蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)

關(guān)于蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)

1.加深理解所學(xué)有關(guān)的蛋白質(zhì)性質(zhì)的理論知識(shí)

2.掌握氨基酸和蛋白質(zhì)常用的定性、定量分析的方法及原理

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹康?頁,共18頁，2024年2月25日，星期天一、蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)是指蛋白質(zhì)所含的某些氨基酸及其特殊結(jié)構(gòu)，在一定條件下可與某些試劑發(fā)生了生成有色物質(zhì)的反應(yīng)。不同蛋白質(zhì)分子所含的氨基酸殘基不完全相同，因此所發(fā)生的成色反應(yīng)也不完全一樣。呈色反應(yīng)并不是蛋白質(zhì)的專一反應(yīng)。因此，不能僅僅根據(jù)呈色反應(yīng)的結(jié)果為陽性就來判斷被測物質(zhì)一定是蛋白質(zhì)，至少要用2種以上的方法來鑒別。第3頁,共18頁，2024年2月25日，星期天（一）雙縮脲反應(yīng)【實(shí)驗(yàn)原理】當(dāng)尿素經(jīng)加熱至180℃左右時(shí)，兩分子尿素脫去一分子氨，進(jìn)而縮合成一分子雙縮脲。其在堿性條件下雙縮脲與銅離子結(jié)合成紅紫色絡(luò)合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。其反應(yīng)過程如下：第4頁,共18頁，2024年2月25日，星期天多肽及蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中均含有許多肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲分子中的亞酰胺鍵相同。因此，在堿性條件下與銅離子也能呈現(xiàn)出類似于雙縮脲的呈色反應(yīng)。其反應(yīng)過程如下：第5頁,共18頁，2024年2月25日，星期天【試劑】蛋白質(zhì)溶液（雞蛋清用蒸餾水稀釋10倍，通過2-3層紗布濾去不溶物）2.0.1%的甘氨酸溶液3.0.01%精氨酸溶液4.10%NaOH溶液5.1%CuSO4溶液6.尿素結(jié)晶第6頁,共18頁，2024年2月25日，星期天【實(shí)驗(yàn)流程】雙縮脲的制備少許尿素結(jié)晶于干燥試管中微火加熱尿素熔解至硬化停止加熱看到有白色氣體冷卻加10%氫氧化鈉溶液約1ml震蕩加入1%硫酸銅溶液2滴震蕩觀察顏色的變化如圖所示第7頁,共18頁，2024年2月25日，星期天注意：(1)尿素結(jié)晶不要取多，約火柴頭大小。(2)在操作過程中試管不能沖向他人以防止?fàn)C傷。(3)控制加熱的時(shí)間既不能過長也不能過短。(4)加熱時(shí)火不能太大，防止碳化。(5)銅離子不能多加，否則與氫氧化鈉形成藍(lán)色的氫氧化銅，干擾試驗(yàn)結(jié)果。第8頁,共18頁，2024年2月25日，星期天（二）茚三酮反應(yīng)【實(shí)驗(yàn)原理】

在弱酸條件下（pH5-7），蛋白質(zhì)或氨基酸與茚三酮共熱，可生成藍(lán)紫色縮合物。此反應(yīng)為一切蛋白質(zhì)和α—氨基酸所共有(亞氨基酸如脯氨酸和羥脯氨酸產(chǎn)生黃色化合物)，含有氨基的其他化合物亦可發(fā)生此反應(yīng)。第9頁,共18頁，2024年2月25日，星期天【試劑】1.蛋白質(zhì)樣液（與雙縮脲反應(yīng)相同）2.0.1%的甘氨酸溶液3.0.2%茚三酮溶液第10頁,共18頁，2024年2月25日，星期天【實(shí)驗(yàn)流程】取試管2支，分別加入蛋白質(zhì)樣液及0．1％甘氨酸溶液1ml，然后各加入茚三酮溶液0.5ml，混勻后于沸水浴中加熱數(shù)分鐘，觀察顏色變化如圖所示：第11頁,共18頁，2024年2月25日，星期天（三）黃色反應(yīng)【實(shí)驗(yàn)原理】

在蛋白質(zhì)分子中，具有芳香環(huán)的氨基酸(如酪氨酸，色氨酸等)殘基上的苯環(huán)經(jīng)硝酸作用可生成黃色的硝基化合物，在堿性條件下生成物可轉(zhuǎn)變?yōu)榻埸S色的硝醌衍生物,反應(yīng)為:第12頁,共18頁，2024年2月25日，星期天

多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以都會(huì)發(fā)生黃色反應(yīng)。苯丙氨酸不易硝化，需加少量濃硫酸后才能夠發(fā)生黃色反應(yīng)。第13頁,共18頁，2024年2月25日，星期天【試劑】1.蛋白質(zhì)樣液（與雙縮脲反應(yīng)相同）2.濃硝酸3.20%NaOH4.0.1%石炭酸溶液第14頁,共18頁，2024年2月25日，星期天【實(shí)驗(yàn)流程】1.取0.1%石炭酸溶液約1ml放在試管內(nèi)，加濃硝酸5滴（注意不要弄到手上），水浴加熱，觀察結(jié)果如右圖所示：2.取潔凈試管1支，加蛋白質(zhì)樣液1ml和濃硝酸5滴，出現(xiàn)沉淀，加熱，不必至沸騰，沸騰比較危險(xiǎn)，則沉淀變成黃色，待試管冷卻后，向兩管各加20％NaOH溶液使成堿性，觀察顏色變化如圖所示：第15頁,共18頁，2024年2月25日，星期天（四）考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)【實(shí)驗(yàn)原理】

考馬斯亮藍(lán)具有紅色和藍(lán)色兩種色調(diào)。在酸性溶液中，其以游離態(tài)存在呈棕紅色；當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后變成為藍(lán)色。它染色靈敏度高，比氨基黑高3倍。反應(yīng)速度快，約在2分鐘左右時(shí)間達(dá)到平衡，在室一小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。在0.01~1.0mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與A595nm值成正比。所以常用來測定蛋白質(zhì)含量。第16頁,共18頁，2024年2月25日，星期天【試劑】1.蛋白質(zhì)溶液（雞蛋