細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題基礎(chǔ)篇-無(wú)菌操作基本技術(shù)1.實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)(laminarflow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%ethanol擦拭無(wú)菌操作抬面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70%ethanol擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。

2.無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70%ethanol擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣之非無(wú)菌區(qū)域操作。

3.小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

第2頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來(lái)自人類(lèi)或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無(wú)菌操作臺(tái)(至少ClassII)。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起aerosol之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5.定期檢測(cè)下列項(xiàng)目：

5.1.CO2鋼瓶之CO2壓力

5.2.CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤(pán)是否有污染(水盤(pán)的水用無(wú)菌水，每周更換)。

5.3.無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力，定期更換紫外線(xiàn)燈管及HEPA過(guò)濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000小時(shí)/HEPA)。

6.水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750)，定期更換水槽的水。第3頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天基礎(chǔ)篇-實(shí)驗(yàn)用品1.種類(lèi)︰

1.1.細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無(wú)菌，除了玻璃容器與pasteurpipet外，其它均為塑料無(wú)菌制品。

1.2.TC級(jí)培養(yǎng)盤(pán)表面均有coating高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類(lèi)有Tflask，plates,dishes,rollerbottle等，依實(shí)驗(yàn)需要使用。

1.3.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml

1.4.塑料離心管:15ml,50ml，均有2種不同材質(zhì)，其中polypropylene(PP)為不透明材質(zhì)，polystyrene(PS)為透明材質(zhì)，可依實(shí)驗(yàn)需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。

1.5.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。

1.6.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml,250ml,500ml,1000ml

第4頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.清洗︰

2.1.新購(gòu)玻璃血清瓶先以0.1~0.05NHCl浸泡數(shù)小時(shí)，洗凈后才開(kāi)始使用。

2.2.用過(guò)之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。

3.滅菌︰

3.1.實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃,15lb,20分鐘，置于oven中烘干。

3.2.實(shí)驗(yàn)用玻璃pasteurpipet以干熱滅菌170℃,4小時(shí)。

3.3.液體或是固體廢棄物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高壓滅菌121℃,15lb,20分鐘處理。第5頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天基礎(chǔ)篇-培養(yǎng)基1.液體培養(yǎng)基貯存于4℃冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在37℃水槽中溫?zé)帷?/p>

2.液體培養(yǎng)基(加血清)存放期為六個(gè)月，期間glutamine可能會(huì)分解，若細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，可以再添加適量glutamine。

3.粉末培養(yǎng)基配制(以1升為例)：

3.1.細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10%血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900ml，pH為7.2-7.4。NaHCO3為另外添加，若將NaHCO3粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會(huì)造成pH之誤差，或局部過(guò)堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2氣體調(diào)整pH，而非用強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿(NaOH)，因?yàn)槁入x子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基的pH易發(fā)生改變。

第6頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.2.材料：

純水(milli-Q水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要)，粉末培養(yǎng)基，NaHCO3，電磁攪拌器無(wú)菌血清瓶，0.1或0.2mm無(wú)菌過(guò)濾膜，pH計(jì)，真空泵，CO2氣體

3.3.步驟：

3.3.1.取粉末培養(yǎng)基溶于700mlmilli-Q水中，攪拌使其溶解。

3.3.2.稱(chēng)取適量之NaHCO3粉末溶于200mlmilli-Q水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2氣體至飽和，約3-5分鐘。

3.3.3.將溶解且含飽和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合?；旌笕芤褐畃H應(yīng)為7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可再通入CO2氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過(guò)過(guò)濾膜時(shí)，pH會(huì)升高0.1-0.2。

3.3.4.以0.1或0.2mm無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌，同時(shí)分裝至無(wú)菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類(lèi)、日期、瓶號(hào)等，貯存于4℃。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾)

3.3.5.配制之培養(yǎng)基配制須作生長(zhǎng)試驗(yàn)與污染測(cè)試。第7頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天附-配制培養(yǎng)基之生長(zhǎng)測(cè)試材料：

MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)

6-wellTCplate(or35mmTCdish)

methanol

glacialaceticacid

10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)步驟：

1.以待測(cè)試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCKcell，接種MDCK細(xì)胞于6-wellplate(或35mmTCdish)中，每個(gè)well接種1×102活細(xì)胞，同時(shí)作對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。

2.接種5～7天后，在100倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長(zhǎng)，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時(shí)即可。

3.去除培養(yǎng)基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇：冰醋酸﹦3:1)，室溫下靜置10min。

4.去除固定液，水洗二次。

5.加入1ml10%Giemsasolution，，室溫下靜置染色2-3min。

6.去除染液，水洗二次。

7.以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號(hào)的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，則丟棄之。第8頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天基礎(chǔ)篇-抗生素1.細(xì)胞庫(kù)之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素

1.1.培養(yǎng)自ATCC引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。

1.2.培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作tokenfreeze前培養(yǎng)基須添加抗生素，待tokenfreeze通過(guò)污染測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。

2.寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿(mǎn)整個(gè)flask時(shí)，則須添加抗生素(penicillin100units/ml+streptomycin100ug/ml)。

3.若要檢測(cè)mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin會(huì)抑制mycoplasma生長(zhǎng)。

第9頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方:penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin250ug/ml,bacitracin2.5units/ml，注意混合使用后藥物毒性會(huì)增強(qiáng)。

5.抗生素使用種類(lèi)與濃度：

工作濃度.儲(chǔ)存溫度.殺滅細(xì)菌

penicillin100units/ml-20℃G(+)bacteria

streptomycin100ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria

chlotetracycline50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria

gentamicin50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria,mycoplasma

amphotericinB2.5ug/ml-20℃yeastandmolds

nystatin50ug/ml-20℃yeastandmolds

fungizone2.5ug/ml-20℃yeastandmolds第10頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天基礎(chǔ)篇-血清1.血清必須貯存于–20～-70℃，若存放于4℃，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。如果一次無(wú)法用完一瓶，可將40～45ml分裝于無(wú)菌50ml離心管中，由于血清結(jié)凍時(shí)體積會(huì)增加約10%，必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。

2.一般廠商提供之血清為無(wú)菌，不需再無(wú)菌過(guò)濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾，勿直接過(guò)濾血清。

3.瓶裝(500ml)血清解凍步驟(逐步解凍法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50ml無(wú)菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。

第11頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.heat-inactivation是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份(complement)去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沈淀物之顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。補(bǔ)體參與之反應(yīng)有：cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsandplatelets,enhancedphagocytosis,chemotaxisandactivationoflymphocyticandmacrophagecelltype。

5.勿將血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會(huì)因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。

第12頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天6.血清之沈淀物

6.1.凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin)造成，這些凝絮沈淀物不會(huì)影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000rpm,5min去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾。不建議用過(guò)濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因?yàn)闀?huì)阻塞過(guò)濾膜。

6.2.顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過(guò)熱處理之血清，沈淀物的形成會(huì)顯著的增多。有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”，常會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37℃中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37℃環(huán)境下，又會(huì)使此沈淀物增多，更會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測(cè)，又沒(méi)有污染。一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影響細(xì)胞之生長(zhǎng)，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號(hào)的血清。第13頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天附-血清之生長(zhǎng)測(cè)試材料：

MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)

a-MEM(alphamodifiedminimalessentialmedium,GibcoBRL12000-022)

6-wellTCplate(or35mmTCdish)

methanol

glacialaceticacid

10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)

步驟：

1.以a-MEMwith10%FBS(已測(cè)試過(guò))培養(yǎng)MDCK細(xì)胞于T75flask至80%confluency。

2.以trypsin-EDTA處理細(xì)胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM制成細(xì)胞懸浮液，并測(cè)細(xì)胞濃度。以不加血清之a(chǎn)-MEM稀釋細(xì)胞濃度為1×102活細(xì)胞數(shù)/ml。

3.將1ml細(xì)胞懸浮液接種入6-wellplate中，并另加入1ml含不同濃度的血清(20%,10%,4%,2%,1%,0.4%)之a(chǎn)-MEM，使血清最終濃度為10%,5%,2%,1%,0.5%,0.2%。用已測(cè)試過(guò)之血清同時(shí)進(jìn)行對(duì)照組試驗(yàn)。

第14頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.37oC，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。

5.去除培養(yǎng)基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇:冰醋酸﹦3:1)，室溫下靜置10min。

6.去除固定液，水洗二次。

7.加入1ml10%Giemsasolution，，室溫下靜置染色2-3min。

8.去除染液，水洗二次。

9.以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)

10.計(jì)算SPE(SerumPlatingEfficiency)：

SPE=(no.ofcolonies/well)/100x100%

11.計(jì)算RPE(RelativePlatingEfficiency)：

SPE=[totalcoloniesofsixwell(test)/Totalcoloniesofsixwell(control)]x100%

比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測(cè)血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。訂購(gòu)多量同一批號(hào)的優(yōu)良血清，置于–70℃保存之第15頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天基礎(chǔ)篇-細(xì)胞傳代培養(yǎng)1.細(xì)胞生長(zhǎng)至高密度時(shí)，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3至1:6，依細(xì)胞種類(lèi)而異。

2.材料：

2.1.無(wú)菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,

GibcoBRL21600-010)

2.2.trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：

以10ml分裝于15ml無(wú)菌離心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回溫。

2.3.新鮮培養(yǎng)基

2.4.無(wú)菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶

3.步驟：

3.1.附著型胞(adherentcell)

3.1.1.吸掉舊培養(yǎng)液。

3.1.2.用D-PBS洗滌細(xì)胞一至二次。

第16頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.1.3.加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，離心后再吸掉上清液。)

3.1.4.輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

第17頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.2.懸浮型細(xì)胞(suspensioncell)

3.2.1.吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000rpm5分鐘。

3.2.2.吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

3.3.融合瘤(hybridoma)

3.3.1.有些hybridomacell需培養(yǎng)三天以上才會(huì)產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會(huì)失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。第18頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天基礎(chǔ)篇-細(xì)胞冷凍保存（一）1.注意事項(xiàng)：

1.1.欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好(logphase)且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度。

1.2.冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。

1.3.注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色(以0.22micronFGLPTelflon過(guò)濾或是直接購(gòu)買(mǎi)無(wú)菌產(chǎn)品，如SigmaD-2650)，以5~10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。1.4.冷凍保存之細(xì)胞濃度：

第19頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.4.1.normalhumanfibroblast:1~3x106cells/ml

1.4.2.hybridoma:1~3x106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后死去。

1.4.3.adherenttumorlines:5~7x106，依細(xì)胞種類(lèi)而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1-3x106cells/ml。

1.4.4.othersuspensions:5~10x106cells/ml,humanlymphocyte須至少5x106cells/ml。

1.5.冷凍保護(hù)劑濃度為5或10％DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backupculture，以防止冷凍失敗。1.6.冷凍方法：

1.6.1.傳統(tǒng)方法:4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16-18小時(shí)(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

1.6.2.程序降溫：利用等速降溫機(jī)以–1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至–120℃，放在液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。第20頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天基礎(chǔ)篇-細(xì)胞冷凍保存（二）2.材料：

2.1.生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞

2.2.新鮮培養(yǎng)基

2.3.DMSO(SigmaD-2650)

2.4.無(wú)菌塑料冷凍保存管(Nalgene5000-0020)

2.5.0.4％w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)

2.6.血球計(jì)數(shù)盤(pán)與蓋玻片

2.7.等速降溫機(jī)(KRYO10SeriesII)

第21頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.步驟：

3.1.冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。

3.2.配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10％，混合均勻，置于室溫下待用。

3.3.依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。

3.4.離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5x106cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，1ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。

3.5.冷凍保存方法1:冷凍管置于4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16～18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

3.6.冷凍保存方法2:冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中，再放入液氮槽中。程序?yàn)?program7:HBCELL第22頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天基礎(chǔ)篇-冷凍細(xì)胞活化1.冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。

2.細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。

3.材料

37℃恒溫水，新鮮培養(yǎng)基，無(wú)菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶，液氮或干冰容器

第23頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.步驟：

4.1操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。

4.2自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過(guò)程，此時(shí)蓋子易松掉。

4.3將新鮮培養(yǎng)基置于37°C水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

4.4取出冷凍管，立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以70%ethanol擦拭保存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

4.5取出0.9ml解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例1:10～1:15)，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試。

4.6解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO或glycerol)，依細(xì)胞種類(lèi)而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000rpm,5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

4.7若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。第24頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天基礎(chǔ)篇-收到細(xì)胞的處理方式(一)1.收到細(xì)胞株包裹時(shí)，請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請(qǐng)立即通知。細(xì)胞株請(qǐng)盡速開(kāi)始培養(yǎng)，或立即冷凍保存(置于–70°C，隔夜后，移到液氮)。

2.冷凍細(xì)胞解凍程序:

2.1.依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類(lèi)、血清種類(lèi)和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無(wú)法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類(lèi)，若因?qū)嶒?yàn)需要，必須有所不同時(shí)，務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細(xì)胞適應(yīng)后，方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)。

2.2.FBS(fetalbovineserum,胚牛血清),CS(calfserum,小牛血清)和HS(horseserum,馬血清)，對(duì)細(xì)胞而言差異極大，請(qǐng)務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之血清種類(lèi)培養(yǎng)之。

第25頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.3.將培養(yǎng)基置于37°C水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。取出冷凍管，立即放入37°C水槽中快速解凍，水面高度不可接近或高過(guò)冷凍管之蓋沿，否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化后，以70%ethanol擦拭冷凍管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

2.4.依據(jù)細(xì)胞種類(lèi)和濃度，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)取10ml培養(yǎng)基加至T25或T75flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入T25或T75flask內(nèi)之培養(yǎng)基，混合均勻，放入37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.5.對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1%以下之冷凍保護(hù)劑DMSO，不會(huì)對(duì)細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除，待第二天確定細(xì)胞生長(zhǎng)或貼附良好后再去除即可。惟對(duì)極少數(shù)因?qū)MSO敏感或會(huì)造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去除DMSO者，則可將解凍后之細(xì)胞懸浮液放入5-10ml培養(yǎng)基中，離心300xg(約1000rpm)，5分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再放入37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第26頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天基礎(chǔ)篇-收到細(xì)胞的處理方式(二)收到T25flask細(xì)胞時(shí)，處理方式為︰

1.于寄送過(guò)程中，為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡，T25flask均加滿(mǎn)培養(yǎng)基。請(qǐng)檢查flask外觀，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和有無(wú)污染現(xiàn)象，若有任何問(wèn)題，不要打開(kāi)蓋子，請(qǐng)立即通知細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。

2.將原封之T25flask靜置于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞回溫至37°C，并讓運(yùn)送過(guò)程中少數(shù)脫落的細(xì)胞可再附著生長(zhǎng)。隔天后，于無(wú)菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml培養(yǎng)基于flask內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱中，或細(xì)胞已長(zhǎng)滿(mǎn)盤(pán)，則將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。第27頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天附-細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試（一）1.原理：

1.1.計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤(pán)或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。

1.2.血球計(jì)數(shù)盤(pán)一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。

1.3.存活測(cè)試之步驟為dyeexclusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無(wú)法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypanblue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypanblue，則用紅色之Erythrosinbluish。

第28頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天附-細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試（二）2.材料：

0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)

Erythosinbluishstain

取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethyl

paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline

血球計(jì)數(shù)盤(pán)及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip)，計(jì)數(shù)器(counter)，低倍倒立顯微鏡

粒子計(jì)數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)

3.步驟：

3.1.取50ml細(xì)胞懸浮液與50mltrypanblue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。

3.2.取少許混合液(約15ml)自血球計(jì)數(shù)盤(pán)chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色-Erythrosinbluish)。

3.3.計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，最后乘以104，即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線(xiàn)上，只計(jì)上線(xiàn)與右線(xiàn)之細(xì)胞(或計(jì)下線(xiàn)與左線(xiàn)之細(xì)胞)。

4大格*細(xì)胞總數(shù)x2x104/4=細(xì)胞數(shù)/ml

*每一大格的體積=0.1cmx0.1cmx0.01cm=10-4ml

第29頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.4.若不用血球計(jì)數(shù)盤(pán)，可用Coultercounter作自動(dòng)計(jì)數(shù)，惟無(wú)法辨別死細(xì)胞或活細(xì)胞。

3.5.范例：

T75monolayerculture制成10ml細(xì)胞懸浮液，取0.1ml溶液與0.1mltrypanblue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤(pán)，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目。

活細(xì)胞數(shù)/方格：55,62,49,59

死細(xì)胞數(shù)/方格：5,3,4,6

細(xì)胞總數(shù)=243

平均細(xì)胞數(shù)/方格=60.75

稀釋倍數(shù)=2

細(xì)胞數(shù)/ml：60.75x104x2=1.22x106

細(xì)胞數(shù)/flask：1.22x106x10ml=12.2x106

存活率：225/243﹦92.6%第30頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)11冷凍管應(yīng)如何解凍？

取出冷凍管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。2細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO？

除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。第31頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天3可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無(wú)法存活。4可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類(lèi)？

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。第32頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)25何謂FBS,FCS,CS,HS?

FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯(cuò)誤的使用字眼，請(qǐng)不要再使用。CS(calfserum)則是指小牛血清。HS(horseserum)則是指馬血清。6培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%或10%CO2？或根本沒(méi)有影響？

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10%CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時(shí)，則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞。第33頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天7何時(shí)須更換培養(yǎng)基？

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

8培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。9附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA濃度？應(yīng)如何處理？

一般使用之trypsin-EDTA濃度為0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于–20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機(jī)會(huì)。10懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時(shí)，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。第34頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)311欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg(約1,000rpm)，5-10分鐘，過(guò)高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。12細(xì)胞之接種密度為何？依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤(pán)之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。13細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。第35頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天14DMSO之等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何？

冷凍保存使用之DMSO等級(jí)，必須為T(mén)issueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650)，其本身即為無(wú)菌狀況，第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于4°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾DMSO，則須使用耐DMSO之Nylon材質(zhì)濾膜。15冷凍保存細(xì)胞之方法？

冷凍保存方法一:冷凍管置于4°C30~60分鐘→(-20°C30分鐘*)→-80°C16~18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3°C至–80°C以下，再放入液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20°C不可超過(guò)1小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。第36頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)416細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106cells/mlvial，融合瘤細(xì)胞則以5x106cells/mlvial為宜。17應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？細(xì)胞污染的種類(lèi)可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。18如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？

加入相應(yīng)抗生素。直接滅菌后丟棄之。19支原體(mycoplasma)污染的細(xì)胞，是否能以肉眼觀察出異狀？

第37頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專(zhuān)家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無(wú)法以其外觀分辨之。20支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？

支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。21偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)，該如何處理？

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。22CO2培養(yǎng)箱之水盤(pán)如何保持清潔？

定期(至少每?jī)芍芤淮?以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。第38頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)523為何培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，顏色會(huì)偏暗紅色，且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無(wú)菌過(guò)濾之CO2，以調(diào)整pH值。24各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？

不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長(zhǎng)差異。第39頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天25購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？

研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。26購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，常見(jiàn)原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80°C太久。27收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊第40頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)628如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類(lèi)型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)?？傊走xMEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開(kāi)始，各種目的無(wú)血清培養(yǎng)最好首選AIMV（12005）培養(yǎng)基（SFM）。

29L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。

第41頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天30GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

31什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類(lèi)反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類(lèi)細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。第42頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)732培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話(huà)，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

34二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？

二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。第43頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天33目錄上說(shuō)，Hank‘s平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank’s平衡鹽溶液(HBS)和Earle‘s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？

HBS和EBS的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了。第44頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)835當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。

36一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解。

37大部分添加物和試劑最多可以?xún)鋈?次，如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會(huì)影響它的性能。

38在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能開(kāi)始降解，如果在室溫下放置超過(guò)30分鐘，就會(huì)變得不穩(wěn)定。第45頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞分離試劑（1）大部分連續(xù)細(xì)胞系，強(qiáng)貼壁細(xì)胞系，許多早代細(xì)胞HBSS或無(wú)鈣鎂PBS0.25％胰蛋白酶溶解在無(wú)鈣鎂平衡鹽溶液中細(xì)胞表面蛋白完整性重要的連續(xù)細(xì)胞系HBSS或無(wú)鈣鎂PBS0.05％胰蛋白酶溶解在0.53mMEDTA弱貼壁表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞（要求細(xì)胞表面完整性），原代細(xì)胞HBSS或無(wú)鈣鎂PBSEDTA,甘油溶解在檸檬酸鈉中強(qiáng)貼壁早代細(xì)胞系HBSS或無(wú)鈣鎂PBS0.25％胰蛋白酶溶解在1mMEDTA，Dispase0.6-2.4單位/ml溶解在PBS第46頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞分離試劑（2）上皮細(xì)胞0.5mM-1mMEDTA0.5mM-1mMEDTA，Dispase0.6-2.4單位/ml溶解在PBS強(qiáng)貼壁細(xì)胞，上皮細(xì)胞，一些腫瘤細(xì)胞0.5mM-