抗氧化活性研究方法

關(guān)于抗氧化活性研究方法目錄一.檢測(cè)抗氧化活性的原因二.自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性三.檢測(cè)方法四.DPPH法（原理，一般方法，酶標(biāo)法）五.ABTS法六.TBARS法七.鐵離子還原能力(FRAP)第2頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天一.檢測(cè)抗氧化活性的原因

1.天然植物中許多化學(xué)物質(zhì)具有抗氧化活性2.抗氧化劑有延緩衰老等功效，越來(lái)越受到人們關(guān)注3.據(jù)文獻(xiàn)記齊墩果酸型三萜有較好的抗氧化活性4.抗氧化活性測(cè)試簡(jiǎn)單，快捷，經(jīng)濟(jì)第3頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天

二.自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性抗氧化劑自由基對(duì)人體造成的傷害天然植物第4頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天三.檢測(cè)方法目前常用的抗氧化活性檢測(cè)方法主要基于以下機(jī)理：(1)在特定條件下，樣品對(duì)檢測(cè)體系中脂類物質(zhì)的氧化抑制能力反映被測(cè)物的抗氧化活性；（TBARS法）(2)在特定條件下，樣品對(duì)檢測(cè)體系中自由基的清除能力反映被測(cè)物的抗氧化活性；（DPPH自由基的清除）(3)在特定條件下，測(cè)定樣品的還原能力反映被測(cè)物的抗氧化活性。（還原Fe3+）

第5頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天四.DPPH法1.原理

DPPH(二苯代苦味?；杂苫?是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基。

特點(diǎn)：醇溶液呈紫色，波長(zhǎng)為517nm下具有最大吸收。具有單一電子，故能接受一個(gè)電子或氫離子，有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的單電子被捕捉而使其顏色變淺，在最大光吸收波長(zhǎng)處的吸光值下降,吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，從而以評(píng)價(jià)試驗(yàn)樣品的抗氧化能力。此抗氧化能力用抑制率來(lái)表示，抑制率越大，抗氧化性越強(qiáng)。第6頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)步驟

2.實(shí)驗(yàn)步驟

（1）酶標(biāo)法檢測(cè)——酶標(biāo)儀取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各孔分別加入150μmol·L-1的DPPH溶液180μL,各濃度梯度樣品溶液20μL,終濃度分別為3.9~500μmol·L-1，反應(yīng)總體積200μL,以溶劑作對(duì)照。加樣后，振蕩混勻。封板膠封板后，室溫下避光靜置。分別在10~120min時(shí)間范圍內(nèi)于517nm處測(cè)定各孔吸光度值。觀察樣品抗DPPH的時(shí)效量效變化過(guò)程，確定實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和最佳實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間。計(jì)算公式為:清除率(％)=[A(溶劑)-A(樣品)]/A（溶劑）x100％第7頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天VitE清除DPPH自由基抗氧化量效曲線10-120min內(nèi),隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)VitE抗DPPH作用增強(qiáng)，但在3.9-31.2μmol·L-1范圍內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn)的藥效變化不明顯，62.5-500μmol·L-1濃度范圍，隨著濃度增加，各時(shí)間點(diǎn)的藥物作用曲線逐漸分離，并在500μmol·L-1，各時(shí)間點(diǎn)量效趨于平穩(wěn)。從圖中可以看出，在這些時(shí)間點(diǎn)中，30min的量效曲線基本呈斜線上升。30min第8頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天VitE清除DPPH自由基抗氧化量效曲線

反應(yīng)時(shí)間t為30min的量效曲線（相關(guān)系數(shù)）第9頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)步驟（2）一般方法——紫外分光光度計(jì)法將樣品用甲醇配制成一系列濃度，取0.1mL樣品加入3.5mLDPPH甲醇溶液(0.06mmol/L)，混合30min后測(cè)定515nm處吸光度。每份樣品平行操作3次。

計(jì)算公式為:清除率(％)=[A(溶劑)-A(樣品)]/A（溶劑）x100％第10頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶標(biāo)法優(yōu)勢(shì)3.酶標(biāo)法優(yōu)勢(shì)

抗氧化微孔板實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)勢(shì)：①耗材量少，試劑量以微升計(jì)；②試劑種類少，部分試劑配制可交互使用；③方法簡(jiǎn)便，耗時(shí)短；④可重復(fù)性強(qiáng)，可以廣泛應(yīng)用于藥物篩選，特別是高通量藥物篩選研究。第11頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天五.ABTS法

1.原理以水溶性的ABTS+自由基引發(fā)劑為顯色劑。

特點(diǎn)：ABTS與過(guò)硫酸鉀反應(yīng)生成穩(wěn)定的藍(lán)/綠色陽(yáng)離子自由基ABTS+，最大吸光波長(zhǎng)為734nm。

向ABTS+其中加入被測(cè)物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，則該物質(zhì)會(huì)與ABTS+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，然后在ABTS+這種自由基的734nm吸光波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度的變化來(lái)反映物質(zhì)的抗氧化能力。第12頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)步驟

2.實(shí)驗(yàn)步驟將樣品用甲醇配制成一系列濃度,取0.15mL樣品加入2.85mLABTS自由基工作液，混合，放置10min后,在734nm處測(cè)定吸光度。每份樣品平行操作3次。計(jì)算公式為：清除率(％)=[A(溶劑)-A(樣品)]/A（溶劑）×100％A（溶劑）為2.85mLABTS溶液與0.15mL甲醇混合后的吸度，A（樣品）為2.85mLABTS溶液與0.15mL樣品混合后的吸光度。

第13頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天ABTS法優(yōu)缺點(diǎn)3.優(yōu)缺點(diǎn)

簡(jiǎn)便，快速，適合于大量樣品的檢測(cè)。

ABTS在與氫原子供體的反應(yīng)中選擇性差是此法的一個(gè)不足，它可與任何羥基化的芳香族化合物反應(yīng)，這與它們的實(shí)際抗氧化能力關(guān)，因此,TEAC值也包括對(duì)抗氧化不起作用的羥基。第14頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天六.TBARS法簡(jiǎn)介脂質(zhì)體系中氧化反應(yīng)抑制或中止的判斷主要通過(guò)測(cè)量被氧化物的濃度，氧的去除或氧化產(chǎn)物的形成。因此，反應(yīng)物(不飽和脂肪酸，自由基等)的消失，氧化產(chǎn)物的定量可能是判斷氧化階段的最合適方法。通過(guò)直接或者間接檢測(cè)氧的消失和自由基的電子自旋光譜，適用于氧化過(guò)程的初始階段。通常采用TBARS法來(lái)評(píng)價(jià)脂質(zhì)的過(guò)氧化.第15頁(yè),共17頁(yè)，2024年2月25日，星期天七.鐵離子還原能力(FRAP)原理

FRAP的原理是基于氧化還原反應(yīng)的比色法。在酸性條件下，F(xiàn)e3+一TPTA(Fe3+—三吡啶三嗪)被抗氧化劑還原成Fe2+一TPTZF，溶液變成深藍(lán)色，并且