申代碼畢自然

基本信第1 男1969年02 8 0571- 基本信第1 男1969年02 8 0571- 0571-PathogenesisresearchofHereditaryexostosisviaIhhsignalingpathwayhyperactivemicemodelH1602.H1624.2017年01月--2020年1284.0000中文關(guān)鍵詞英文關(guān)鍵詞hereditarymultipleexostosis;sufu;Ihh;第2第2psinK(Ctsk)表達的細(xì)胞中條件性敲除Sufu基因，構(gòu)建了Ihh信號通路亢進的小鼠多發(fā)性軟骨RNA。同時，在CtskcreSufuF/F小鼠中分選出Sufu被敲除的細(xì)胞以及分離出骨軟骨瘤組織Hereditarymultipleexostosis(HME)isanautosomaldominantgeneticdisease.ItspathogenesisismutationinEXT1/EXT2gene,causingtheactivitydecreaseoftheformatedglycosylationtransferaseenzymecomplextherebyexcessivelyactivateIhhsignallingpathway，butthe downstreammechanismisstillunknown.Wecollected5pedigreesofHMEandfoundIhhpathwaysupregulatedinthespecimens.Meanwhile，bycathepsinK(Ctsk)creSufuF/Fmice,wehaveconstructedanmultipleosteochondromamicemodelviaup-regulatedIhhsignallingpathway.Ourstudyintendsto:1.ViaRNAseqofclinicalHMEspecimens,comparedwiththenormalbonetissues,screenouttheexpressionchangedRNA.2.IsolatesufuknckoutedcellandosteochondromatissuesofCtskcreSufuF/Fmice,thenthroughRNAseqanalysisrespectively, screenouttheexpressionchangedmolecules.3.AccordingtotheRNAseqresults,identifythekeyregulatedgenesdownstreamofIhhsignallingpathways,exploretransmissiondownstreamIhhsignallingpathwaysandthemechanismsoftargetgenesactontheformationofHME,andfinallyprovideanewtheoreticalbasisforthemoleculartreatmentofHME.第391220131男042女43男024男45男66男047男第391220131男042女43男024男45男66男047男038男05項目申請?zhí)?項目批準(zhǔn)號項目負(fù)責(zé)人：畢金額單位：萬第412314(1)5(2)6(3)72項目申請?zhí)?項目批準(zhǔn)號項目負(fù)責(zé)人：畢金額單位：萬第412314(1)5(2)6(3)728394567891011預(yù)算說明書（定額補助預(yù)算說明書（定額補助第5RT-PCR相關(guān)試劑、Westernblot3.24：45 （1）DNA20×375×4；FACS（；Chip-；FACS（；Chip-2.260.86國家相關(guān)規(guī)定，按4000.5萬元(400元×2×10人=8000元),四年預(yù)計總計花費約0.8（1）第6（2）（2）2篇SCI50005000元/篇×2篇＝1元/年，四年共需0.48第7正（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容正（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-字1．項目的立項依據(jù)（研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤是一種嚴(yán)重的遺傳性疾病，下游分子機制不明遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤（hereditaryexostosesHME）呈常染色體[1]。HME患者表現(xiàn)為骨骼畸形、身材矮小、關(guān)節(jié)運動受限、關(guān)節(jié)脫位和周圍組織受壓[2,3]。5-28%的患者甚至出現(xiàn)惡變[4]，因此危害較大。HME在西方國家HME80％的多發(fā)性外生性骨疣8q24.11q24.13xoton1（Ext1）11p1211Ext26HMEEX1EX2蛋白是定位于內(nèi)質(zhì)(HepnSuft,S的合成有關(guān)[3,7IndnhdghogIhh)Ihh8Ext1Ext2基因發(fā)生突變時，會使他們所編HSHSHSIhhIhhPHPIhhPHP通12]源基因：SonicHedgehog(Shh)、IndianHedgehog(Ihh)和DesertHedgehog第8HHHHI Hh信號通路的受體為Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)[13]Ptc對Hh信號通路起負(fù)調(diào)節(jié)作用；Smo是激活Hh信號傳遞必需的受體。完整的Ci蛋白包含155Ptc抑制Smo的活性，此時，微管結(jié)合蛋白COS2與Ci蛋白結(jié)合，形成一個復(fù)Gli蛋白，分Gli1，Gli2，Gli3共3種，其中Gli1和Gli2起激活作用，而Gli3起抑制作用。Ci可以被蛋白激酶A(PKA)磷酸化，磷酸化后的Ci蛋白被泛素化連接酶相關(guān)的F-box蛋白Slimb識別，進而發(fā)生降解。分解產(chǎn)物Ci75是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，可以進入細(xì)胞核抑制Hh靶基因的轉(zhuǎn)錄。Hh蛋白可以結(jié)合Ptc受體，從而解除對Smo的抑制效應(yīng)?；罨腟mo一方面與Cos2、Fu結(jié)合形成復(fù)合物從而釋放Ci蛋白，另一方面可以抑制PKA活性，從而抑制Ci的裂解。Fu抑制物（Suppressoroffused,SuFu）是Hh通路的負(fù)向調(diào)控者。此外，Ci可以下調(diào)iHog和CDO在細(xì)胞膜上的表達，從而抑制Hh蛋白與受體Ptc結(jié)合，SUFUHhSUFU4681-1所示。在它的CPESTNES1.SUFU蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖（Fu:fused;Ci:Cubitusinterruptus;PEST:aregionrichtheaminoacidsproline(P),glutamicacid(E),serine(S)threonine(T);NES:nuclear-exportsignal號通路中通過與Ci和FuSUFU蛋白包含了484N-terminaldomain(NTD)和一個C-terminaldomain(CTD)（圖2）[16]。在哺乳動物中，SuFu的缺失可以導(dǎo)HhPtch1的缺失，這表明，SuFuGli第9圖2.SUFU蛋白三維結(jié)圖2.SUFU蛋白三維結(jié)構(gòu)。包括兩個球狀結(jié)構(gòu)域，之間存在一個短的連接（氨基酸的主要抑制物。SuFuHhSufu喪失活性會導(dǎo)致胚胎致死及背根神經(jīng)節(jié)的缺陷[17,18]。無Hh信號時，小鼠和果蠅中的Sufu都直接與Gli/Ci蛋白結(jié)合將它們保持在胞質(zhì)中來抑制Hh通路活性。在哺乳動物細(xì)胞中，Sufu可能是通過的它的負(fù)調(diào)通過與GSK3結(jié)合促進GliA的形成。而且Sufu在穩(wěn)Gli2和Gli3的作用中非常關(guān)鍵。目前Sufu被公認(rèn)為腫瘤抑制基因，其失活性突變可導(dǎo)致成神經(jīng)血管瘤和基底細(xì)胞癌等腫瘤[19,20]HMEIhh信號通路的關(guān)系也比較明確，Ext1/Ext2突變后所引起的下游分子事件研究較少，哪些關(guān)鍵分子受到影響發(fā)生了突變，包括新的致病突變位點一例[3]，并發(fā)現(xiàn)罕見關(guān)節(jié)腔內(nèi)HME一例IHH蛋白在骨軟骨瘤的軟骨帽處表達K(CathepsinK)骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收中發(fā)揮重要作用。CtskCre第10的條件型基因敲除小鼠。2012年Wentian的條件型基因敲除小鼠。2012年WentianYang及其同事在Nature雜志報道，利Ctsk-CrePtpn11基因能導(dǎo)致“混合性軟骨瘤病”。進一步研究表明Ctsk在位于Ranvier的軟骨膜槽中的間充質(zhì)干細(xì)胞中表表明Ctsk表達的細(xì)胞是骨軟骨瘤的前體細(xì)胞或者癌癥干細(xì)胞。同時，研究表明Ctsk-Cre;Ptpn11HhHh通路可以治療此我們Ctsk-cre小鼠Sufufl/fl合籠Ctsk-CreSufufl/fl特異性基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)出生后小鼠4周后行動出現(xiàn)異常。通20周大的小鼠的后肢進行μCT發(fā)現(xiàn)其爪子的跖骨和趾骨、脛骨、股骨存在骨軟骨瘤。對脛骨和股骨進行切片，HE和番O染色發(fā)現(xiàn)，Ctsk-CreSufufl/fl小鼠存在骨軟骨瘤和內(nèi)生軟骨瘤的表型Ctsk-Cre;Sufufl/fl小鼠的軟骨瘤標(biāo)本的組織學(xué)上發(fā)現(xiàn)Ihh通路上調(diào)。Ctsk-CreSufufl/fl小鼠中，影響生長板軟骨細(xì)胞增殖、分化的分子機制并不清楚。我們認(rèn)為，臨床上遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤和Ctsk-Cre;Sufufl/fl小鼠的骨軟骨瘤是Ihh通路上調(diào)而導(dǎo)致軟骨瘤的發(fā)生，但其下游通路相同。因此們提出這樣的假說傳性多發(fā)性骨軟骨瘤的發(fā)生和Ctsk-Cre;Sufufl/fl小鼠骨軟骨瘤的發(fā)生存在著Ihh通路共有的下游分子，這些分子對軟骨瘤的發(fā)生起著重要的作用。我們通過希望借助該動物模型，研究小鼠產(chǎn)生多發(fā)性HME參考文獻KimBT,KitagawaH,TamuraJ,SaitoT,Kusche-GullbergM,LindahlU,SugaharaK.Human acetylglucosaminyltransferasesthatlikelyareinvolvedinheparansulfate/heparinbiosynthesis[J].ProcNatlAcadSciUSA,2001,98(13):7176-7181.DOI:10.1073/pnas.131188498.CiavarellaM,CocoM,BaordaF,StanzialeP,ChettaM,BiscegliaL,PalumboP,BengalaM,RaiteriP,SilengoM,CaldariniC,FacchiniR,LalaR,CavaliereML,DeBrasiD,PasiniB,ZelanteL,GuarnieriV,D'AgrumaL.20novelpointmutationsandonelargedeletioninEXT1andEXT2genes:reportofdiagnosticscreeninginalargeItaliancohortofpatientsaffectedbyhereditarymultipleexostosis[J].Gene,2013,515(2):339-348.DOI:10.1016/j.gene.2012.11.055.CaoL,LiuF,KongM,FangY,GuH,ChenY,ZhaoC,ZhangS,BiQ.NovelEXT1mutationidentifiedin第11pedigreewithhereditarymultipleexostoses[J].OncolRep,2014,31(2):713-KiviojaA,ErvastiH,KinnunenJ,KaitilaI,Wolfpedigreewithhereditarymultipleexostoses[J].OncolRep,2014,31(2):713-KiviojaA,ErvastiH,KinnunenJ,KaitilaI,WolfM,BohlingT.Chondrosarcomainafamilywithmultiplehereditaryexostoses[J].JBoneJointSurgBr,2000,82(2):261-266.JennesI,ZuntiniM,MeesK,PalaganiA,PedriniE,DeCockG,FransenE,VandenBergheW,SangiorgiL,WuytsW.IdentificationandfunctionalcharacterizationofthehumanEXT1promoterregion[J].Gene,2012,492(1):148-159.DOI:10.1016/j.gene.2011.10.034.WuytsW,VanHulW,DeBoulleK,HendrickxJ,BakkerE,VanhoenackerF,MollicaF,LudeckeHJ,BS,PazzagliaUE,MortierG,HamelB,ConradEU,MatsushitaM,RaskindWH,WillemsPJ.MutationsintheEXT1andEXT2genesinhereditarymultipleexostoses[J].AmJHumGenet,1998,62(2):346-354.DOI:S0002-9297(07)63500-9[pii].KangZ,PengF,LingT.MutationscreeningofEXTgenesinChinesepatientswithmultipleosteochondromas[J].Gene,2012,506(2):298-300.DOI:10.1016/j.gene.2012.07.006.KozielL,KunathM,KellyOG,VortkampA.Ext1-dependentheparansulfateregulatestherangeofStickensD,ClinesG,BurbeeD,RamosP,ThomasS,HogueD,HechtJT,LovettM,EvansGA.TheEXT2multipleexostosesgenedefinesafamilyofputativetumoursuppressorgenes[J].NatGenet,1996,14(1):25-32.DOI:10.1038/ng0996-25.BornemannDJ,ParkS,PhinS,WarriorR.AtranslationalblocktoHSPGsynthesispermitsBMPsignalingintheearlyDrosophilaembryo[J].Development,2008,135(6):1039-1047.BornemannDJ,DuncanJE,StaatzW,SelleckS,WarriorR.AbrogationofheparansulfatesynthesisinDrosophiladisruptstheWingless,HedgehogandDecapentaplegicsignalingpathways[J].Development,2004,131(9):1927-1938.DOI:10.1242/dev.01061.BishopJR,SchukszM,EskoJD.Heparansulphateproteoglycansfine-tunemammalianphysiology[J].Nature,2007,446(7139):1030-1037.BeachyPA,HymowitzSG,LazarusRA,LeahyDJ,SieboldC.InteractionsbetweenHedgehogproteinsandtheirbindingpartnerscomeintoview[J].GenesDev,2010,24(18):2001-2012.DOI:10.1101/gad.1951710.TaipaleJ,CooperMK,MaitiT,BeachyPA.PatchedactscatalyticallytosuppresstheactivityofSmoothened[J].Nature,2002,418(6900):892-897.DOI:10.1038/nature00989.EhlenHW,BuelensLA,VortkampA.Hedgehogsignalinginskeletaldevelopment[J].BirthDefectsResCEmbryoToday,2006,78(3):267-279.DOI:10.1002/bdrc.20076.ZhangY,FuL,QiX,ZhangZ,XiaY,JiaJ,JiangJ,ZhaoY,WuG.StructuralinsightintotherecognitionandregulationbetweenSuppressorofFusedandGli/Ci[J].NatCommun,2013,4:2608.DOI:CooperAF,YuKP,BruecknerM,BraileyLL,JohnsonL,McGrathJM,BaleAE.CardiacandCNSdefectsinamousewithtargeteddisruptionofsuppressoroffused[J].Development,2005,132(19):4407-4417.DOI:SvardJ,Heby-HenricsonK,Persson-LekM,RozellB,LauthM,BergstromA,EricsonJ,ToftgardR,S.GeneticeliminationofSuppressoroffusedrevealsanessentialrepressorfunctioninthemammalianHedgehogsignalingpathway[J].DevCell,2006,10(2):187-197.DOI:10.1016/j.devcel.2005.12.013.TaylorMD,LiuL,RaffelC,HuiCC,MainprizeTG,ZhangX,AgatepR,ChiappaS,GaoL,LowranceA,HaoA,GoldsteinAM,StavrouT,SchererSW,DuraWT,WainwrightB,SquireJA,RutkaJT,HoggD.MutationsinSUFUpredisposetomedulloblastoma[J].NatGenet,2002,31(3):306-310.DOI:PastorinoL,GhiorzoP,NastiS,BattistuzziL,CusanoR,MarzocchiC,GarreML,ClementiM,Scarra第12IdentificationofaSUFUgermlinemutationinafamilywithGorlinsyndrome[J].AmJMedGenetA,2009,149A(7):1539-1543.DOI:10.1002/ajmg.a.32944.]KongM,CaoLI,ZhangQ,FangY,ZhaoC,GuH,IdentificationofaSUFUgermlinemutationinafamilywithGorlinsyndrome[J].AmJMedGenetA,2009,149A(7):1539-1543.DOI:10.1002/ajmg.a.32944.]KongM,CaoLI,ZhangQ,FangY,ZhaoC,GuH,ZhangS,ChenYU,WuJ,BiQ.Identificationofararecaseofintra-articularosteochondromamanifestingasthreeloosebodiesinapatientwithhereditarymultipleosteochondromas:Acasereport[J].OncolLett,2015,10(2):798-804.DOI:10.3892/ol.2015.3284.]YangW,WangJ,MooreDC,LiangH,DoonerM,WuQ,TerekR,ChenQ,EhrlichMG,QuesenberryPJ,NeelBG.Ptpn11deletioninanovelprogenitorcausesmetachondromatosisbyinducinghedgehogsignalling[J].Nature,2013,499(7459):491-495.DOI:2．項目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題（部分為重點闡述內(nèi)容2.1研究目通過臨床上HME標(biāo)本、Sufu條件性基因敲除小鼠中敲除細(xì)胞和腫瘤組織分析，篩選出Ihh通路調(diào)控的關(guān)鍵下游分子，并通過體內(nèi)外試驗研究關(guān)鍵下游分子與Ihh構(gòu)建Ext1基因突變的載體轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞并注入裸鼠皮下，構(gòu)建骨軟骨瘤HME2.2研究內(nèi)（1）HME手術(shù)標(biāo)本中Ihh通路上調(diào)取骨軟骨瘤手術(shù)標(biāo)本，分離出骨軟骨瘤的軟骨部分，提取總RNA，通過RNAseq技術(shù)，得出骨軟骨瘤標(biāo)本的RNA表達譜。通過人類正常骨組織的RNAseq選得出表達改變的基過構(gòu)建的EXT1基因突變載體，轉(zhuǎn)染軟骨干細(xì)胞過表達EXT1突變基因，在體外驗證Ihh通路下游受（2）Ctsk-CreSufufl/fl產(chǎn)生混合型軟骨腫瘤的分子機制。Ctsk-Sufufl/f小鼠多發(fā)性軟骨觀察其表通過組織學(xué)和qPCR檢測確定Ihh第13;（3）尋找出軟骨腫瘤形成過;（3）尋找出軟骨腫瘤形成過程中，Ihh通路下游受調(diào)控的關(guān)鍵分子，并在內(nèi)外試驗上驗證關(guān)鍵下游分子與Ihh信號通路的關(guān)系，并提出分子治療HME新策略。通過Ctsk- Sufufl/flmice敲除細(xì)胞和骨軟骨瘤組織標(biāo)本中RNAseq的結(jié)果，結(jié)合臨床HME標(biāo)本RNAseq改變的表達譜，挑選出Ihh通路下游受調(diào)控的分化。提取Ctsk-;分化而來的軟骨細(xì)胞，通過SiRNA下調(diào)關(guān)鍵基因、關(guān)鍵基因突變體轉(zhuǎn)染或者通過加這通路下游受調(diào)控的關(guān)鍵基因的激動劑或者抑制劑，觀察軟骨細(xì)胞的Ext1RiRNA技術(shù)或者關(guān)鍵基因的激動劑、抑制劑來上調(diào)或者下調(diào)Ihh通路，觀察細(xì)胞的增殖和IhhCtsk-2.3擬解決的關(guān)鍵問題（1）Ctsk-Cre;Sufufl/fl小鼠產(chǎn)生混合型軟骨瘤的分子機制。SUFU是如何調(diào)控Ihh通路的下游分子產(chǎn)生混合型軟骨腫瘤；ctsk前體條件性敲除Sufu基因如何影第143．?dāng)M采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技術(shù)路線、實驗手段、關(guān)鍵技術(shù)等說明3.1研究方3．?dāng)M采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技術(shù)路線、實驗手段、關(guān)鍵技術(shù)等說明3.1研究方案：1.收集臨床HME標(biāo)本，通RNAseq，尋Ihh通路調(diào)控的分子。IhhIhh，Gli1RNAseq模型，探究小鼠產(chǎn)生多發(fā)性混合型軟骨瘤的分子機制。;sufu通過Ctsk-Cmice進行交配，被Cre切除的細(xì)胞膜會表達提取Ctsk-C小鼠的骨軟骨瘤組織的總并進行RNAseq分析。Ctsk-Cre;Sufufl/fl第15Ctsk-CreSufufl/flsufucKOMSC，Ctsk-Cre;Sufufl/flqPCR檢測RNAseqsufuqPCR根據(jù)以上結(jié)Ctsk-CreSufufl/flsufucKOMSC，Ctsk-Cre;Sufufl/flqPCR檢測RNAseqsufuqPCR根據(jù)以上結(jié)果，闡明Ctsk-小鼠產(chǎn)生多發(fā)性混合型軟骨瘤的分3.尋找出Ihh通路下游受調(diào)控的關(guān)鍵分子，并在體內(nèi)外試驗驗證。IhhIhh通路下游受調(diào)控的關(guān)鍵基因?qū)xt1突變載體轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞細(xì)胞功影響及分子機構(gòu)建突變載的軟骨細(xì)胞并培養(yǎng)。通過RiRNA、關(guān)鍵基因突變體轉(zhuǎn)染技術(shù)或者關(guān)鍵基因的激抑制劑來上調(diào)或者下調(diào)Ihh通路;子機制。Ctsk-Cre;Sufufl/fl小鼠的骨髓干細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化成軟骨細(xì)胞后培養(yǎng)用Ihh通路下游受調(diào)控的關(guān)鍵分子的激動劑或者抑制劑對Ctsk-第16技術(shù)路線臨床樣動物模腫瘤Ctsk-Sufufl/fl小流式分選出f條件性敲除的細(xì)胞體內(nèi)軟骨瘤標(biāo)本分體外分子機制第17信號通路技術(shù)路線臨床樣動物模腫瘤Ctsk-Sufufl/fl小流式分選出f條件性敲除的細(xì)胞體內(nèi)軟骨瘤標(biāo)本分體外分子機制第17信號通路分析，靶基因調(diào)控細(xì)胞發(fā)育的作軟骨相關(guān)基因變化骨軟骨瘤中IHH通路下游受調(diào)控的關(guān)鍵基因路在軟骨發(fā)育及軟骨瘤細(xì)胞形成RNARNA測序?qū)ふ? 通路相關(guān)Maker3.3項目可行性分析目前我們已經(jīng)收集了遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤的臨床標(biāo)本和正常組織標(biāo)本各5例，并提取了總RNA。實驗室已經(jīng)有Ctsk-Cre;條件性敲除小鼠可3.3項目可行性分析目前我們已經(jīng)收集了遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤的臨床標(biāo)本和正常組織標(biāo)本各5例，并提取了總RNA。實驗室已經(jīng)有Ctsk-Cre;條件性敲除小鼠可以對（1）立論的可行性Sufufl/fl條件性敲除小鼠表型上發(fā)現(xiàn)了混合型軟骨腫瘤。sufuIhh抑制基因，可以推斷sufu基因的敲除會引起Ihh通路上調(diào)，從而形成多發(fā)性軟骨軟骨腫瘤標(biāo)本的組織學(xué)上都發(fā)現(xiàn)了Ihh通路上調(diào)，我們希望從（2）研究設(shè)計與工作基礎(chǔ)的可行性5RNACtsk-Cre;Sufufl/fl軟骨腫瘤標(biāo)RNAseq相關(guān)分我們還通過顯微切割分離Ctsk-Cre;骨軟骨瘤Sufufl/fl篩出骨軟骨瘤中表達改變的基因。最后我們將根據(jù)臨床上 Ctsk-第18制劑或激動劑來rescue（3）研究隊伍與技術(shù)的可行性（4）研究環(huán)境制劑或激動劑來rescue（3）研究隊伍與技術(shù)的可行性（4）研究環(huán)境與研究設(shè)備的可行性等）4．本項目的特色與創(chuàng)新之處；（2）臨床病例和動物實驗相結(jié)合是研究軟骨腫瘤的常見方法。研究表明HME成是因為HS合成不足，造成Ihh通路中配體－受體結(jié)合發(fā)生錯亂而影響到配Ihh信號通路發(fā)生異常激活。而Ctsk-Cre;小鼠的軟骨腫瘤在理論上是由于抑制Ihh通路的sufu第195．年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果（包括擬組織的重要學(xué)術(shù)交流活動、國5．年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果（包括擬組織的重要學(xué)術(shù)交流活動、國際合作與交流計劃等年度研究（1）20171月至2017年12）2（2）20181月至2018年121）通過Ctsk-Cre;micemT/mGmice進行交配，被Cre切除的細(xì)胞膜會表達GFP，通過流式細(xì)胞分選出Cre敲除的細(xì)胞。對sufu條件性敲除RNAseq2）Ctsk-Cre;Sufufl/fl3）取sufucKO小鼠的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，觀察其分化和形sufu敲除是否調(diào)控成骨細(xì)細(xì)胞和軟骨的功能。用qPCR檢測RNAseq的篩選出的表達改變的分子。上調(diào)sufu基因后，觀察這些分子的改檢測并（3）2019年1月至2019年12月2)Ihh骨干細(xì)胞和Ctsk-Cre;Sufufl/fl小鼠的軟骨細(xì)通過過表達或者抑制該基因的表Ihh第203）用Ihh通路下游受調(diào)控的關(guān)鍵基因的激動劑或者抑制劑飼養(yǎng)在（4）2020年1月至20203）用Ihh通路下游受調(diào)控的關(guān)鍵基因的激動劑或者抑制劑飼養(yǎng)在（4）2020年1月至2020年12月;3)預(yù)期研究結(jié)果3)（二）研究基礎(chǔ)與工作條件1．研究基礎(chǔ)（與本項目相關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工（1）臨床樣本的收集，免疫組化得出骨軟骨瘤中Ihh通路相關(guān)蛋白高表達。血。先證者(III22)在2歲左右發(fā)現(xiàn)雙肘關(guān)節(jié)骨疣，約2*3cm；雙膝關(guān)3*3cm大小；隨年齡增大腫塊逐步增大，到16歲左右腫塊生長停止，X線示：雙5第21圖3.EXT1和EXT2圖4已發(fā)現(xiàn)的HME家系圖之一：∕已死亡，箭頭所示為先證者第22圖3.EXT1和EXT2圖4已發(fā)現(xiàn)的HME家系圖之一：∕已死亡，箭頭所示為先證者第22c.115G>T;5HMEX線表現(xiàn)：①白色箭頭示雙側(cè)尺骨縮短畸形；②雙膝關(guān)節(jié)正位片顯示關(guān)節(jié)5HMEX線表現(xiàn)：①白色箭頭示雙側(cè)尺骨縮短畸形；②雙膝關(guān)節(jié)正位片顯示關(guān)節(jié)6RNA6HME手術(shù)標(biāo)本的免疫組化表現(xiàn)。IHH(2)Ctsk-Ctsk-Cre;Sufufl/f小鼠軟骨腫瘤模型的建立與表型觀察的小鼠出生后耳周之后行動異后肢爪子變厚，圖第23;7CtskcreSufuF/FA;7CtskcreSufuF/FActsk條件性敲除sufu小鼠耳朵變小，脊柱彎曲。B：手掌增厚。C：阿爾新藍(lán)-茜素紅整體染色表明其胸肋骨發(fā)育異常 Hindlimb ACtsk-第24BC20Ctsk-圖 Ctsk條件性敲除sufu小鼠存在混合型軟骨瘤病。Sufufl/fl的腿骨進行microCT疣產(chǎn)生。B:BC20Ctsk-圖 Ctsk條件性敲除sufu小鼠存在混合型軟骨瘤病。Sufufl/fl的腿骨進行microCT疣產(chǎn)生。B:HE、番紅O染色和Col2α1IHC染色顯cKOmice的股骨近關(guān)節(jié)處有骨軟骨瘤產(chǎn)生。C：番紅O染色顯示在cKOmice脛骨的生長板附近有內(nèi)生性軟骨瘤的產(chǎn)生9IhhCtsk-CreSufufl/fl小鼠骨軟骨瘤軟骨帽處IHH蛋白表達較野生型增高。第25（3）SufuF/F小鼠的關(guān)節(jié)軟骨（3）SufuF/F小鼠的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外試驗CRE病毒進行knockdown10:C(Aggrecan)均上調(diào)（10:B可能抑制了軟骨細(xì)胞的分化A：SufuF/F軟骨細(xì)胞分別加EGFP和Cre病毒圖10.進行分化，然后進行阿爾新蘭染色B：Knockdownsufu引起軟骨分化的marker—col10上 (Aggrecan)也上調(diào)，說明軟骨細(xì)胞分化增強。C：sufu表達下調(diào)，Gli1和第262．工作條件（包括已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬2．工作條件（包括已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬浙江省人民醫(yī)院骨科浙江省胃腸病學(xué)重點實驗室FluorChemHD2，ProteinSimple，美國）、熒光倒置顯微鏡日本）中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所第273．正在承擔(dān)的與本項目相關(guān)的3．正在承擔(dān)的與本項目相關(guān)的科研項目情況（申請人和項課題負(fù)責(zé)人：畢擎，起止年限藥衛(wèi)生平臺研究計劃重點項目，編號：2012ZDA003，起止年限2016.124．完成國家自然科學(xué)基金項目情況（對申請人負(fù)責(zé)的前一摘要（限500字）和相關(guān)成果的詳細(xì)目錄無（三）其他需要說明的問題.申無2.具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)（職稱的申請人或者主要參與者是否存在同年申請或者參與申請國家自然科學(xué)基金項目的單位不一致第28無3.具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)（職稱）的申請人或者主要參與者無其他第291.2005/9–2008/5，溫州醫(yī)科大學(xué)，外科學(xué)，碩士，導(dǎo)師：王躍東2.1987/9–1992/7，遵義醫(yī)學(xué)院，臨床醫(yī)學(xué)，學(xué)士，導(dǎo)師：無1.2010/92.2008/12-2010/93.2003/12-2008/114.1997/12-2003/115.1992/8-1997/11主持或參加科研項目（課題）及人才計劃項目情況（按時間倒序排序3、浙江省自然科學(xué)基因項目，Y2100731分子機理研究》，2010-2015，經(jīng)費5萬，已結(jié)題，主持代表性研究成果和學(xué)術(shù)獎勵情況（每項均按時間倒序排序1.BIQing，ZHANGQiong，MAJun，XUMing，ZHANGShui-Bin-song，XIABing，GUHai-feng，HONGJian-fei,，ZHAOChen，ZHUDan-jie(*)，Effectofcombinationtherapywithalginatedressingandmouseepidermalgrowth第30factoronepidermalstemcellsinpatientswithrefractorywounds.，Chinesemedicaljournal，2012，125（2）：257-261。2.（勿與第一作者論文重復(fù)MingxiangKongfactoronepidermalstemcellsinpatientswithrefractorywounds.，Chinesemedicaljournal，2012，125（2）：257-261。2.（勿與第一作者論文重復(fù)MingxiangKong，JianWu Qdeniicaio ofagermlineSMARCB1nonsensemutationinafamilymanifestingbothschwannomatosisandunilateralvestibularschwannoma，JournalofNeuro-Oncology，2015，125（2）：439-441MINGXIANGKONG，LICAO，QIONGZHANG，YONGFANG，CHENGU，SHUIJUNZHANG，YUCHEN，JINHUAWU，Bi，diiinofararecaseofintra-articular osteochondromamanifestingasthreeloosebodiesinapatientwithhereditarymultipleosteochondromas:Acasereport，OncologyLICAO，F(xiàn)EILIU，MINGXIANGKONG，YONGFANG，HAIFENGCHEN，CHENZHAO，SHUIJUNZHANG，QINGBI(*)，NovelEXT1mutationidentifiedinapedigreewithhereditarymultipleexostoses，Oncologyreports，2014，31（2）：WEIWEIRUAN，LICAO，MINGXIANGKONG，QIONGZHANG，YONGXU，SHUIJUNZHANG，QINGBI(*)，NovelEXT2mutationidentifiedina pedigreewithKongMX，Zhang Faahpehoe terolaemiawithtuberousandtendinousxanthomas:casereportandmutationanalysis，Clinicalandexperimentaldermatology，2015，40（7）：765-769。3.Fang ，BarberaAJ，XuY，RutenbergM，LeonorT，BiQ，LanP，YuanGC，LianC，PengJ，ChengD，SuiG，KaiserUB，ShiY，ShiYG(*)，HumanLSD2/KDM1b/AOF1regulatesgenetranscriptionbymodulatingintragenicH3K4me2methylation，MolCell，2010，39（2）：222-233。第31參與者簡歷參與者簡歷2003/09-2010/06，2013/9-2015/6美國羅切斯特大學(xué)骨肌研究中心博士后研究員，導(dǎo)師：解超無無代表性研究成果和學(xué)術(shù)獎勵情況（每項均按時間倒序排序頁碼（摘要論文請加以說明；③對會議論文：應(yīng)按照論文發(fā)表時作者順序列一作者均加注上標(biāo)“#”字樣，通訊作者及共同通訊作者均加注上標(biāo)“*”字樣，ChenY,HallabNJ,LiaoYS,NarayanV,SchwarzEM,XieC.Antioxidantimpregnatedultra-highmolecularweightpolyethyleneweardebrisparticlesdisplayincreasedboneremodelingandasuperiorosteogenic:Osteolyticprofilevs.conventionalUHMWPEparticlesinamurinecalvariamodel.JOrthopRes.2015Oct第32陳宇Dynesys報》陳宇Dynesys報》XieC,LiY,LiQ,ChenY,YaoJ,YinG,BiQ,O'KeefeRJ,SchwarzEM,TylerW.IncreasedInsulinmRNABindingProtein-3ExpressionCorrelatesw