《cDNA文庫構建》課件

cDNA文庫的構建

主要內容一、基因文庫的概念及意義文庫〔library〕：指一種全體的集合?；蛭膸臁瞘enelibrary〕:是某一生物類型全部基因的集合，這些基因以克隆的形式存在〔人工構建〕?；蛭膸炫c基因庫〔genebank〕區(qū)別基因文庫與基因克隆基因庫是指某一生物群體中的全部基因?；蚩寺∈侵话承┨囟ɑ蚧駾NA片段的克隆。基因文庫中包含著為數(shù)眾多的克隆，建成后可供隨時選取其中任何一個基因克隆之用。構建基因文庫的意義☆使生物的遺傳信息以穩(wěn)定的重組體形式貯存起來;☆是一種別離克隆目的基因的主要途徑；☆基因文庫也是復雜基因組作圖的重要依據(jù)。根據(jù)基因類型〔重組DNA片段的供體〕基因組文庫和cDNA文庫1、基因組文庫構建流程抽提基因組DNA鳥槍法制備DNA片段DNA片段與載體重組轉化宿主菌篩選目的基因〔核酸探針法、免疫結合法〕基因文庫限制性內切酶……克隆、轉化、培養(yǎng)、鑒定基因組DNA基因文庫基因組DNA文庫限制性內切酶基因組DNA基因重組轉化細菌體外包裝特點及應用：包含所有遺傳信息構建難度大〔單拷貝基因、長片段基因〕篩選難度大用于研究基因在基因組中的情況基因組物理圖譜的構建基因組序列分析基因在染色體上的定位克隆鑒定基因調控元件基因組中基因的結構和組織形式分析基因組DNA文庫應用結構基因外顯子內含子轉錄、加工修飾mRNA2、cDNA文庫cDNA是指以mRNA為模板，在反轉錄酶的作用下形成的互補DNA(簡稱cDNA)。cDNA文庫(complementaryDNAlibrary)以組織細胞中的mRNA為模板，反轉錄合成雙鏈cDNA，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導入宿主細胞克隆擴增。這些在重組體內的cDNA的集合即cDNA文庫。代表特定細胞或組織中mRAN的文庫cDNA文庫的構建：基因重組反轉錄酶mRNAcDNA自20世紀70年代中期首例

cDNA

克隆問世以來，構建

cDNA

文庫已成為研究功能基因組學的根本手段之一。cDNA

便于克隆和大量表達，它不像基因組含有內含子而難于表達，因此可以從

cDNA

文庫中篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達。通過構建

cDNA

表達文庫不僅可保護瀕危珍惜生物資源，而且可以提供構建分子標記連鎖圖譜的所用探針，更重要的是可以用于別離全長基因進而開展基因功能研究。因此，cDNA

在研究具體某類特定細胞中基因組的表達狀態(tài)及表達基因的功能鑒定方便具有特殊的優(yōu)勢，從而使它在個體發(fā)育、細胞分化、細胞周期調控、細胞衰老和死亡調控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應用價值，是研究工作中最常使用到的基因文庫。

cDNA文庫優(yōu)點(1)使遺傳物質為RNA病毒可建立文庫；(2)因克隆數(shù)比基因組文庫少得多，易于篩選；(3)從分化特異的細胞的cDNA文庫中可別離到特異表達的基因。(4)建庫時已排除了其它的RNA，使假陽性率減低。(5)cDNA文庫可在細菌中表達，可用多種策略進行篩選。cDNA文庫便于克隆和大量擴增，可以從cDNA文庫中篩選到所需目的基因，并用于該目的基因的表達。一個細胞在任何時間可以產(chǎn)生幾千種不同的蛋白質，所有的蛋白質都有相應的mRNA分子。為了鑒別其中任何一個mRNA分子，每一單獨mRNA的克隆都得考慮，但是mRNA不能直接用于克隆，因為它很不穩(wěn)定，因此，可以合成與選定組織中所有mRNA互補的DNA分子〔complementaryDNA，cDNA〕。信息量遠小于基因組文庫注意(1)細胞中不同mRNA的豐度不同，低豐度的mRNA要求很高的克隆數(shù)(要用公式來計算)。(2)有的基因表達具有嚴格的時空性，要獲得其mRNA并非易事。用不同發(fā)育階段，或不同組織細胞中的mRNA制備的cDNA文庫會包含一些共同和特異序列。這可用于別離差異表達的基因。(3)cDNA文庫的DNA無內含子、調節(jié)元件和基因間DNA。不能用于基因結構和調節(jié)的研究。一個基因經(jīng)不同的剪接可產(chǎn)生不同的局部重疊的cDNA克隆。3、cDNA文庫和基因組文庫的區(qū)別

時效性cDNA文庫代表某一時期特定細胞或組織中mRAN，是轉錄水平，僅反映某一時期特定組織表達的功能基因，不是全部基因；而基因組文庫包含該生物所有基因，序列組成不同cDNA文庫無間隔序列和調控區(qū)等非編碼區(qū)；基因組文庫可真實顯示基因組的全部結構信息，由于制備DNA片段的切點是隨機的，所以每一克隆內所含的DNA片段既可能是一個或幾個基因，也可能是一個基因的一局部或除完整基因外還包含著兩側的鄰近DNA順序。兩種文庫均有應用，如何選擇根據(jù)試驗目的，在別離植物RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、別離植物特定發(fā)育階段或特特異表達的基因時應用cDNA文庫；在研究mRNA不存在的序列及基因組作圖時必須構建基因組文庫。亞克隆文庫將人工染色體文庫或粘粒文庫中克隆的大片段DNA用鳥槍法〔shotgun〕隨機小片段化，然后用這些隨機小片段建立的DNA文庫二、cDNA基因文庫的類型

依據(jù)起始mRNA是否經(jīng)過標準化預處理：非標準化cDNA文庫和標準化cDNA文庫文庫功能：克隆文庫和表達文庫載體類型：質粒、噬菌體、粘粒和人工染色體文庫根據(jù)文庫構建過程中是否對克隆進行過全長選擇分為普通cDNA文庫和全長cDNA文庫依據(jù)第一鏈反轉錄引物不同分為隨機引物cDNA文庫和Oligod(T)cDNA文庫〔一〕非標準化cDNA文庫和標準化cDNA文庫依據(jù)起始mRNA是否經(jīng)過標準化預處理，可將文庫分為非標準化cDNA文庫(unnormalizedcDNAlibrary)和標準化cDNA文庫(normalizedcDNAlibrary);前者反映了組織中所有基因的表達水平，適于基因表達譜分析，但文庫中冗余較高，發(fā)現(xiàn)新基因效率低。后者往往經(jīng)過雜交〔均一化〕、扣除雜交(subtractivehybridization)、抑制性扣除雜交(suppressionsubtractivehybridization)處理，不能反映建庫材料的基因表達情況，不能用于表達譜構建，但是新基因發(fā)現(xiàn)效率提高了。在研究基因功能和表達調控時，建立減法文庫是一個很好的策略。它是通過野生行DNA和缺失型DNA，或不同時空、不同環(huán)境條件下的兩種CDNA樣品反復雜交，去處雜交體后，將剩余的DNA或CDNA片段進行克隆而構建的文庫?！捕掣鶕?jù)文庫的功能分：克隆文庫和表達文庫〔1〕克隆文庫由克隆載體構建，載體具有復制子、多克隆位點及選擇標記，可通過細菌培養(yǎng)使克隆片段大量增殖?？寺』蛑饕煤怂崽结槪捎玫鞍踪|序列或同源序列?！?〕表達文庫由表達載體構建，載體除具有克隆載體的元件外，還具有控制基因表達的序列，如啟動子、SD序列、ATG、終止子等，可在宿主細胞內表達出克隆片段的編碼序列，它可分為融合蛋白表達載體和天然蛋白表達載體。別離基因時，由于克隆片段的基因表達產(chǎn)物蛋白質具有抗原性和生物活性，所以除核酸探針外，還可用免疫學探針和生物功能進行篩選。表達文庫適合于那些不知道蛋白質的氨基酸序列、不能用核酸類探針篩選的目的基因別離?！踩巢煌d體文庫主要有質粒、噬菌體、粘粒和人工染色體四大類，每類中由有許多不同的載體，不同的載體適于構建不同的基因文庫。質粒文庫噬菌體文庫粘粒文庫人工染色體文庫構建文庫的載體1.λ噬菌體載體根底：裸露的噬菌體重組DNA轉化宿主細胞或包裝后轉染宿主細胞。載體篩選：在細菌菌苔中形成噬菌斑。重組篩選：插入載體—通過可見標記的插入失活(cI基因的打斷阻止溶源性，產(chǎn)生的噬菌體更清澈；現(xiàn)代的載體攜帶lacZ基因，以蘭-白篩選)。置換載體—Spi-表型(對P2感染敏感性消失)是中心“填充片段〞gam和red基因座喪失引起的。供體DNA的大?。翰迦胼d體：0-10kbp;置換載體：9-23kbp。插入大小范圍被有效形成噬菌斑的野生型基因組75-105％所限制。主要應用：插入載體:cDNA克隆和表達文庫;噬菌體展示。置換載體:基因組DNA克隆。2.粘粒(cosmid)載體根底：包含λ噬菌體cos位點的質粒；導入宿主：經(jīng)體外包裝，再轉染宿主細胞；載體篩選：類似于質粒重組篩選：可見標記插入失活和小片段插入的陽性篩選；供體DNA大?。?0-45kbp。插入大小范圍被有效形成噬菌斑的野生型基因組75-105％所限制。主要應用：基因組文庫構建。3.質粒載體構建cDNA文庫4.大容量克隆載體(1)細菌人工染色體(bacterialartificialchromosomes,BACs,fosmids)根底：大腸桿菌F質粒導入宿主：電轉化載體篩選：顯性選擇標記重組篩選：插入片段大小供體DNA大?。?gt;300kbp主要應用：大基因組分析評論：低頻率的重排和嵌合分子。載體在每個細胞中維持一個或兩個拷貝，產(chǎn)生少量供體DNA。(2)P1載體和P1人工染色體(P1artificialchromosomes,PACs)根底：噬菌體P1導入宿主：體外包裝和轉導載體篩選：顯性選擇標記重組篩選：應用對致死標記的打斷進行陽性篩選供體DNA大?。杭s100kbp主要應用：大基因組分析評論：重排和嵌合分子少。載體維持低拷貝，但可以通過誘導噬菌體P1溶菌循環(huán)擴增。(3)酵母人工染色體(yeastartificialchromsomes,YACs)根底：釀酒酵母中心粒、端粒和ARS導入宿主：轉化酵母原生質體載體篩選：顯性篩選標記(營養(yǎng)缺陷型的恢復)重組篩選：插入片段大小供體DNA大?。?gt;2000kbp主要應用：大基因組分析，YAC轉基因小鼠評論：YAC的缺點是高頻率的自發(fā)缺失，和克隆的嵌合化。重組載體的大小，需要電泳分析，有時難以區(qū)分內源性染色體。YAC維持低拷貝。隨機引物cDNA文庫和Oligod(T)cDNA文庫三、幾種cDNA文庫的介紹經(jīng)典cDNA文庫全長cDNA文庫均一化cDNA文庫差減cDNA文庫(SubtractivecDNAlibrary)全長差減均一化cDNA文庫

固相cDNA文庫構建〔一〕經(jīng)典cDNA文庫構建的根本原理用Oligo(dT)作逆轉錄引物，或者用隨機引物，給所合成的cDNA加上適當?shù)倪B接接頭，連接到適當?shù)妮d體中獲得文庫。其根本步驟包括：〔1〕RNA的提取(例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍—有機溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定)，要構建一個高質量的cDNA文庫，獲得高質量的mRNA是至關重要的，所以處理mRNA樣品時必須仔細小心。由于RNA酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個無RNA酶的環(huán)境對于制備優(yōu)質RNA很重要?！?〕合成cDNA在獲得高質量的mRNA后，用反轉錄酶Oligo(dT)引導下合成cDNA第1鏈，cDNA第2鏈的合成(用RNA酶H和大腸桿菌DNA聚合酶I，同時包括使用T4噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌DNA連接酶進行的修復反響)，〔3〕合成接頭的參加、將雙鏈DNA克隆到載體中去、分析cDNA插入片斷，擴增cDNA文庫、對建立的cDNA文庫進行鑒定。這里強調的是對載體的選擇，常規(guī)用的是λ噬菌體，這是因為λDNA兩端具有由12個核苷酸的粘性末端，可用來構建柯斯質粒，這種質粒能容納大片段的外源DNA。高質量mRNA的制備反轉錄生成cDNA與噬菌粒載體分子相連接噬菌粒的包裝cDNA噬菌粒文庫的主要步驟：1、高質量mRNA的制備用試劑盒提取總RNA參加與生物素相連的寡聚(dT)引物溫育參加與微磁球相連的抗生物素蛋白用磁場吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相連的mRNA洗脫得到mRNA2、反轉錄生成cDNA以寡聚dT或隨機6核苷酸為引物反轉錄酶cDNA第一鏈以cDNA第一鏈為模板合成cDNA第二鏈加接頭準備與載體連接為了得到有方向性的cDNA應該接上不同的接頭參加帶有酶切位點的寡聚dT引物高活性的反轉錄酶合成cDNA的第一鏈合成cDNA第二鏈用RNaseH分解RNA鏈加EcoRI接頭用XhoI內切酶切割得到雙接頭有方向性的cDNA(5'C↓TCGAG)3、與噬菌體載體分子相連接帶有接頭的cDNA噬菌粒DNA經(jīng)內切酶切割含有cDNA插入片段的重組噬菌粒DNA4、噬菌粒的包裝含有cDNA插入片段的重組噬菌粒DNA體外蛋白質外殼的包裝反響有侵染和復制能力的成熟噬菌體進行基因組學的研究含有某種組織或器官的噬菌粒文庫經(jīng)典cDNA文庫優(yōu)缺點經(jīng)典cDNA文庫的構建雖然高效、簡便，但文庫克隆的片段一般較小，單個克隆上的DNA片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要幾個克隆才能覆蓋一個完整的全基因的cDNA?！捕橙LcDNA文庫構建的原理為了克隆到真正的cDNA全長，建立富含全長的cDNA文庫具有重要意義。為此，必須克服僅用mRNA的Poly〔A〕尾合成以及由普通逆轉錄酶作用特點所導致的局限性。全長cDNA文庫，是指從生物體內一套完整的mRNA分子經(jīng)反轉錄而得到的DNA分子群體，是mRNA分子群的一個完整的拷貝。全長cDNA文庫不僅能提供完整的mRNA信息，而且可以通過基因序列比對得到mRNA剪接信息，此外，還可以對蛋白質序列進行預測及進行體外表達和通過反向遺傳學研究基因的功能等?；蛑亟M反轉錄酶mRNAcDNAcDNA文庫的組建：反轉錄引物和反轉錄酶為了防止oligo(dT)作為cDNA第一鏈合成的引物造成的cDNA短截現(xiàn)象，人們對第一鏈引物末端的兩個堿基作了改進(dT)nVN，其中V可以是A,C或G,N那么為A.T.C,G中的任意一種堿基，這就防止了由于mRNA內部存在寡聚(T)而造成的cDNA對應于mRNA的3’端出現(xiàn)的短截現(xiàn)象。傳統(tǒng)的逆轉錄酶AMV和MMLV等都不能逆轉錄出很長的cDNA.SuperscriptIITM(GibcoBRL)的推出，使逆轉錄出更長的cDNA成為可能。(Camincieta1.,2000)研究說明一些糖類如海藻糖能有效提高反轉錄酶和其它一些酶類的活性，并能提高酶的最適反響溫度，從而為打破mRNA的二級結構，提高反轉錄的效率提供了可能。5’端帽子結構真核生物的mRNA與原核生物不同，其5’端有一個特殊的甲基化帽子結構，5’端帽子結構就成為人們構建全長cDNA文庫，尋找突破口的主要目標。全長cDNA文庫的構建方法都是基于5'端帽子結構的特殊性研究出來的。其中代表性的方法有:Oligo-capping(Suzukieta1.,1997;Marugamaeta1.,1994),CAPture法(Ederyeta1.,1995),SMARTTM法(Y.Yeta1.,2001),CAP-Trapper法(Carnincieta1.,1996),Capselect(Schmidteta1.,1999)Oligo-capping此方法又叫做寡聚核糖核酸單鏈連接法(SSLLM)(Single-StrandLinkerLigationMethod/SSLLM).1994年，Maruyama等人首先取得了突破。他們利用5’帽子的結構特點，用細菌堿性磷酸酶(BAP)去除無5’端mG保護的、局部降解的、不完整mRNA末端的游離磷酸基團，再用煙草酸性磷酸酶(TAP)去除5’的mG結構僅保存一個5'P，合成一段寡核糖核酸，用T4RNA連接酶連接到經(jīng)過處理的mRNAS’端的5'P上，然后利用修飾的oligo(dT)作逆轉錄，并進行PCR反響，稱為oligocapping。CAPture法Ederly等(1995)報道了一種稱為CAPture的方法，據(jù)稱能夠非常有效地建立全長的。DNA文庫。他們利用“帽結合蛋白〞專門結合mRNA的帽結構，含有完整帽子結構的mRNA被富集，逆轉錄后用RNase作用于mRNA/DNA雜合子，未被帽結合蛋白結合的‘局部降解〞的不完整mRNA，有一些雖結合了“帽結合蛋白〞但DNA并不完整的mRNA都被降解，僅完整mRNA又有全長cDNA第一鏈結合保護的那些mRNA被保護，進一步純化富集后建庫，獲得的克隆全長比例很高，但每次需極其大量的mRNA(1OOug)，另外，被帽結合蛋白結合的mRNA5'端約10-50bp被喪失。所以嚴格來講所謂的全長cDNA文庫并不是全長的。

SMART法

SMART法(SwitchingMechanismat5‘EndofRNATranscriptSMART)CLONTECH公司推出的試劑盒CapFinder(現(xiàn)又命名為SMARTTM〕是利用帽子結構特征。SMART法充分利用了反轉錄酶PowerscriptTMRT末端轉移酶活性和限制性內切酶sfiⅠ的特性。PowerscriptTMRT是MMLU反轉錄酶經(jīng)過點突變而得來的，它喪失了RNaseH活性，但仍然保存著野生型的聚合酶活性，并且具有較好長距離反轉錄能力，另外它還具有在雙鏈核酸的3’端添加oligo(dC)的末端轉移酶活性。實驗設計時，在合成第一鏈cDNA的oligo(dT)引物的5'端加上了Sfil(A)的識別位點。當反轉錄到達mRNA的5'端時，借助PowerscriptTMRT的末端轉移酶活性，可以在全長的cDNA末端加上幾個(dC)，而截短的cDNA，由于反轉錄延伸沒有到達mRNA的5'端，PowerscriptTMRT不能以它為底物在截短的cDNA末端加上oligo(dC)，所以在合成第二鏈時，帶有sfiⅠ(B)的oligo(dG)引物不能與它結合，不能合成第二鏈，因此，理論上所得到的dsDNA都是全長cDNA。全長dscDNA在經(jīng)限制性內切酶Sfil切割，由于兩端的粘性末端不同，所以可以實現(xiàn)對目的基因的定向克隆。該方法的優(yōu)點在于不存在對mRNA進行處理的酶促反響，不僅操作簡單，而且一定程度上提供了全長cDNA合成的可能性。但是，該方法也存在以下缺乏:a.理論上，只有當反轉錄第一鏈cDNA到達模板mRNA的5'末端帽子結構時，末端轉移酶活性才能發(fā)生，但實際上，在反轉錄并未到達帽子結構就終止的第一鏈cDNA的末端，反轉錄酶末端轉移酶的活性照樣表達，因此，文庫中會有一定數(shù)量的非全長克隆，不利于以后的分析研究。b.末端轉移酶活性低，加dC量小，從而導致在CapSwitch這一步中，寡核昔酸作為模板的效率不高，導致克隆的喪失。CAP-Trapper法CAP-Trapper法該方法首先由Carninci(1996)等報道。CAP-Trapper法合成全長的原理是:依據(jù)mRNA的5’端和3’端存在的二醇結構來開展工作。首先將二醇結構進行氧化，在進行生物素修飾之后經(jīng)過沉淀、酒精洗滌、無RNase的滅菌水重新懸浮等篩選步驟，得到生物素化的mRNA經(jīng)逆轉錄酶催化進行cDNA第一鏈的合成，接著進行RNase1處理，未被cDNA保護的mRNA(包括非全長cDNA與RNA雜交體中暴露的mRNA5'端及所有的未被cDNA保護的mRNA)即被降解。經(jīng)鏈青霉素磁珠吸附并使用弱堿降解mRNA，如此得到單鏈cDNA，在末端轉移酶的作用下進行5’端Oligod(G)加尾，之后再進行第二鏈的合成，連接載體即可得到全長cDNA文庫。這種方法后來又進行了許多改進。Capselect法Capselect法防止了模板轉移的要求，開發(fā)了SuperscriptII反轉錄酶在錳離子存在下具有很高的末端轉移酶活性，然后利用此活性和rATP將一段controlled核昔酸尾巴連接到第一鏈cDNA末端，然后通過T4連接酶將adaptor連接上，起始第二鏈的合成，從而進行以后的步驟進行建庫。優(yōu)點:a由于開發(fā)了末端轉移酶的活性，使加dC的數(shù)目增加，同時又防止了模板轉移的要求，所以效率大大增加。b.需要的起始材料很少。c.處理mRNA的過程較少，這在一定程度上減少了mRNA降解的風險。d.簡單，易行。缺點:無法剔除cDNA混合樣中非全長cDNA。

〔三〕均一化cDNA文庫它是指某一特定組織或細胞的所有表達基因均包含其中，且在cDNA文庫中表達基因對應的cDNA的拷貝數(shù)相等或接近。優(yōu)點均一化cDNA文庫具有以下4方面的優(yōu)點：第一，在經(jīng)濟上具有廣泛的應用空間，可以節(jié)約大量試驗本錢。第二，增加克隆低豐度mRNA的時機，適用于分析各種發(fā)育階段或各種組織的基因表達及突變檢測。第三，與原始豐度的mRNA拷貝數(shù)相對應的cDNA探針與均一化的cDNA文庫作雜交，可以估計出大多數(shù)基因的表達水平及發(fā)現(xiàn)一些組織特異的基因。而以往的文庫構建，忽略了mRNA豐度的影響。第四，可以用于遺傳圖譜的制作和進行大規(guī)模的原位雜交，作為優(yōu)化的文庫系統(tǒng)還可以用于大規(guī)模的測序或芯片制作等研究?！菜摹巢顪pcDNA文庫(SubtractivecDNAlibrary)差減文庫也稱扣除文庫，使用兩種遺傳背景相同或大致相同但在個別功能或特性上不同的材料(如不同處理細胞系或植物的近等基因系等)提取mRNA(或反轉錄后合成cDNA)，在一定條件下用大大過量不含目的基因的一方作為驅動子(Driver)與含有目的基因的試驗方(Tester)進行雜交，選擇性的去除兩局部共同基因雜交形成的復合物，往往進行屢次的雜交—去除過程，最后將含有相關目的基因的未雜交局部收集后，并連接到載體形成文庫。方法提取實驗組和對照組mRNA合成雙鏈cDNA，經(jīng)識別4堿基的限制性內切酶切割實驗組cDNA平均分為2份，分別連接2個接頭進行2輪差減雜交和抑制性PCR獲得富集的目的基因2.抑制性差減雜交(SSH)抑制性差減雜交(SSH)流程圖檢測組(Tester)—含目的基因cDNA，加接頭驅逐組(Driver)—不含目的基因cDNA，不加接頭

*接頭含PCR引物正向SSH:易感者(Tester)+不易感者(Driver)

易感者特異表達或高表達基因反向SSH:不易感者(Tester)+易感者(Driver)

不易感者特異表達或高表達基因

2.抑制性差減雜交(SSH)

評價優(yōu)點采用兩次差減雜交和兩次PCR，保證了高特異性(假陽性率可降至6％);在雜交過程中可使不同豐度基因均衡化，從而獲得低豐度差異表達基因;操作相對簡便，是目前別離新基因的主要方法缺點起始材料需要g級量mRNA;SSH差減克隆片段較小，獲取cDNA全長序列有一定難度2.抑制性差減雜交(SSH)SSH應用HighWire/Abstract/Title:SuppressionSubtractiveHybridization，SSH〔截止2004年9月20日〕671篇1996.01.01—12.311篇1997.01.01—12.318篇1998.01.01—12.3123篇1999.01.01—12.3148篇2000.01.01—12.3165篇2001.01.01—12.31120篇2002.01.01—12.31126篇2003.01.01—12.31156篇2004.01.01—09.20117篇2005?篇合計?篇2.抑制性差減雜交(SSH)〔五〕全長差減均一化cDNA文庫全長均一化/差減cDNA文庫(mRNAnomalizationandsubtractionoffull-lengthcDNAlibrary)最早由Carninci(2000)等人提出的，整個文庫構建過程可分為三個步驟:第一步，全長cDNA的獲得。這一階段的方法與cap-trapper法相同。第二步，均一化/差減雜交。用上步得到的全長單鏈cDNA作為tester與用生物素標記的過量的drivermRNA雜交，用磁珠別離法將高表達的cDNA除去，最終得到稀有表達的單鏈cDNA(sscDNA)。第三步，第二鏈的合成和文庫構建(方法同cap-trpper法)。以第一鏈為模板，合成dscDNA，然后經(jīng)酶切，連接，包裝，轉染，得到全長差減的一化處理的cDNA文庫。Carninci(2000)等用這種方法構建了多個全長cDNA文庫，全長基因的比例到達了95%以上。CarninciP,ShibataY,HayastuN,etal.Normalizationandsubtractionofcap-trapper-selectedcDNAstopreparefull-lengthcDNAlibrariesforrapiddiscoveryofnewgenes[J].GenomeResearch,2000，10:1617-1630.〔六〕固相cDNA文庫構建固相cDNA合成法的主要優(yōu)點是可以簡便cDNA合成的操作。在進行緩沖液更換時既沒有cDNA的喪失之憂，也無其它物質污染之憂。另外，用此方法可以得到真實的代表性文庫，它包含有短小的cDNA，這是因為在克隆之前省去了分級別離的步驟?？傊?，固相法結合了傳統(tǒng)的cDNA合成的優(yōu)點并彌補了其缺乏。這種方法簡便易行，可靠低廉，所建文庫高質量，因此它可能會替代目前應用的cDNA文庫操作方法。SwitchingMechanismAt5‘endoftheRNATranscript原理：在合成cDNA的反響中事先參加的3'末端帶Oligo〔dG〕的SMART引物，由于逆轉錄酶以mRNA為模板合成cDNA，在到達mRNA的5'末端時碰到真核mRNA特有的“帽子結構〞，即甲基化的G時會連續(xù)在合成的cDNA末端加上幾個〔dC〕，SMART引物的Oligo〔dG〕與合成cDNA末端突出的幾個C配對后形成cDNA的延伸模板，逆轉錄酶會自動轉換模板，以SMART引物作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA單鏈直到引物的末端，這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo〔dT〕的起始引物序列，另一端有的SMART引物序列，合成第二鏈后可以利用通用引物進行擴增。由于有5'帽子結構的mRNA才能利用這個反響得到能擴增的cDNA，因此擴增得到的cDNA就是全長cDNA。這個專利的方法是利用逆轉錄酶內源的末端轉移酶活性，利用酶的天然屬性，經(jīng)巧妙設計而成為，研究只要單管，一步即可完成，不需要額外的cDNA抽提純化或者沉淀，或者額外的酶反響，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的TotalRNA就可以得到高質量、高產(chǎn)量的cDNA庫，更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度，可以應用于直接擴增基因、構建cDNA文庫、序列釣全長cDNA〔RACE〕，和用于芯片檢測的cDNA探針的擴增等。SMARTcDNASynthesisSMARTλTrip1Ex2Ligation〔一〕、SMARTcDNA文庫構建一般程序總RNA的提取LD-PCR合成cDNA蛋白酶K酶切Sfi1酶切CHROMASPIN-400Columns層析柱分級別離cDNASfi1酶切的cDNA片段與λTrip1Ex2載體連接cDNA文庫構建一般程序包裝反響未擴增文庫滴度的鑒定未擴增文庫重組率的測定cDNA文庫的擴增擴增cDNA文庫滴度、庫容量及重組率的鑒定基因文庫的保存和利用：SMARTcDNALibraryConstructionKit1、總RNA的提取與純化

1d2d3d4d5d6d7d

←28S←18S28S→18S→

2、cDNA

第一鏈的合成

取500μl的離心管，依次參加以下反響成分：總RNA1.0μlSMARTIVTMOligonucleotide1.0μlCSDIII/3′PCRPrimer1.0μlDeionizedH2o(Milli-Q-filtered)2.0μlTotalvolume5.0μl混合均勻，輕微低速離心，72℃恒溫水浴2min；迅速冰浴2min；混合均勻，輕微低速離心，依次參加以下反響成分：5ХFirst-StrandBuffer2.0μlDTT1.0μldNTPMix1.0μlPowerScriptTMReverseTranscriptase1.0μlTotalvolume5.0μl混合均勻，輕微低速離心，42℃恒溫水浴1hr〔如果使用水浴或熱循環(huán)溫浴，應參加一滴礦物油，防止水分蒸發(fā)，引起體積減少〕；迅速置于冰上終止第一鏈cDNA的合成反響。如果第一鏈cDNA混合物不立即進行PCR反響，那么應立即放在-20℃貯藏〔可以貯藏3個月〕。①、95℃預熱PCR儀；②、RelationshipbetweenamountofRNAstartmaterialandoptimalnumberofthermalcyclesTotalRNA(μgPolyA+RNA(μgNumberofCycles18-2020-2222-2424-263、LD-PCR合成

cDNA第二鏈③取500μl的離心管，依次參加以下反響成分：2μlFirst-StrandcDNA80μlDeionizedH2o10μl10хAdvantage2PCRBuffer2μl50хdNTPMix2μl5′PCRPrimer2μlCSDIII/3′PCRPrimer2μl50хAdvantage2PolymeraseMix100μlTotalVolume④、混合均勻反響成分，輕微低速離心，如果需要注意加礦物油。⑤、PCR擴贈反響程序：95℃預變性1min，95℃15sec，68℃6min,22個循環(huán)。⑥、反響結束后，取5μlPCR產(chǎn)物在1.1℅瓊脂糖凝膠上電泳，加0.1μg1-KbDNASizeMarkers,EB染色，檢測PCR產(chǎn)物。⑦、把dscDNA貯藏于-20℃的條件下。3000bp→2000bp→1500bp→1200bp→1030bp→900bp→800bp→700bp→600bp→500bp→LD-PCR合成dscDNA1.0%瓊脂糖凝膠電泳結果1.DNAMarkers;2.dscDNA4、蛋白酶K酶切①、取500μl離心管參加50μldscDNA〔2~3μg〕；②、參加2μl蛋白酶K〔20μg/μl〕剩余的dscDNA貯藏于-20℃的條件下，蛋白酶K抑制DNA聚合酶的活性；③、混勻離心，42℃溫育20min，簡單離心；④、參加50μlDeionizedH2o到離心管中；⑤、參加100μl酚：氯仿：異戊醇，輕微倒轉1~2min；⑥、4℃，14000rpm,離心5min；⑦、取上清液至500μl離心管，棄下層溶液；⑧、加10μlSodiumAcetate(3M;Ph4.8)，1.3μlGlycogen(20μg/μl)；⑨、參加260μl室溫95℅乙醇，立即室溫條件下14000rpm離心20min；〔注意在離心前不要把離心管放在-20℃或冰浴〕⑩、小心去掉上清液，用100μl80℅乙醇洗滌沉淀；加79μlDeionizedH2O重新溶解沉淀。5、Sfi1酶切①、取500μl的離心管，依次參加以下反響成分：79μlcDNA10μl10хSfi1Buffer10μlSfi1Enzyme(20units/μl)1μl100ХBSA100μlTotalVolume②、混勻，參加2μl二甲基苯腈藍染料，混勻；6、CHROMASPIN-400Columns層析柱分級別離cDNA①、取16支1.5ml離心管按順序作好標記；②、取出CHROMASPIN-400Columns，顛倒柱子幾次使凝膠基質重懸；③、用1000μl移液器輕輕地重懸凝膠基質，防止產(chǎn)生氣泡，然后去掉凝膠柱底部的蓋子，使凝膠緩沖液自然流盡〔3min后，如果柱中的緩沖液不能排盡，重新蓋尚頂部的蓋子，固定好柱子〕；④、調整好流速為1滴/40~60sec，1滴的體積大約為40μl，如果流速太慢因該重新重懸基質，并且重復上述的滴定程序，到達上述參數(shù)為止；⑤、當柱子中的貯藏緩沖液滴盡為止，輕輕地沿柱子頂部的內壁加700μl柱緩沖液直到緩沖液滴盡為止；⑥、當停止滴定15~20min后，把100μlcDNASfi1酶切液和二甲基苯腈藍混合液參加到層析柱中，進行分級別離〔樣品要充分被基質吸附〕，用100μl的層析柱緩沖液來洗含有cDNA片段的層析柱，使液滴流盡為止；⑦、然后取標記好的離心管，放在層析柱下，加600μl層析柱緩沖液，開始收集液滴，大約每管35μl，直到16支管收完為止；⑧、檢測分級別離效果，從每個管中取3μl收集液，在1.1℅瓊脂糖凝膠上電泳，檢測所收集的cDNA片段范圍，以確定所需的收集液；⑨、把所需dscDNA大于0.5Kb以上的8~12號管收集液倒在一起，然后加1/10體積的SodiumAcetate(3M;Ph4.8)，1.3μlGlycogen(20μg/μl)，2.5倍體積95℅乙醇〔-20℃〕，充分混勻，前后倒置搖動。⑩、然后放在-40℃沉淀過夜；室溫，14000rpm離心20min；去掉上清液，室溫枯燥沉淀10min；用7μlDeionizedH2o溶解沉淀，經(jīng)Sfi1酶切的cDNA片段便可以用來進行連接反響。7、Sfi1酶切的cDNA片段與λTrip1Ex2載體連接8、包裝反響①、取50μl包裝提取物〔EpicentrecomponyMaxplaxTMPackagingExtract〕室溫融化；②、取出25μl參加含5μl連接產(chǎn)物的1.5ml離心管中，剩余暫放于-70℃冰箱；③、輕輕混勻，防止產(chǎn)生氣泡，輕微離心，使溶液收集于管低；④、30℃水浴，90min；⑤、反響結束后，再參加25μl包裝提取物，在30℃水浴，90min⑥、包裝反響結束后，加600μlphagedilutionbuffer，輕輕混勻離心；⑦、加25μl氯仿，輕輕混勻離心，放4℃貯藏〔可以放2周〕；⑧、共獲得680μl未擴增文庫。9、未擴增文庫滴度的鑒定①、制備90mmLB/MgSO4/Tet固體平板6個，37℃預熱和枯燥1hr；②、取40μl未擴增文庫參加360μl1хLambdadilutionbuffer〔1：10稀釋〕；③、分別取上述稀釋后文庫1μl、10μl的包裝混合物同200μl過夜培養(yǎng)的XL1–Blue菌液混合，37℃水浴，使包裝后的噬菌體吸附細菌20min；④、反響結束后，加3ml融化的LB/MgSO4頂層培養(yǎng)基混勻后迅速倒入LB平板上鋪平，室溫冷卻10min讓底層LB平板鞏固；⑤、倒置平板，37℃過夜培養(yǎng)15hr，計算噬菌斑數(shù)目。⑥、稀釋后文庫1μl平均噬菌斑數(shù)目為29個，10μl平均噬菌斑數(shù)目310個；未擴增文庫的滴度〔pfu/ml〕=(2.9+3.1)х10х1000μl/ml2х1μl=3.0х105pfu/ml原始cDNA文庫滴度和重組率的鑒定插入cDNA片段大小分析

M1234567891011

M1213141516171819202122圖4-4重組質粒DNA的SfiI酶切電泳結果M：DNAMarkers;1-22:重組質粒2000bp→1500bp1000bp700bp400bp200bp123456789101112131415161718

圖2-4重組質粒的PCR檢測電泳結果泳道9：DNAMarkers;泳道1-8,泳道10-18:重組質粒

未擴增文庫重組率的測定

①、制備100mmLB/MgSO4/Tet固體平板2個，37℃預熱和枯燥1hr；②、取40μl未擴增文庫參加360μl1хLambdadilutionbuffer〔1：10稀釋〕；③、取上述稀釋后文庫100μl的包裝混合物參加200μl過夜培養(yǎng)的XL1–Blue菌液混合，37℃水浴，使包裝后的噬菌體吸附細菌20min；④、反響結束后分別參加50μlIPTG〔100mM〕、50μlX-Gal〔100mM〕混勻后加3ml融化的LB/MgSO4頂層培養(yǎng)基混勻后迅速倒入LB平板上鋪平，室溫冷卻10min讓底層LB平板鞏固；⑤、倒置平板，37℃過夜培養(yǎng)15hr，計算藍、白斑噬菌斑數(shù)目；⑥、兩個LB平板的藍、白斑分別為4個藍斑、720個白斑；31個藍斑、379個白斑；未擴增文庫的重組率=1099(白斑)1134(總噬菌斑)=96.9%cDNA文庫的擴增

①、制備15個150mmLB/MgSO4/Tet固體平板；②、挑一個別離良好的XL1–Blue單菌落接種到15mlLB/MgSO4/Maltose液體培養(yǎng)基上，140rpm，37℃培養(yǎng)過夜直至OD600=2.0，在4℃，5000rpm離心5min，用7.5mlMgSO4〔10mM〕重懸沉淀菌液；③、取未擴增文庫38μl的包裝混合物參加500μl過夜培養(yǎng)的XL1–Blue菌液混合，37℃水浴，使包裝后的噬菌體吸附細菌20min；④、反響結束后，加5ml融化的LB/MgSO4頂層培養(yǎng)基混勻后迅速倒入LB平板上鋪平，室溫冷卻10min讓底層LB平板鞏固；倒置平板，37℃過夜培養(yǎng)15hr，直至噬菌斑相互接觸；⑤、每一平板加12ml1хLambdadilutionbuffer，在4℃過夜培養(yǎng)；室溫下50rpm振蕩培養(yǎng)1hr；⑥、收集噬菌體裂解液于500ml燒杯中，參加10ml氯仿溶液，旋渦振蕩2min，7000rpm，離心5rpm；收集上清液，此時獲得一個擴增的cDNA文庫。擴增cDNA文庫滴度、庫容量及重組率的鑒定①、制備100mmLB/MgSO4/Tet固體平板1個，37℃預熱和枯燥1hr；②、取10μl擴增cDNA文庫參加990μl1хLambdadilutionbuffer〔1：100稀釋〕；③、取10μl上述稀釋后的擴增cDNA文庫參加200μl過夜培養(yǎng)的XL1–Blue菌液混合，37℃水浴，使包裝后的噬菌體吸附細菌20min；④、反響結束后分別參加50μlIPTG〔100mM〕、50μlX-Gal〔100mM〕混勻后加3ml融化的LB/MgSO4頂層培養(yǎng)基混勻后迅速倒入LB平板上鋪平，室溫冷卻10min讓底層LB平板鞏固；⑤、倒置平板，37℃過夜培養(yǎng)15hr，計算藍、白斑噬菌斑數(shù)目；⑥、擴增cDNA文庫的滴度〔pfu/ml〕=196х100х1000μl/ml10μl=1.96х106pfu/mlcDNA文庫擴增后的總體積為160ml，因此，擴增cDNA文庫的容量為3.136х108pfu；擴增文庫的重組率=1848(白斑)1900(總噬菌斑)=97.3%⑦、擴增cDNA文庫的長期保存：把擴增cDNA文庫分裝成每份1ml，參加DMSO終濃度為7%，放-70℃長期保存。重組質粒DNA瓊脂糖凝膠電泳結果

重組質粒DNA的SfiI酶切電泳結果

〔二〕cDNA文庫的質量評價代表性序列完整性其他cDNA文庫的質量評價文庫的代表性cDNA文庫的代表性是指文庫中包含的重組cDNA是否能完整地反映出來源細胞中表達的全部信息〔即mRNA種類〕，它是表達文庫質量的最重要指標。文庫的代表性好壞可用一個量化的指標來衡量，即文庫的庫容量，它是指構建的原始cDNA文庫中所包含的獨立的重組子克隆數(shù)。具備完好代表性的cDNA文庫所需的庫容量取決于來源細胞中表達的基因的總復雜度，具體來講就是來源細胞中的mRNA種類和每種mRNA序列的拷貝數(shù)滿足實驗最低要求的cDNA文庫的庫容量可用以下公式：N=ln(1-p)/ln(1-n/T)其中P為文庫中包含細胞中任何一種mRNA序列信息的概率，通常設為99%；N為文庫中以概率P出現(xiàn)細胞中任何一種mRNA序列理論上應具有的最少重組子克隆數(shù)；n為細胞中最稀少的mRNA序列的拷貝數(shù)；T為細胞中表達出的所有mRNA的總拷貝數(shù)。以人類細胞為例，人類基因組攜帶的遺傳基因總數(shù)約為3-4萬個，而某一特定類型的細胞中，表達出的基因種類僅占基因組全部基因的15%。因此，對于絕大局部的人類細胞，每個細胞內具體表達的mRNA種類約為15000種，全體mRNA序列的總拷貝數(shù)約為5000000個，而細胞中最稀有的mRNA種類的拷貝數(shù)平均為8個。因此，用人類細胞來構建cDNA文庫時，要以99%的概率保證文庫中包含有細胞表達出的任何一種mRNA的序列信息，構建出的原始cDNA文庫理論上應具有的最少獨立克隆數(shù)為2.9×105。但在實際工作中，由于在cDNA文庫構建過程中存在多種操作誤差和系統(tǒng)誤差，一個具有完好代表性的cDNA文庫至少應具有106以上的庫容量。2、重組cDNA片段的序列完整性構建的cDNA文庫中，重組cDNA片段的序列完整性也是反映文庫質量的一個重要因素。在細胞中表達出的各種mRNA盡管具體的序列不同，但根本上都是由三個局部組成，即5’端非翻譯區(qū)〔5’UTR〕、中間的編碼序列和3’端非翻譯區(qū)〔3’UTR〕。非翻譯區(qū)的序列特征對基因的表達具有重要的調控作用。編碼序列那么是合成基因產(chǎn)物—蛋白質的模板。對于大多數(shù)真核基因，其編碼的蛋白質產(chǎn)物在結構上都具有相對獨立的結構域，存在于同一分子上的結構域對表達出蛋白產(chǎn)物在細胞中所行使的生物學功能是必需的。這些結構域在基因的編碼區(qū)上也有對應的編碼序列。因此，要從文庫中別離獲得的目的基因完整的序列信息和功能信息，要求文庫中的重組cDNA片段應盡可能完整地反映出原始基因的結構?；诖耍壳安簧傺芯空咴跇嫿╟DNA文庫時，都十分注重全長cDNA克隆的重要性。但在實際研究中，cDNA文庫中重組的cDNA片段是否為全長，對文庫使用價值的影響并不是絕對的，如大多數(shù)真核mRNA的5’端非翻譯區(qū)都含有與編碼區(qū)處于同一閱讀框的終止密碼子，這些序列的存在會嚴重影響克隆的全長cDNA序列在宿主細胞中的表達，從而在目的基因的別離鑒定中，限制了一些極有價值的篩選方法的使用。此外，一些較長序列的基因，其全長cDNA片段可能會超出克隆載體的裝載容量，影響得組子在宿主細胞中的復制，這局部克隆在文庫擴增過程中很容易喪失，從而影響文庫的代表性。因此，在實際工作中，如何使用文庫中cDNA序列完整性這一指標，應按研究者自己的研究目的及具體采用的篩選方法來錄活考慮，并無固定的模式。在細胞中表達出的各種mRNA片段的序列完整性。在細胞中表達出的各種mRNA盡管具體序列不同，但根本上都是由3局部組成，即5'端非翻譯區(qū)，中間的編碼區(qū)和3'端非翻譯區(qū)。非翻譯區(qū)的序列特征對基因的表達具有重要的調控作用，編碼序列那么是合成基因產(chǎn)物—蛋白質模板。因此，要從文庫中別離獲得目的基因完整的序列和功能信息，要求文庫中的重組cDNA片段足夠長以便盡可能地反響出天然基因的結構。5'端：如果有同源全長基因的比較，可以通過與其它生物的對應基因5'末端進行比較來判斷。如果無同源基因的新基因，那么首先判斷編碼框架是否完整，即在開放閱讀框的第1個ATG上游有無同框架的終止密碼子；其次，判斷是否有轉錄起始點，一般加在5'帽結構后有一段富含嘧啶的區(qū)域，或者是cDNA5'序列與基因組序列中經(jīng)過酶切保護的局部相同，那么可以確定得到的cDNA的5'端是完整的。3'端：同樣可以用其它生物的對應基因3'末端進行比較來判斷，或編碼框架的下游有終止密碼子，或有1個以上的PolyA加尾信號，或無明顯加尾信號的那么也有PolyA尾。其它標準基因文庫的質量標準

除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應具備以下條件：

重組克隆的總數(shù)不宜過大

以減輕篩選工作的壓力

載體的裝