水中嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法 酶底物定量法

2水中嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法酶底物定量法本文件描述了水中嗜肺軍團(tuán)菌酶底物定量檢驗(yàn)法。本文件適用于冷卻水、冷凝水和沐浴用水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢驗(yàn)，其他水質(zhì)檢驗(yàn)可參考本文件進(jìn)行。本方法定量限為1MPN/100mL。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18204.5公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法第5部分：集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)GB/T18204.6公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法第6部分：衛(wèi)生監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1嗜肺軍團(tuán)菌LegionellaPneumophila軍團(tuán)菌目、軍團(tuán)菌科、軍團(tuán)菌屬中的一種桿菌。注：菌體大小為（0.3～0.4）μm×（2～3）μm。無(wú)莢膜，無(wú)芽孢，有端生鞭毛，革蘭染色陰性，常呈梭形3.2最可能數(shù)mostprobablenumber；MPN稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)一種基于泊松分布的間接計(jì)數(shù)方法。注：利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，根據(jù)一定體積不同稀釋度樣品經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的4方法原理該方法基于一種細(xì)菌酶檢驗(yàn)技術(shù)，嗜肺軍團(tuán)菌利用培養(yǎng)基中豐富的氨基酸、維生素和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)迅速地生長(zhǎng)，經(jīng)分解代謝作用與培養(yǎng)基中的酶底物發(fā)生反應(yīng)使溶液渾濁或顯褐色。5培養(yǎng)基與試劑5.1酶底物法培養(yǎng)基5.1.1成分N-氨基甲酰甲基乙磺酸緩沖液（ACES）10.0g酵母膏3.5g硫酸鎂0.35g丙酮酸鈉0.45g3氨基酸硫代硫酸鈉二氯化錳抗生素4.70.007 0.030.35gggg5.1.2制法將以上成分按比例溶解在1000mL無(wú)菌水中，121℃高壓滅菌15min。5.2預(yù)處理液的配制稱取2.04g雷伯環(huán)衍生物有機(jī)酸加入100mL無(wú)菌水中混勻。5.3硫代硫酸鈉溶液的配制稱取26g硫代硫酸鈉（Na2S2O3?5H2O）溶液（或16g無(wú)水硫代硫酸鈉），溶于1L水中，并加熱煮沸10min，冷卻，過(guò)濾后避光備用。5.4BCYE培養(yǎng)基5.4.1成分N-2-乙酰氨基-2-酰氨基乙烷磺酸（ACES）緩沖液10.0g氫氧化鉀2.8g活性炭2.0g酵母提取物（細(xì)菌級(jí)）10.0gα-酮戊二酸鉀鹽1.0g瓊脂12.0gL-半胱氨酸鹽酸鹽-水合物0.4g焦磷酸鐵（III）0.25g水1000mL5.4.2制法5.4.2.1將0.4gL-半胱氨酸鹽酸鹽-水合物加到10mL水中。通過(guò)孔徑為0.22μm的膜過(guò)濾器過(guò)濾，對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾滅菌。5.4.2.2將0.25g焦磷酸鐵（III）加到10mL水中。通過(guò)孔徑為0.22μm的膜過(guò)濾器過(guò)濾，對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾滅菌。5.4.2.3將10gN-2-乙酰氨基-2-酰氨基乙烷磺酸（ACES）緩沖液添加到含500mL水的容器中，于45℃~50℃的水浴中溶解。用0.1mol/L氫氧化鉀溶液和0.1mol/L硫酸溶液，將ACES緩沖溶液的pH調(diào)至6.8±0.1。5.4.2.4將2.8g氫氧化鉀添加到480mL水中，并輕輕搖動(dòng)使其溶解。5.4.2.5混合5.4.2.3、5.4.2.4中的兩種溶液，并依次添加2g活性炭、10g酵母提取物和1gα-酮戊二酸鉀鹽，每次添加之間要充分混合。加入瓊脂，充分混合并在121℃高壓滅菌15min后，在水浴中冷卻至（50±2）℃。5.4.2.6無(wú)菌添加L-半胱氨酸（5.4.2.1）和焦磷酸鐵（III）溶液（5.4.2.2），每次添加之前應(yīng)充分混合。在25℃下培養(yǎng)基的pH應(yīng)為6.8±0.2。5.5BCYE-cys培養(yǎng)基該培養(yǎng)基應(yīng)按照5.4進(jìn)行制備，但不添加L-半胱氨酸鹽酸鹽-水合物。5.6無(wú)菌水使用符合三級(jí)水要求的實(shí)驗(yàn)用水，經(jīng)121℃高壓滅菌15min備用。5.7標(biāo)準(zhǔn)菌株陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株：嗜肺軍團(tuán)菌（CICC24883/ATCC33152或其它同類菌株）；4陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株：糞腸球菌（CICC10396/ATCC29212或其它同類菌株）。6儀器設(shè)備6.1高壓蒸汽滅菌器：121℃（0.10MPa～0.12MPa）。6.2干熱滅菌器（烤箱）：60℃~80℃、160℃~180℃。6.3生化培養(yǎng)箱或恒溫恒濕培養(yǎng)箱：36℃±1℃。6.4CO2培養(yǎng)箱：CO2濃度為2.5%、36℃±1℃。6.5三角瓶：帶蓋的無(wú)菌玻璃瓶或者聚乙烯瓶。6.6采樣瓶（含硫代硫酸鈉）：含0.1mol/L硫代硫酸鈉（Na2S2O3）的無(wú)菌廣口玻璃瓶或者聚乙烯瓶。6.7程控定量封口機(jī)。6.8定量盤(pán)：定量培養(yǎng)用無(wú)菌塑料盤(pán)，含96個(gè)孔穴，其中6個(gè)大孔（13.7mL/大孔90個(gè)小孔（0.2mL/小孔）。6.9定量盤(pán)橡膠襯墊：與96孔定量盤(pán)配套使用。6.10吸管：1mL、10mL無(wú)菌玻璃吸管或可調(diào)式移液管。6.11試管：5mL或10mL無(wú)菌帶蓋玻璃試管或者離心管。6.12量筒：100mL±1mL。6.13生物安全柜。7樣品的采集7.1采樣瓶的準(zhǔn)備與滅菌采樣瓶準(zhǔn)備時(shí)應(yīng)添加硫代硫酸鈉溶液（5.3）消除活性氯對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌的干擾。將濃度為0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液與擬采集水樣體積按照1∶1000的比例加入采樣廣口玻璃瓶中，于160℃~180℃干熱滅菌2h，或用高壓蒸汽滅菌器，121℃高壓滅菌15min。干熱滅菌的采樣瓶應(yīng)在兩周內(nèi)使用；濕熱滅菌的采樣瓶如不能立即使用，應(yīng)于60℃烤箱內(nèi)將瓶?jī)?nèi)冷凝水烘干，兩周內(nèi)使用。7.2樣品采集按照GB/T18204.5的要求采集冷卻水和冷凝水，冷卻水樣品采集應(yīng)在距冷卻塔壁20cm、液面下10cm處，冷凝水樣品采集應(yīng)在排水管或冷凝水盤(pán)處；按照GB/T18204.6的要求采集沐浴用水，沐浴用水樣品采集應(yīng)隨機(jī)選擇5個(gè)沐浴噴頭；在沐浴池選擇3個(gè)采樣點(diǎn)，采集水面下30cm處水樣。每個(gè)采樣點(diǎn)依無(wú)菌操作取樣500mL。7.3樣品運(yùn)輸與保存樣品應(yīng)在常溫條件下避光保存，并在48h內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展檢驗(yàn)。8檢驗(yàn)步驟8.1稀釋根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，將樣品稀釋至可計(jì)數(shù)濃度范圍。稀釋方法：以無(wú)菌操作方法吸取10mL充分混勻的水樣，加入到含有90mL無(wú)菌水的三角瓶中，混勻成1∶10的稀釋液，按照同法遞增稀釋，每稀釋一個(gè)濃度梯度，更換一支10mL吸管。8.2接種8.2.1取100mL配制好的酶底物法培養(yǎng)基到無(wú)菌三角瓶中備用。8.2.2取2mL預(yù)處理液到無(wú)菌試管中。8.2.3將2mL水樣原液和/或稀釋液分別加到含有2mL預(yù)處理液的試管中，混勻,于常溫下靜置（60±5）s，靜置結(jié)束前再次混勻試管內(nèi)液體，并立即取2mL加到100mL酶底物法培養(yǎng)基（8.2.1）中混勻。8.2.4將8.2.3三角瓶中的液體全部加到96孔定量盤(pán)中，以手撫平96孔定量盤(pán)背面，趕除孔內(nèi)氣泡后用程控定量封口機(jī)封口。觀察96孔定量盤(pán)顏色，若出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照顏色相同，應(yīng)終止試驗(yàn)或重新操作。58.3培養(yǎng)將96孔定量盤(pán)紙面向下放置于36℃±1℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，且培養(yǎng)箱中水盤(pán)避免干涸。8.4對(duì)照試驗(yàn)8.4.1空白對(duì)照制備1個(gè)100mL無(wú)菌水樣品，按照8.2和8.3的步驟進(jìn)行操作。培養(yǎng)后的96孔定量盤(pán)應(yīng)無(wú)任何顏色或濁度變化。8.4.2陰性對(duì)照制備1個(gè)（103～104）CFU/mL的100mL糞腸球菌菌懸液，按照8.2和8.3的步驟進(jìn)行操作。培養(yǎng)后的96孔定量盤(pán)應(yīng)無(wú)任何顏色或濁度變化。8.4.3陽(yáng)性對(duì)照制備1個(gè)（102～103）CFU/mL的100mL嗜肺軍團(tuán)菌菌懸液，按照8.2和8.3的步驟進(jìn)行操作。培養(yǎng)后的96孔定量盤(pán)應(yīng)顯褐色或濁度大于空白對(duì)照。9檢驗(yàn)結(jié)果9.1未檢出將培養(yǎng)7d后的定量盤(pán)取出觀察。如所有孔穴內(nèi)水樣的顏色與濁度和空白對(duì)照無(wú)差異，可直接報(bào)告結(jié)果。結(jié)果報(bào)告為“未檢出/100mL”。9.2檢出如孔穴內(nèi)的水樣有顯褐色或者濁度大于空白對(duì)照的，則表示該孔穴中含有嗜肺軍團(tuán)菌。記錄所有顯褐色或有濁度變化的孔穴數(shù)量，對(duì)照附錄A中表A.1，查出其代表的嗜肺軍團(tuán)菌最可能數(shù)（MPN）。并按照公式（1）進(jìn)行嗜肺軍團(tuán)菌濃度計(jì)算，結(jié)果采用兩位有效數(shù)字的科學(xué)計(jì)數(shù)法表示，單位為MPN/100mL。c=MPN值×100×b 式中：c--嗜肺軍團(tuán)菌濃度，單位為MPN/100mL；MPN值--96孔定量盤(pán)陽(yáng)性孔數(shù)查表所得結(jié)果；b--接種樣品的稀釋倍數(shù)。9.3菌型確定如需對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行菌型確定，可按照附錄B進(jìn)行操作。10質(zhì)量控制10.1每批樣品應(yīng)進(jìn)行空白對(duì)照試驗(yàn),并使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行陽(yáng)性和陰性對(duì)照試驗(yàn)（8.4）。10.2按照質(zhì)控要求，定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株/質(zhì)控樣品進(jìn)行質(zhì)量控制。11生物安全嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)應(yīng)按照三類病原微生物的生物安全要求進(jìn)行管理。（規(guī)范性）96孔定量盤(pán)MPN表96孔定量盤(pán)MPN表見(jiàn)表A.1。表A.196孔定量盤(pán)MPN表0123456012345678901234568（資料性）菌型確定菌型確定按如下步驟進(jìn)行：a)用75%酒精擦拭定量盤(pán)背面顯褐色或