%左右。單一長鏈二元酸生產(chǎn)菌株的篩選和轉(zhuǎn)化工藝熱帶假絲酵母多倍體誘變育種N-26號(hào)0.2%秋水仙堿28度振蕩48h多次分離獲得的穩(wěn)定菌株亞硝基胍0度處理40分鐘高產(chǎn)突變株第59頁,共129頁，2024年2月25日，星期天獲得的多倍體高產(chǎn)突變株十五碳二元酸最高產(chǎn)量可達(dá)77.2g/L,油的轉(zhuǎn)化率在60%以上。休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化工藝第60頁,共129頁，2024年2月25日，星期天正構(gòu)烷烴發(fā)酵二元酸的調(diào)節(jié)過量的尿素對酵母的氧化酶系、異檸檬酸脫氫酶、異檸檬酸裂解酶、琥珀酸脫氫酶以及過氧化物酶有顯著促進(jìn)，對氧化酶有顯著抑制。第61頁,共129頁，2024年2月25日，星期天用單一長鏈二元酸化學(xué)合成麝香型香料麝香T（十三碳二羧酸乙二醇酯）合成第62頁,共129頁，2024年2月25日，星期天經(jīng)濟(jì)效果及其意義由正構(gòu)烷烴生產(chǎn)單一長鏈二元酸合成麝香類物質(zhì)的研究工作開始于1972年，到80年代已經(jīng)成熟。其獨(dú)特之處在于：菌種產(chǎn)酸率高：通過多倍體誘變育種獲得的菌株對奇數(shù)和偶數(shù)烷烴都有很強(qiáng)的氧化產(chǎn)酸能力。休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化工藝操作簡便，產(chǎn)品純度高單一長鏈二元酸用途廣泛，富有生命力（1）過去都要從油篩油脂中提取短碳化合物，再將碳鏈接長，不僅工藝復(fù)雜，而且需要大量溶劑及有毒物質(zhì)，不適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。（2）轉(zhuǎn)化方法優(yōu)于天然原料的化學(xué)合成，附加值高第63頁,共129頁，2024年2月25日，星期天采用單管式和多管式填料精餾塔在減壓條件下先分餾得到各種餾分正烷烴，然后再按需要分別發(fā)酵生產(chǎn)不同長度的單一二元酸正構(gòu)烷烴發(fā)酵生產(chǎn)長鏈二元酸長鏈二元酸的來源（1）植物油裂解制?。?）化工方法合成制取化學(xué)氧化時(shí)正烷烴發(fā)生斷鏈得不到和正烷烴相應(yīng)鏈長的單一二元酸，所以很難用化工方法從石油中的正構(gòu)烷烴直接氧化制取。（3）生物工程技術(shù)生產(chǎn)微生物具有一種特異的氧化能力，通過胞內(nèi)酶的作用，可在常溫常壓下，氧化石油中的正構(gòu)烷烴的兩端兩個(gè)甲基，一步加上4個(gè)氧原子，生成與基質(zhì)正烷烴相應(yīng)鏈長的各種長鏈二元酸；此外微生物也能氧化脂肪族醇、酸和酯，生成相應(yīng)鏈長的飽和或不飽和二元酸。第64頁,共129頁，2024年2月25日，星期天國內(nèi)外長鏈二元酸的研究概況基礎(chǔ)理論研究階段：1970年以前，W-氧化應(yīng)用研究階段：從正烷烴制取長鏈二元酸的研究有了新的突破，進(jìn)入了應(yīng)用研究階段。工業(yè)生產(chǎn)階段：20世紀(jì)80年代以后生產(chǎn)菌株的誘變篩選C10以上的長鏈二元酸，天然存在的少，化工上難以合成所有野生菌株都難以積累和基質(zhì)鏈長相同的長鏈二元酸，它們的氧化能力，即對二元酸的降解能力太強(qiáng)。菌種誘變（1）亞硝基胍（2）紫外線照射處理（3）亞硝酸鈉處理（4）多倍體誘變育種第65頁,共129頁，2024年2月25日，星期天（5）N+離子注入誘變處理（6）構(gòu)建基因工程菌菌種篩選代謝調(diào)控微生物氧化正烷烴生產(chǎn)二元酸是胞內(nèi)酶的作用。B氧化的抑制：丙烯酸，尿素W氧化的促進(jìn)作用：青霉素引起細(xì)胞膜透性的變化；苯巴比妥和巴比妥酸鈉、維生素B12和吐溫等對提高二元酸的產(chǎn)量有較好促進(jìn)作用。擴(kuò)試和中試第66頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第67頁,共129頁，2024年2月25日，星期天工業(yè)生產(chǎn)試驗(yàn)和工業(yè)化生產(chǎn)長鏈二元酸發(fā)酵的特點(diǎn)四相體系發(fā)酵：菌體、空氣、烴類、水需要氧和發(fā)熱量大長鏈二元酸在水中溶解度小第68頁,共129頁，2024年2月25日，星期天發(fā)酵工藝和條件攪拌速度pH控制溶解氧罐壓控制溫度控制補(bǔ)料二元酸的分離提取方法水中沉淀結(jié)晶醇中沉淀結(jié)晶溶劑中沉淀結(jié)晶有待解決的問題理論研究和應(yīng)用研究通過基因工程方法構(gòu)建氧化阻斷型和W氧化擴(kuò)大型工程菌，再通過發(fā)酵過第69頁,共129頁，2024年2月25日，星期天程的計(jì)算機(jī)優(yōu)化控制，進(jìn)一步提高二元酸產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本仍是努力方向。生產(chǎn)研究（1）發(fā)酵罐的放大（2）能源的消耗問題（3）價(jià)廉高效的乳化劑第70頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第六章組合生物合成定義在微生物次生代謝產(chǎn)物生物合成基因和酶學(xué)研究基礎(chǔ)上形成的，對許多參與次生代謝生物合成的單個(gè)分開的具明顯的功能區(qū)域所組成的多酶體系進(jìn)行替換、阻斷、重組等均有可能改變生物合成途徑而產(chǎn)生新的代謝旁路，形成新的化合物，設(shè)R為可利用的基因數(shù)，N為每個(gè)基因的不同等位形式，從理論上講可得到RN個(gè)化合物。例子放線紫紅素生物合成的C6位的羥基化酶基因在曼得霉素產(chǎn)生菌異源宿主菌中獲得了表達(dá)，將原榴菌素吡喃環(huán)H原子立體構(gòu)型變成放線紫紅素中吡喃環(huán)的手性構(gòu)型。將碳霉素產(chǎn)生菌異戊酰基轉(zhuǎn)移酶克隆至螺旋毒素產(chǎn)生菌，報(bào)道獲得了4``-異戊酰螺旋霉素化合物,日本學(xué)者將該基因克隆至泰洛菌素產(chǎn)生菌，產(chǎn)生4``-異戊酰泰洛菌素。結(jié)構(gòu)不同、但生物合成途徑相似的抗生素生物合成基因之間，可以進(jìn)行重組、組合或互補(bǔ)產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)的化合物第71頁,共129頁，2024年2月25日，星期天對一些次級代謝產(chǎn)物生物合成酶系結(jié)構(gòu)和功能的深入研究及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得有可能對這些多酶體系進(jìn)行重組改造及協(xié)調(diào)，促使組合生物合成這一創(chuàng)制新化合物的新技術(shù)得到了較大的發(fā)展。第72頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第73頁,共129頁，2024年2月25日，星期天組合生物合成的基本原理組合生物合成是建立在天然產(chǎn)物生物合成的基礎(chǔ)之上的。聚酮合酶的結(jié)構(gòu)與組成（1）聚酮類化合物從結(jié)構(gòu)上分芳香族、大環(huán)內(nèi)酯類、多烯類、聚醚類和安莎類，具有重要的生物活性，包括抗細(xì)菌、抗結(jié)核、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒、抗蟲以及免疫抑制作用。（2）它們均以低級脂肪酸為起始單位，由聚酮合酶催化，經(jīng)過類似于脂肪酸合成的碳鏈B氧化過程，再經(jīng)過環(huán)化和環(huán)化后的修飾而形成的。（3）PKSI為模塊式結(jié)構(gòu)，含有多拷貝的活性位點(diǎn)，催化大環(huán)內(nèi)酯類、聚醚類、多烯類及安莎類的生物合成；PKSII有與PKSI類似的活性位點(diǎn)，但是分散在幾個(gè)較小的單功能的多肽上，催化柔紅霉素等芳香族化合物的生物合成。第74頁,共129頁，2024年2月25日，星期天

每個(gè)單元至少含有B-酮酰基硫酯合成酶(KS)、?；D(zhuǎn)移酶(AT)、酰基載體蛋白域(ACP)，某些單元中至少還有特異性組合的酮基還原酶(KR)、脫水酶(DH)、烯醇還原酶(ER)和硫酯酶(TE)。

DEBS3的C端有TE域參與14碳鏈聚酮體的完成及環(huán)化，形成6-脫氧內(nèi)酯。第75頁,共129頁，2024年2月25日，星期天由編碼PKS的3個(gè)閱讀密碼框架組成，它們是KS、ACP和CLF，在生物合成芳香族化合物中它們重復(fù)被使用。此外還含有KR、芳香化酶、環(huán)化酶的參與。第76頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第77頁,共129頁，2024年2月25日，星期天二、聚酮合酶結(jié)構(gòu)的特異性和專一性

DEBS1單獨(dú)或以DEBS1C端部分ACP與DEBS3單元6中的ACP6和TE融合構(gòu)建DEBS1+TE，均能在Scoelicolor中表達(dá)產(chǎn)生三酮體（1和2）。在Scoelicolor中也可以乙酸為起始單位形成化合物2。DEBS3在Scoelicolor中表達(dá)化合物3。DEBS1+單元3+TE的系統(tǒng)在Scoelicolor中可表達(dá)形成化合物4和5。將單元6中ACP6與單元5中KR5融合+TE，去掉單元6，可形成12環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯化合物6。第78頁,共129頁，2024年2月25日，星期天三、聚酮多酶體系的特異性1起始單位底物特異性DEBS的AT-ACP荷載域?qū)Φ孜锏奶禺愋杂休^大的寬容性，如果將整個(gè)ATL或ATL-ACPL域去掉，仍能產(chǎn)生6-dEB和衍生的紅霉素，利用這一特點(diǎn)，可以改變起始單位以合成不同的衍生物，如以阿維菌素合成的起始單位異丁酸或2-甲基丁酸可以合成新的三酮體，同樣將阿維菌素ATL-ACPL域替代紅霉素的AT-ACP可以產(chǎn)生以異丁酸或2-甲基丁酸為起始物的紅霉素衍生物。第79頁,共129頁，2024年2月25日，星期天2聚酮鏈延伸單位的底物特異性APKS單元中AT底物特異性PKS單元中各個(gè)AT域?qū)Φ孜镉邢喈?dāng)嚴(yán)格的結(jié)構(gòu)和立體構(gòu)型的要求，僅識(shí)別（2S）-甲基丙二酰CoA，成為聚酮體合成的守門員，控制聚酮鏈延伸單位的合成。第80頁,共129頁，2024年2月25日，星期天利用AT域?qū)Φ孜锏奶禺愋钥梢栽诓煌股厣a(chǎn)菌的PKS中進(jìn)行互換、替代產(chǎn)生新的化合物，如用帕雷霉素PKS中識(shí)別丙二酰CoA底物的AT2替代紅霉素DEBS1+TE系統(tǒng)的AT1組成雜合單元1在Scoelicolor中可以產(chǎn)生新的化合物14和15，同樣用雷帕霉素AT14替代DEBSPKSAT1和AT2，在紅霉素產(chǎn)生菌中則產(chǎn)生系列去甲基紅霉素（16），12-去甲基紅霉素B（17）和10-去甲基紅霉素A（18），同樣用雷帕霉素AT2替代DEBSAT6在Scoelicolor中也產(chǎn)生2-去甲基衍生的紅霉內(nèi)酯（19，20）第81頁,共129頁，2024年2月25日，星期天B?；d體蛋白域?qū)Φ孜餆o特異性C酮基縮合酶的底物特異性將DEBS中KR5或ER4域去掉可以形成5-酮（21）和6，7-脫水的6-dEB紅霉內(nèi)酯衍生物，說明KS6均能接受天然B-羥基-6-酮基底物非還原型B-酮?；绑w。由于DEBSKS2對底物的特異性要求不專一，因此有可能進(jìn)行前體定向的生物合成。加入正常甲基丙二酰NAC可形成6-dEB，加入二酮體模擬物-NAC甲基丙二酰不同衍生物（23，24，25），在DEBS:（KS1缺失）介導(dǎo)下，在Scoelicolor中可形成不同6-dEB。第82頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第83頁,共129頁，2024年2月25日，星期天酮基還原酶KR的底物特異性KR域?qū)Φ孜锏囊筝^寬容，它可以接受許多非天然底物。B-酮?；?ACP還原所生的羥基的D-或L-取決于每個(gè)KR域所在的性質(zhì)。在DEBS1+單元3+TE系統(tǒng)如將KR5替代KR2所得三酮體的立體構(gòu)型是一樣的，但如果用RAPSKR2替代DEBSKR2則產(chǎn)生3R三酮體化合物。硫酯酶底物特異性DEBS中TE通常在單元6的C末端催化六酮體C-13羥基與?；?ACP硫酯羰基反應(yīng)，形成成熟的聚酮體14元環(huán)的6-dEB內(nèi)酯。TE對聚酮體的結(jié)構(gòu)也有一定的寬容性。對于PKSI型多酶體系中單元酶系的研究，使人們在設(shè)計(jì)基因組合中能夠比較有針對性。一般來講?；D(zhuǎn)移酶荷載域有較廣的底物寬容性，在此基礎(chǔ)上可進(jìn)行前體定向組合生物合成；延伸單位?；D(zhuǎn)移酶底物特異性要求嚴(yán)格；縮合酶對底物的識(shí)別程度與某些功能基團(tuán)的存在位置有關(guān)；酮基還原酶、脫水酶、烯醇還原酶可以接受許多不同于天然的產(chǎn)物；ACP域?qū)μ烊换蚍翘烊坏闹虚g體無差異；硫酯酶可以在6至16元環(huán)中起作用，對底物的立體構(gòu)型有較高要求。第84頁,共129頁，2024年2月25日，星期天四PKS模塊間的相互作用傳統(tǒng)手段的組合生物合成產(chǎn)物的產(chǎn)率往往比較低：基因重組蛋白的穩(wěn)定性基因重組蛋白介導(dǎo)產(chǎn)物的產(chǎn)率化學(xué)的構(gòu)象上游基因重組產(chǎn)生的中間體是否被下游基因單元繼續(xù)后加工等問題第85頁,共129頁，2024年2月25日，星期天

從上述序列可知，在ACP保守域C端和下一單元KS域N端有一段不同的序列，單元間模塊M2和M3、M4和M5為非共價(jià)結(jié)合，而其他相鄰的兩者之間均為共價(jià)結(jié)合，連接序列有明顯不同，單元間連接序列較短；上游單元N端和下游單元C端連接序列較長。連接序列在異源基因表達(dá)中起重要的作用第86頁,共129頁，2024年2月25日，星期天連接序列可能影響組合生物合成產(chǎn)物的產(chǎn)量（1）DEBS基因M5中AT5+苦霉素pikKR5+苦霉素M6+TE產(chǎn)生3mg/mL（2）將pikACP5pikKS6之間的198bp片段去掉，化合物產(chǎn)量下降5-7倍第87頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)組合生物合成的基因操作通過不同的基因組合操作可以產(chǎn)生新的化合物第88頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第89頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第90頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第91頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第92頁,共129頁，2024年2月25日，星期天（1）整個(gè)單元操作改變聚酮體鏈的長度：去掉特定的PKSI中的結(jié)構(gòu)域的單個(gè)ORF可以改變鏈長，利用異源單元可以增加聚酮體的多樣性（2）替代菏載域LD改變生物合成起始單位：用異源LD域替代原LD域例：利福霉素產(chǎn)生菌突變體當(dāng)加入HBA-3-羥基苯甲酸和DHBA-3,5-二羥基苯甲酸,可以合成新的四酮體.

雷帕霉素突變株加入脯氨酸可形成雷帕霉素衍生物第93頁,共129頁，2024年2月25日，星期天（3）前體定向生物合將DEBS單元1的KS1缺失，KS2可識(shí)別新的前體，合成新化合物，由新的前體介導(dǎo)的生物合成稱為前體定向生物合成（4）AT域的互換不同的AT域識(shí)別不同的延伸單位，相互替代或置換AT域可以產(chǎn)生新的化合物。（5）B碳鏈延伸域修飾的操作KR、DH、ER的缺失可導(dǎo)致紅霉素衍生物的產(chǎn)生，引入還原域也可形成產(chǎn)物的多樣性。（6）單元連接序列的操作基因組合生物合成中間體在非天然單元之間傳遞時(shí)的可容納性，在單元間及單元內(nèi)的連接序列進(jìn)行操作。（7）對聚酮體進(jìn)行后修飾糖苷化聚酮體只有被引入羥基、羰基、雙鍵等結(jié)構(gòu)，與脂肪酸、氨基酸進(jìn)行?；?，或進(jìn)行O-、N-、C-甲基化，或聚酮體糖苷化后才具有生物活性第94頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第95頁,共129頁，2024年2月25日，星期天例：將合成與四環(huán)素類似結(jié)構(gòu)的聚酮體基因蔟克隆至含有D-橄欖酸基因產(chǎn)生菌S.fradiae，可產(chǎn)生糖苷化的四環(huán)素。將megosamine合成基因簇克隆至紅霉素產(chǎn)生菌，可以產(chǎn)生巨霉素第96頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第97頁,共129頁，2024年2月25日，星期天酮酯類化合物對大環(huán)內(nèi)酯耐藥菌比較有效，C12位羥基化是酮內(nèi)酯進(jìn)一步被肼基取代的必要過程（8）體外表達(dá)系統(tǒng)DEBS1+TE、DEBS1+單元3+TE或DEBS3+TE系統(tǒng)均能在體外合成相應(yīng)產(chǎn)物，而且可以接受兩種構(gòu)型的底物形成兩種構(gòu)型的化合物。第98頁,共129頁，2024年2月25日，星期天組合生物合成的表達(dá)系統(tǒng)載體系統(tǒng)第99頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第100頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第101頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第102頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第103頁,共129頁，2024年2月25日，星期天其他較新的聚酮類化合物基因簇及進(jìn)行基因組合生物合成的可能性1埃波霉素基因簇含有9個(gè)單元PKS、22個(gè)開放閱讀密碼框和1個(gè)非核糖體肽合成酶組成用基因突變或缺失可進(jìn)行埃波霉素的改造，如使2MT域缺失，可以獲得4-單甲基依普希隆。第104頁,共129頁，2024年2月25日，星期天2拉伐他汀基因簇由兩個(gè)PKSI型酶、拉伐他汀的九酮體合成酶和二酮體合成酶組成。第105頁,共129頁，2024年2月25日，星期天3海洋微生物中的PKS基因海洋微生物中分離到產(chǎn)生腸菌素和wailupemycin兩種三維結(jié)構(gòu)的聚酮體化合物。第106頁,共129頁，2024年2月25日，星期天非核糖體多肽合成酶類型基因組合生物合成許多具生物活性、分子量較小的多肽的合成是由非核糖體多酶體系介導(dǎo)。NRPS是由四種以上多功能酶組成，包括活化、起始、延伸、終止。NPRS首先將氨基酸活化為腺嘌呤核苷酸，然后將氨基酸縮合至酶的SH基團(tuán)，再逐步聚合成多肽。最后由硫酯酶環(huán)化和從酶系中將肽鏈釋放。第107頁,共129頁，2024年2月25日，星期天微囊藻素生物合成基因簇由10個(gè)ORF組成，6個(gè)多功能酶負(fù)責(zé)前體的摻入，生物合成過程有非通常功能的酶的參與，因而形成一些特殊的結(jié)構(gòu)。第108頁,共129頁，2024年2月25日，星期天組合生物合成存在的問題多酶體中經(jīng)組合的前一酶系所產(chǎn)生的中間體有時(shí)不能被下一酶系所接受，影響了終產(chǎn)物的形成。宿主的限制修飾系統(tǒng)產(chǎn)物的后修飾需要綜合考慮基因組合改變原來酶系對底物的特異性和對新產(chǎn)物后修飾酶的可塑性生物學(xué)與化學(xué)的有機(jī)組合鏈霉菌的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)尚未成熟發(fā)展體外蛋白系統(tǒng)廣泛的開發(fā)基因資源第109頁,共129頁，2024年2月25日，星期天第七章胡蘿卜素的生物合成胡蘿卜素生物合成的基因工程胡蘿卜類色素廣泛分布于藻類、植物和一些細(xì)菌包括藍(lán)細(xì)菌，已知結(jié)構(gòu)的胡蘿卜素已經(jīng)超過600多個(gè)，其主要用途是作為維生素A的營養(yǎng)源、動(dòng)物飼料色素、化妝品等，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)具有抑癌活力和防止慢性疾病功能。第110頁,共129頁，2024年2月25日，星期天生物合成途徑的基因和酶迄今為止，已經(jīng)有150個(gè)以上的基因，編碼24個(gè)不同crt酶已從細(xì)菌、植物、藻類和真菌分離。第111頁,共129頁，2024年2月25日，星期天利用已經(jīng)克隆出來的合成基因可以在重組微生物中構(gòu)建一系列的胡蘿卜素。為了擴(kuò)大結(jié)構(gòu)不同的胡蘿卜素，將不同的合成基因進(jìn)行組合后在E.coli中進(jìn)行表達(dá)將合成胡蘿卜素前體的另一個(gè)途徑的基因，包括參與IDP合成的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶和idi在E.coli中過量表達(dá)，B-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)可達(dá)到1.5mg/g干重。第112頁,共129頁，2024年2月25日，星期天微藻酮基胡蘿卜素的產(chǎn)生（1）Phaffiar