脂肪肝的實驗研究

關于脂肪肝的實驗研究2概述脂肪肝的病因脂肪肝的發(fā)病機制脂肪肝實驗模型的建立方法脂肪肝的診斷脂肪肝的防治第2頁,共95頁，2024年2月25日，星期天3概述第3頁,共95頁，2024年2月25日，星期天4

脂肪肝是僅次于病毒性肝炎的第二位常見肝病，是二十一世紀肝病領域面臨的新挑戰(zhàn)。對于脂肪肝的防治不僅是一個醫(yī)學問題，更是一個社會問題。脂肪肝已成為消化、內分泌、營養(yǎng)、心血管等多學科共同關注的問題。

第4頁,共95頁，2024年2月25日，星期天52011年7月重慶第四屆全國脂肪性肝病學術會議解放軍302醫(yī)院病理診斷與研究中心主任、軍事醫(yī)學科學院博士生導師趙景民教授指出，未來十年，我國將由“病毒性肝炎大國”轉為“脂肪性肝病大國”，應高度重視脂肪性肝病的防治。第5頁,共95頁，2024年2月25日，星期天6正常肝臟脂肪肝第6頁,共95頁，2024年2月25日，星期天7脂肪肝大體標本切面第7頁,共95頁，2024年2月25日，星期天8大泡、小泡性肝脂肪變混雜小泡性肝脂肪變第8頁,共95頁，2024年2月25日，星期天9重度肝脂肪變，脂變肝細胞達90%第9頁,共95頁，2024年2月25日，星期天10脂肪肝基本概念狹義的定義

肝細胞內的脂肪含量（主要是甘油三酯TG）＞肝臟濕重的5%，或肝組織學上每單位面積＞30%的肝實質細胞出現脂肪變性時，稱為脂肪性肝病(fattyliverdisease

，FLD)，簡稱脂肪肝。

第10頁,共95頁，2024年2月25日，星期天11脂肪肝基本概念廣義的定義脂肪肝是遺傳－環(huán)境－代謝應激相關因素所致的，病變主體在肝小葉，以肝細胞脂肪變性為主的的臨床病理綜合征第11頁,共95頁，2024年2月25日，星期天12脂肪肝的分類根據起病方式及病程分類急性脂肪肝：小泡性慢性脂肪肝：大泡性或混合性第12頁,共95頁，2024年2月25日，星期天13脂肪肝的分類根據病因分類

酒精性脂肪性肝?。╝lcoholicfattyliverdisease,AFLD)非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)酒精性脂肪肝（AFL）酒精性肝炎酒精性肝纖維化酒精性肝硬化單純性脂肪肝（NAFL）脂肪性肝炎（NASH）脂肪性肝纖維化和肝硬化第13頁,共95頁，2024年2月25日，星期天14NASH，脂變＞50%，匯管區(qū)中度炎癥細胞浸潤（HE×50)第14頁,共95頁，2024年2月25日，星期天15脂肪肝的流行病學調查

及預后非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）：80%酒精性脂肪性肝?。ˋFLD）：5%其余的是藥物性、中毒性、遺傳性、自身免疫性等脂肪肝第15頁,共95頁，2024年2月25日，星期天16NAFLD的流行病學及預后歐美、日本成人NAFLD檢出率20～33％，其中至少10~15%為NASHNAFLD已成為西歐、美國、澳大利亞、日本第一大慢性肝病及肝酶異常的首要病因亞太地區(qū)NAFLD檢出率12～24％第16頁,共95頁，2024年2月25日，星期天17NAFLD的流行病學及預后代謝綜合征（MS）可使NAFLD患病風險增加4~11倍NAFLD可使糖尿病發(fā)生風險增加3.8~11倍肥胖者：NAFL發(fā)生率60~90%，NASH為20~25%，肝硬化2~8%糖尿病和高脂血癥患者NAFLD檢出率分別為21~78%、27~92%,肥胖2型糖尿病患者可達50%~70%，且多為中度以上第17頁,共95頁，2024年2月25日，星期天18流行病學研究顯示：2型糖尿病患者是脂肪肝的高發(fā)人群2型糖尿病患者患NASH危險性比一般人高2.6倍第18頁,共95頁，2024年2月25日，星期天19中國脂肪肝的流行病學調查

范建高，世界華人消化雜志，01年第1期；中華消化雜志，02年第2期818名北京市干部：18.3%4009名上海市職員：12.8%1050名北京市職工：11.0％1119名南京市干部：10.2%11372名紹興市職工：9.58%3015名杭州市工人：5.2%4100名大慶油田工人：5.15%四川10個寺廟和尚：0.27%來自廣州的一項長達3年的隊列研究顯示，2003年NAFLD患病率為16.3%，而2008年則高達20.5%第19頁,共95頁，2024年2月25日，星期天202011年，北京地壇醫(yī)院副院長、軍事醫(yī)學科學院博導成軍教授對北京市居民（3762名）FLD患病率及其危險因素流行病學調查結果顯示：北京市常住居民

FLD——35.1%NAFLD——31.0%AFLD——4.1%——在過去的7~10年，中國發(fā)達地區(qū)成人脂肪肝患病率增加了一倍第20頁,共95頁，2024年2月25日，星期天21NAFLD的預后NAFL近期預后良好NAFL有12~40%患者8~13年進展為NASHNASH約有25%患者在8~13年發(fā)展為脂肪性肝硬化脂肪性肝硬化患者發(fā)生原發(fā)性肝細胞癌、肝功能衰竭的概率高達30~40%第21頁,共95頁，2024年2月25日，星期天22NAFLD相關腫瘤2014年上海國際消化系統(tǒng)疾病會議：福建漳州報道1例手術證實NAFLD相關肝癌，癌旁組織并無肝硬化。美國國立衛(wèi)生研究院的BinGao教授也有類似的報道

提示：NAFLD可以不經過肝纖維化、肝硬化就發(fā)生肝癌有研究表明，NAFLD與多種腫瘤的發(fā)生相關，包括直腸癌、乳腺癌等，也是目前研究的一項熱點第22頁,共95頁，2024年2月25日，星期天23非酒精性脂肪肝的病情演變脂肪肝纖維化肝硬化脂肪堆積致肝腫大可逆轉纖維組織形成纖維組織無法逆轉結締組織生成破壞肝細胞病變不可逆轉第23頁,共95頁，2024年2月25日，星期天24酒精性肝病ALD的流行病學及預后歐美國家嗜酒人群中ALD患病率高達84%，其中20~30%發(fā)展為肝硬化在美國，ALD為慢性肝病最常見病因，每年

1.5~2萬人死于ALD我國居民ALD發(fā)病率為4~5%，北方＞南方女性對酒精敏感性高，但由于男性嗜酒者多見，ALD男女比例約2:1第24頁,共95頁，2024年2月25日，星期天25酒精性肝病ALD的診斷標準第一條：有長期飲酒史，一般超過5年，折合乙醇量≥40g/d，女性≥20g/d；或2周內有大量飲酒史（＞80g/d）第25頁,共95頁，2024年2月25日，星期天26

酒精量：

飲酒量×酒精度（%）×0.8以56度二鍋頭為例飲用180ml就超過80g

飲用700ml就超過300g*喜力啤酒1000ml——40g第26頁,共95頁，2024年2月25日，星期天27ALD的流行病學及預后酒精量＞80~160g/d，其發(fā)生率增長5~25倍酒精量＞300g/d，8天后就出現酒精性脂肪肝AFLD比NAFLD患者10年內肝硬化發(fā)生率顯著增高（20%對1%）**美國胃腸病學會統(tǒng)計，男性平均每天飲用80g酒精，可能在10年內發(fā)生肝硬化，而女性消耗同等量酒精，5年內就發(fā)生肝硬化第27頁,共95頁，2024年2月25日，星期天28脂肪肝的病因第28頁,共95頁，2024年2月25日，星期天29一、營養(yǎng)性因素1、肥胖病

NAFLD最常見和最肯定的病因肥胖伴酗酒者脂肪肝發(fā)生率達90%以上2、胃腸外營養(yǎng)

全胃腸外營養(yǎng)持續(xù)時間過長可導致肝細胞脂肪變和NASH3、營養(yǎng)不良

蛋白質攝入不足或吸收不良，或膽堿、卵磷脂等缺乏第29頁,共95頁，2024年2月25日，星期天30二、化學性致病因素1、工業(yè)毒物

苯、二氯甲烷、二氯乙烯、鋇鹽等NAFL

CCl4、砷化物、三氯甲烷、磷等肝細胞壞死合并脂肪變2、藥物

長期使用糖皮質激素、大量四環(huán)素、雌激素制劑、氨甲喋呤、胺碘酮等3、酒精中毒：90%酒精在肝臟轉化為乙醛第30頁,共95頁，2024年2月25日，星期天31三、內分泌代謝因素1、糖尿病

2型糖尿病50~70%合并脂肪肝，且大多為中度或中度以上的脂肪肝

NAFLD與胰島素抵抗（IR）、高胰島素血癥有較強的關聯2、高脂血癥

關系最密切的是高甘油三酯血癥，脂肪肝發(fā)病率為60~80%，常伴有肥胖和糖尿病3、皮質醇增多癥、妊娠等亦可導致脂肪肝第31頁,共95頁，2024年2月25日，星期天32四、生物性致病因素

肝炎病毒HBV和HCV感染可引起脂肪肝特別是HCV感染患者中80%伴脂肪肝五、遺傳因素先天性代謝性肝病：肝豆狀核變性、半乳糖血癥、肝糖原貯積病等遺傳易感性：肥胖、糖尿病、原發(fā)性高脂血癥六、其他免疫性疾病如SLE、自身免疫性肝炎等部分病因不明脂肪肝——隱源性脂肪肝第32頁,共95頁，2024年2月25日，星期天33酒精中毒、肥胖、糖尿病

——脂肪肝的三大病因第33頁,共95頁，2024年2月25日，星期天34脂肪肝的發(fā)病機制第34頁,共95頁，2024年2月25日，星期天351998年Day提出的“二次打擊”學說第一次打擊

各種病因作用肝細胞脂肪代謝異常，肝內脂肪沉積第二次打擊肝細胞脂肪變性

脂肪性肝炎、肝纖維化氧化應激和脂質過氧化、細胞因子等作用下第35頁,共95頁，2024年2月25日，星期天36NAFLD的發(fā)病機制脂質代謝障礙激素的作用：胰島素抵抗（IR）瘦素抵抗氧化應激及脂質過氧化損傷細胞因子的作用第一次打擊第二次打擊第36頁,共95頁，2024年2月25日，星期天37肝臟在脂肪代謝中占據中心地位饑餓脂庫脂肪動員脂肪酸肝臟β-氧化酮體肝外組織（腦、肌肉）利用輸出飽食葡萄糖代謝乙酰CoA合成脂肪酸、膽固醇VLDL

（TG+膽固醇+磷脂+載脂蛋白）脂肪組織貯存輸出第37頁,共95頁，2024年2月25日，星期天38β-氧化脂肪酸脂酰輔酶A線粒體β-氧化乙酰輔酶A三羧酸循環(huán)酮體肝外組織氧化供能左旋肉堿第38頁,共95頁，2024年2月25日，星期天39脂質代謝障礙1、血中游離脂肪酸（FFA）增加2、碳水化合物攝取過多3、肝細胞線粒體β-氧化障礙4、VLDL合成障礙第39頁,共95頁，2024年2月25日，星期天40胰島素抵抗（IR）

NAFLD的發(fā)病機制定義：指胰島素作用的靶組織或靶器官（主要是肝臟、肌肉和脂肪組織）對胰島素生物作用的敏感性下降，即正常劑量的胰島素產生低于正常生物學效應的一種狀態(tài)原因：胰島素生物活性下降，或靶器官、靶組織上的受體障礙及受體下調，或受體后缺陷，對胰島素表現為一定的抵抗性，敏感性下降**IR是代謝綜合征的“共同土壤”第40頁,共95頁，2024年2月25日，星期天41胰島素是調節(jié)脂肪合成的主要激素胰島素胰島素抵抗（IR）

NAFLD的發(fā)病機制脂肪組織內的激素敏感性脂肪酶脂肪動員（-）（-）脂肪組織內的脂蛋白脂酶脂肪酸進入脂肪組織合成與貯存（+）（+）血中游離脂肪酸第41頁,共95頁，2024年2月25日，星期天42IR胰島素抵抗（IR）

NAFLD的發(fā)病機制激素敏感性脂肪酶（TG脂酶）活性增強脂肪動員脂蛋白脂酶活性降低脂肪組織合成與貯存血中游離脂肪酸肝內TG合成入肝脂肪肝第42頁,共95頁，2024年2月25日，星期天43瘦素是肥胖基因（ob基因）表達的蛋白質類激素，主要由白色脂肪組織分泌合成作用：抑制食欲、減少能量攝入、抑制脂肪合成、增加能量消耗**瘦素抵抗患者（1）食欲增強，脂肪合成增多，肥胖（2）高瘦素血癥，干擾胰島素的生理功能，誘導IR，促進肝內脂肪貯積瘦素抵抗NAFLD的發(fā)病機制第43頁,共95頁，2024年2月25日，星期天44氧化應激及脂質過氧化損傷NAFLD的發(fā)病機制肝組織內脂肪酸和TG增多線粒體β-氧化速度代償性活性氧（ROS）

ROS

激活磷脂酶A2

膜磷脂花生四烯酸PG、LT等激活NF-κB：細胞因子表達增強TNFα、IL-8等

O·2OH·1O2H2O2脂質過氧化反應生物膜結構功能破壞抑制膜蛋白功能線粒體損傷炎癥反應+不飽和脂肪酸第44頁,共95頁，2024年2月25日，星期天45細胞因子的作用NAFLD的發(fā)病機制肝組織脂肪酸、ROS增多激活Kupffer細胞釋放大量細胞因子如TNFα、TGF-β1、PDGF等肝細胞炎癥、壞死、肝纖維化第45頁,共95頁，2024年2月25日，星期天46細胞因子的作用NAFLD的發(fā)病機制轉化生長因子（TGF-β1）肝纖維化主要始動因子之一

TGF-β1肝星狀細胞（HSC）活化增殖肌成纖維細胞并分泌膠原纖維血小板衍生生長因子（PDGF）目前已知的HSC最強的絲裂原，能刺激HSC活化增殖轉化為肌成纖維細胞，促進肝纖維化的發(fā)生第46頁,共95頁，2024年2月25日，星期天47酒精性脂肪肝的發(fā)病機制長期大量攝入酒精是導致ALD的主要原因酒精對肝臟直接毒性作用氧化應激和脂質過氧化的作用細胞因子的作用第一次打擊第二次打擊第47頁,共95頁，2024年2月25日，星期天48酒精對肝臟直接毒性作用AFLD發(fā)病機制乙醇乙醛乙酸乙醇脫氫酶ADH微粒體乙醇氧化酶系MEOSNAD+NADH乙醛脫氫酶NAD+NADH促進自由基產生，促進膜的脂質過氧化與丙二醛（MDA）等形成加合物損傷肝臟抑制VLDL合成肝內TG轉運障礙，肝TG堆積乙醛NADH/NAD+

抑制線粒體三羧酸循環(huán)

β-氧化肝內TG堆積第48頁,共95頁，2024年2月25日，星期天49氧化應激和脂質過氧化損傷AFLD發(fā)病機制酒精含量高時，其代謝主要由微粒體乙醇氧化酶系（MEOS）起作用MEOS主要成分為細胞色素P4502E1（CYP2E1），在酒精誘導下活化，產生大量ROS，引發(fā)氧化應激和脂質過氧化，造成肝組織炎癥、細胞損傷第49頁,共95頁，2024年2月25日，星期天50細胞因子的作用

AFLD發(fā)病機制ROS等激活Kupffer細胞釋放大量細胞因子如TGF-β1、PDGF等促進肝纖維化**TNFα在ALD中占重要地位長期大量飲酒腸道菌群過度生長，腸粘膜屏障通透性腸細菌移位腸源性內毒素血癥激活Kupffer細胞釋放大量TNFα組織炎癥反應、肝細胞凋亡、壞死激活中性粒細胞，增加ROS的生成第50頁,共95頁，2024年2月25日，星期天51脂肪肝實驗模型的

建立方法第51頁,共95頁，2024年2月25日，星期天52理想的實驗模型與人類疾病特征相似病變有一定發(fā)展過程，與人類發(fā)病過程相似形成率高，動物死亡率低，重復性好造模方法簡單易行，對實驗人員無傷害造模停止后組織學病變逆轉緩慢，便于藥物干預研究第52頁,共95頁，2024年2月25日，星期天53脂肪肝實驗模型NAFLDAFLD特殊品系脂肪肝動物模型營養(yǎng)失調性脂肪肝動物模型毒物或藥物性脂肪肝動物模型體外誘導模型復合模型急性酒精性肝病動物模型慢性酒精性肝病動物模型體外誘導模型第53頁,共95頁，2024年2月25日，星期天54特殊品系脂肪肝動物模型NAFLD模型

（基因突變或基因敲除）1、ob/ob小鼠、db/db小鼠（或fa/fa大鼠）ob/ob小鼠—ob基因自發(fā)突變db/db小鼠—db基因自發(fā)突變fa/fa大鼠—fa基因自發(fā)突變瘦素受體缺乏瘦素抵抗瘦素缺乏**可出現與人類NAFLD相似的特征：過度攝食、肥胖、高脂血癥、高胰島素血癥等第54頁,共95頁，2024年2月25日，星期天55特點：該模型雖有明顯的IR，但不能自發(fā)地由單純性脂肪肝發(fā)展為NASH、肝纖維化解決方案：+蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食、或內毒素、或酒精、或高脂飲食、或再灌注損傷方可演變?yōu)镹ASH、肝纖維化意義：研究由肝脂肪變向NASH進展、NASH向纖維化進展的良好模型第55頁,共95頁，2024年2月25日，星期天56特殊品系脂肪肝動物模型

NAFLD模型2、幼齡內臟脂肪變小鼠（JVS）模型

——系統(tǒng)性肉毒堿缺乏模型表現：出生3~28天，小鼠生長緩慢，肝腫大，肝細胞脂肪變性機理：肉毒堿是轉運脂肪酸進入線粒體進行β氧化所必須的物質。第56頁,共95頁，2024年2月25日，星期天57特殊品系脂肪肝動物模型NAFLD模型3、FLS小鼠模型

1999年Soga等用同系交配法建立了一種無過度攝食、不出現肥胖和糖尿病而伴有脂肪肝的新品種。

表現：新生的FLS小鼠的肝細胞內即有細小的脂肪顆粒聚集，隨年齡增長進行性加重，肝臟TG含量較同齡小鼠升高5倍，伴ALT和AST增高、炎癥反應，而血脂無異常。

12個月多自發(fā)形成肝細胞癌（HCC），但未見肝硬化意義：可作為人類非肥胖、糖尿病而伴有脂肪肝和人類NASH相關HCC機制研究的模型第57頁,共95頁，2024年2月25日，星期天58特殊品系脂肪肝動物模型

NAFLD模型特殊品系動物模型因基因突變或缺失，引起脂肪代謝障礙，能自發(fā)形成脂肪肝缺點：

1、可建立先天性和幼年型脂肪肝模型，但不適于后天營養(yǎng)障礙所致的脂肪肝的研究

2、多缺乏NASH和肝纖維化的自然演變過程，僅適合NAFLD特定發(fā)病機制的研究

3、實驗動物成本高，來源較困難，死亡率高，缺乏廣泛應用的可行性第58頁,共95頁，2024年2月25日，星期天59營養(yǎng)失調性脂肪肝動物模型NAFLD模型1、蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食模型

——國際上經典的NASH動物模型機理：蛋氨酸、膽堿缺乏導致線粒體β-氧化障礙、

VLDL合成減少表現：MCD飲食小鼠，2周后形成NASH，肝內可見活化的巨噬細胞浸潤，伴NF-κB激活、炎性細胞因子、粘附分子等表達增加，12W出現肝纖維化特點：MCD飲食模型有明顯的氧化應激、線粒體損傷及細胞凋亡；與人類NASH相比，動物多出現ALT過高、TG過低、不引起IR等表現第59頁,共95頁，2024年2月25日，星期天60意義：用于NSAH及肝纖維化的機制及藥物篩選、藥物干預研究，并為非肥胖而伴NASH等特殊脂肪營養(yǎng)障礙疾病提供研究思路缺點：MCD飲食價格昂貴，且不符合人類膳食結構第60頁,共95頁，2024年2月25日，星期天61營養(yǎng)失調性脂肪肝動物模型NAFLD模型2、高脂飲食（HFD）模型

——國內最常用的模型配方：多種，構造原理基本一致，主要差別在于飲食中脂肪占供能物質的比例不等（10%~71%），含或不含高碳水化合物特點：

A、造模周期長，約4~12W，甚至半年，成功率高

B、病變有一定的發(fā)展過程，在發(fā)病機制、臨床表現上與人類NAFLD最相似，且多合并肥胖、IR等第61頁,共95頁，2024年2月25日，星期天62高脂飲食常用配方A、華天懿等：高脂飼料喂養(yǎng)大鼠12W

基礎飼料50%+豬油10%+奶粉10%+雞蛋30%表現：大鼠第2W開始體重增長加速，至第4W體重已明顯高于對照組，肝TG、膽固醇明顯增加，肝細胞脂肪變。意義：與兒童單純性肥胖癥的自然發(fā)病過程相似，對該病及并發(fā)的脂肪肝的防治研究有一定的意義第62頁,共95頁，2024年2月25日，星期天63高脂飲食常用配方B、祁培宏等：普通飼料喂養(yǎng)大鼠1W，再用脂肪乳劑灌胃4W

乳清酸5%+膽固醇10%+豬油20%+蛋黃粉1%表現：肝臟體積變大，濕重增加，色黃，切面油膩；HE染色肝細胞呈大泡性脂肪變，血清、肝臟TG、膽固醇顯著升高第63頁,共95頁，2024年2月25日，星期天64高脂飲食常用配方C、徐正婕、鐘嵐、范建高等：HFD飼養(yǎng)雄性SD大鼠

標準飼料88%+豬油10%+膽固醇2%表現：

4w出現肝脂肪變；8w呈現單純性脂肪肝；12w形成NASH，伴ALT水平升高；24w出現明顯竇周纖維化；36~48w纖維化加劇意義：本模型與人類肥胖癥合并高脂血癥及脂肪肝的病例極為相似，可用于血脂調整藥物防治動脈粥樣硬化和脂肪肝的藥理研究第64頁,共95頁，2024年2月25日，星期天65高脂飲食常用配方D、美國Charles等：高脂液體飼料喂養(yǎng)SD大鼠

脂肪71%+碳水化合物11%+蛋白18%表現：3周可形成全小葉肝細胞脂肪變，伴有TNFa和I型膠原mRNA的表達增強，可誘發(fā)線粒體損傷和氧化應激意義：造模方法簡單，所需時間較短，與人體高脂血癥性脂肪肝機制相似，是一種用于該病研究的經典模型缺點：每天灌胃較為繁瑣，操作不當可引起動物窒息死亡第65頁,共95頁，2024年2月25日，星期天66營養(yǎng)失調性脂肪肝動物模型NAFLD模型3、高糖飲食大鼠模型高蔗糖/果糖飲食**在Wistar大鼠的飲用水中加入10%蔗糖，48小時內即能在其體內觀察到脂肪酸合成增加**SD大鼠在含蔗糖70%的飲食喂養(yǎng)后出現肥胖，2~3周可形成脂肪肝，并伴有參與脂肪合成的酶類增加，雄性鼠肝損傷更為嚴重意義：形成機制與部分人群，尤其是女性不良飲食習慣導致的脂肪肝相似。但是雄性鼠比雌性鼠對高糖誘導的肝損傷具有更高的易感性

第66頁,共95頁，2024年2月25日，星期天67營養(yǎng)失調性脂肪肝動物模型NAFLD模型4、禁食后高糖飼料誘發(fā)大鼠脂肪肝模型**Leclercq等將雄性Wister大鼠禁食48h后給予高糖飼料，2d后大鼠肝內脂肪含量較正常增加235%，呈現肝細胞單純性脂肪變性意義：禁食后再進食導致脂肪肝的可能機制為肝臟合成脂肪酸和脂肪酸的循環(huán)失衡，TG的合成和分泌失衡第67頁,共95頁，2024年2月25日，星期天68營養(yǎng)失調性脂肪肝動物模型NAFLD模型5、玉米油注射大鼠脂肪肝模型

墨西哥Terrazos—Luch等采用皮下注射玉米油的方法建立大鼠脂肪肝模型6、全胃腸外營養(yǎng)（TPN）脂肪肝模型

予成年大鼠深靜脈插管，導管接電腦輸液泵，將營養(yǎng)液以3ml/h的滴速持續(xù)滴注。靜脈營養(yǎng)液中非蛋白能量占33%以上，1W后大鼠肝臟即出現明顯的脂肪變性。

此造模方法時間短、成功率高，但操作復雜，限制了實驗的廣泛應用第68頁,共95頁，2024年2月25日，星期天69毒物或藥物性脂肪肝動物模型

NAFLD模型1、四氯化碳（CCl4）誘發(fā)模型

CCl40.5ml/kg，每周3次，大鼠皮下注射

表現：短時間內即可觀察到中央靜脈周圍中重度大泡性肝細胞脂肪變，伴炎癥及壞死；6W可出現肝纖維化；12W可見肝硬化。機理：CCl4誘導CYP2E1激活及嚴重脂質過氧化反應造成肝細胞結構和功能破壞優(yōu)缺點：模型復制率100%，但死亡率高達20~40%

第69頁,共95頁，2024年2月25日，星期天70毒物或藥物性脂肪肝動物模型

NAFLD模型2、四環(huán)素誘發(fā)模型

*雄性大鼠一次性口服四環(huán)素1g/kg，在24h即可見肝細胞小泡性脂肪變，并伴膽固醇、TG合成增加及脂肪酸β-氧化受抑制。

*另有報道，經四環(huán)素單次誘導即可使肝臟TG水平增加270%，并出現小泡性脂變。機理：四環(huán)素沉積于肝細胞線粒體，抑制線粒體DNA復制，干擾mRNA翻譯成載脂蛋白，繼而影響肝內TG的轉運及線粒體脂肪酸的β-氧化第70頁,共95頁，2024年2月25日，星期天71毒物或藥物性脂肪肝動物模型

NAFLD模型

藥物或毒物誘導模型具有成型時間短、方法簡便、病變明顯等特點但其發(fā)病機制、病理、病理生理改變與人類常見脂肪肝類型差異較大，未出現肥胖和IR，且動物肝損傷嚴重，死亡率高

第71頁,共95頁，2024年2月25日，星期天72體外誘導模型

NAFLD模型

——肝細胞株脂肪變性模型**2002年日本Okamoto等，用含有1mmol／L油酸的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)人HepG2細胞24h，成功地建立了一個體外的脂肪肝模型，細胞內TG增加**以正常成人肝細胞株（L-02）等為材料，在培養(yǎng)液中加入不同濃度的TG、油酸、亞油酸、花生四烯酸等脂質建立體外脂肪肝模型意義：應用此模型可在細胞水平進行脂肪肝發(fā)病機制及干預治療的體外研究第72頁,共95頁，2024年2月25日，星期天73復合模型

NAFLD模型目的：在基因模型的基礎上聯合應用營養(yǎng)、藥物誘發(fā)模型，試圖使新模型的表型與人類NAFLD更接近，并能反映疾病從單純性脂肪肝向NASH進展，NASH向肝纖維化進展的過程常見復合模型：ob/ob小鼠+MCD飲食，db/db小鼠+MCD飲食，fa/fa大鼠+HFD等意義：復合模型均可產生IR、肥胖以及NASH和纖維化，最大程度地模擬了人類NAFLD的復雜性，病理變化顯著，是一種極具潛力的NASH模型第73頁,共95頁，2024年2月25日，星期天74急性酒精性肝病動物模型

AFLD模型健康成熟雄性Wistar或SD大鼠，自由飲水+普通飼料

1、56度白酒灌胃，每次7ml/kg，每日2次

2、腹腔注射一定濃度乙醇，每次20ml/kg，每日2次

1~2W后成功復制大鼠急性酒精性肝損傷模型，表現為肝細胞脂肪變性和炎癥細胞浸潤。灌胃法明顯優(yōu)于腹腔注射法，后者死亡率高，且不符合人類的飲酒習慣第74頁,共95頁，2024年2月25日，星期天75慢性酒精性肝病動物模型AFLD模型1、酒精液體飲料模型

A、大鼠模型：Keegan等在飲水中加40%酒精，29W后實驗鼠出現肝細胞脂肪變、炎癥、壞死和中央靜脈周圍硬化優(yōu)點：造模方法簡單，與人類酒精性肝病相近缺點：耗時長，且大鼠厭酒，攝入量難以控制

B、微豬模型：固體飼料+占每日熱量40%的酒精飲料，1個月后血ALT升高，12個月后出現肝細胞脂肪變，局灶性炎細胞浸潤及中央靜脈周圍纖維化優(yōu)點：微豬可隨意食用酒精飲料，與人類酒精性肝損傷較接近和較自然的動物模型缺點：造模時間長，費用較高第75頁,共95頁，2024年2月25日，星期天76慢性酒精性肝病動物模型AFLD模型2、酒精灌胃模型

A、Tsukamato-French大鼠模型

Tsukamato-French等給SD大鼠手術植入胃管，持續(xù)注入含酒精的液體食料，維持大鼠血中200～300mg/dl的酒精濃度。表現：造模3個月，成功的建立了從肝細胞脂肪變性、小葉中央壞死、炎性細胞浸潤至肝纖維化的進行性酒精性肝損傷模型優(yōu)點：可完全控制酒精和各種營養(yǎng)物質的攝入量，且病變符合進行性酒精性肝損傷的演變規(guī)律缺點：造模技術復雜、實驗設備較昂貴、強制性持續(xù)注入含酒精食料，不符合人類脂肪肝形成過程

第76頁,共95頁，2024年2月25日，星期天77酒精灌胃模型B、美國Iimuro等選用年齡和體重匹配的雌性和雄性Wister大鼠，酒精灌胃（11-12g/kg/d）4W，雌性大鼠血清AST高于雄性大鼠，肝組織脂肪變、炎癥及壞死亦以雌性鼠發(fā)展更快、更嚴重，累及全小葉，說明雌性大鼠對乙醇導致的肝損傷更敏感

C、范建高等在大鼠高脂飲食基礎上，用60%的酒精15mg/kg灌胃，每日2次，3個月后出現輕、中度肝細胞脂肪變，6個月時出現中度以上脂肪變、局灶性炎癥伴肝細胞壞死和纖維化第77頁,共95頁，2024年2月25日，星期天78慢性酒精性肝病動物模型AFLD模型3、Liber-Decarli大鼠模型

Liber和Decarli配制出含酒精和全營養(yǎng)素的液體食料：糖類47%（其中36%的熱量由酒精代替），蛋白質18%，脂肪35%，及適量的維生素和無機鹽。造模大鼠只喂該食料，酒精攝入量達12～18g/kg，造模4W即出現明顯的肝細胞脂肪變性。

優(yōu)點：Liber-Decarli液體食料已商品化出售，還可用于小鼠、家兔、豚鼠等。該模型簡便易行，費用低，形成率高及穩(wěn)定性好第78頁,共95頁，2024年2月25日，星期天79體外誘導模型

AFLD模型2010年廖于等用含0.28%乙醇的培養(yǎng)液，培養(yǎng)人正常肝細胞株（L-02）。誘導、傳代至第30代（Ld30，6天為一周期），L-02細胞發(fā)生脂肪變，細胞內TG顯著增加，即AFLD模型成功建立。第79頁,共95頁，2024年2月25日，星期天80我們的造模方法1、NAFLD大鼠模型

20%玉米油（高溫煮沸）+80%普通飼料，自由飲用清水。

大鼠進食量多，體重增加明顯。6W后肝組織內彌漫性細胞脂肪變性，部分肝組織出現點狀或灶狀壞死，炎癥細胞浸潤，血清TG、AST、ALT，肝臟TG均顯著增高。造模成功。第80頁,共95頁，2024年2月25日，星期天81我們的造模方法2、高脂-酒精混合性脂肪肝大鼠模型高脂飼料（同上），56度白酒灌胃（10ml/kg），每日1次，自由飲用清水。

**6W后，血清TG、AST、ALT，肝臟TG均顯著增高，肝細胞彌漫性脂肪變性，匯管區(qū)炎癥細胞浸潤較明顯，壞死灶多見，部分可見纖維組織增生。脂肪肝復制成功率100%，脂肪性肝炎發(fā)生率45%優(yōu)點：兩種模型，均是模擬現代人類飲食結構的改變及脂肪肝的成因，符合人類脂肪肝的演變過程，方法簡單易行，原料價廉易得，耗時較短，成功率高。第81頁,共95頁，2024年2月25日，星期天8