蛋白質(zhì)研究的基本實(shí)驗(yàn)方法

關(guān)于蛋白質(zhì)研究的基本實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)研究三個水平整體水平：動物模型細(xì)胞水平：形態(tài)、功能分子水平：基因、蛋白質(zhì)第2頁,共60頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的調(diào)控基因序列的變化：ErbB2染色質(zhì)水平上基因活化的調(diào)節(jié)：

染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)（對核酸酶的敏感程度增加）組蛋白的甲基化（H3-K9基因沉默，H3-K4基因活化）組蛋白的乙酰化DNA的甲基化（5%C甲基化m5C；5’端CpG）第3頁,共60頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

順式作用元件，反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子）轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控翻譯水平的調(diào)控翻譯后調(diào)控

磷酸化、糖基化、泛素化定位第4頁,共60頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)調(diào)控的研究Qualitativemodel(cyclins)Quantitativemodel(CDK)第5頁,共60頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)研究的基本方法免疫印跡（WesternBlot）免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）第6頁,共60頁，2024年2月25日，星期天WesternBlot免疫印跡（蛋白質(zhì)印跡）

是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。是在凝膠電泳（高分辨率）和固相免疫測定技術(shù)（高特異性，高靈敏性）基礎(chǔ)上發(fā)展而來。第7頁,共60頁，2024年2月25日，星期天WesternBlot第8頁,共60頁，2024年2月25日，星期天WesternBlotA.SamplepreparationB.ElectrophoresisC.Transferofproteinsandstaining(Westernblotting)第9頁,共60頁，2024年2月25日，星期天蛋白裂解液的制備組織樣品：取適量（約100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。細(xì)胞樣品：每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS，加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。第10頁,共60頁，2024年2月25日，星期天蛋白裂解液的制備第11頁,共60頁，2024年2月25日，星期天蛋白裂解液的制備RIPABuffer：

裂解液和細(xì)胞應(yīng)充分接觸，RIPAbuffer足量。RIPA裂解液中蛋白樣品含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法但可用BCA法測定蛋白濃度。第12頁,共60頁，2024年2月25日，星期天蛋白裂解液的制備當(dāng)細(xì)胞破碎的時(shí)候，蛋白水解酶就會被釋放出來或被激活。為了避免這些情況的出現(xiàn)，在樣品制備時(shí)盡可能在低溫下進(jìn)行。但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持著活性，此時(shí)應(yīng)當(dāng)使用蛋白酶抑制劑。WesternBlot臨用前可新鮮加入最終濃度為1mM的PMSF（苯甲基磺酰氟）。Co-IP蛋白酶抑制劑：胃蛋白酶抑制劑(pepstantin)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、胰蛋白酶抑制劑(aprotinin)等；能夠強(qiáng)烈抑制所有蛋白酶的活性（如絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶、酸性蛋白酶）。第13頁,共60頁，2024年2月25日，星期天蛋白裂解液的制備組織細(xì)胞裂解過程中釋放大量內(nèi)源性蛋白磷酸酶，以各種方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化。WesternBlot和免疫共沉淀檢測磷酸化蛋白質(zhì)、蛋白激酶活性測定，抑制磷酸化蛋白質(zhì)去磷酸化，維護(hù)蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。Na3VO4、NaF蛋白磷酸酶抑制劑：特異性抑制某一種或幾種蛋白磷酸酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以強(qiáng)烈?guī)缀跛兄匾牡鞍琢姿崦富钚?，包括蛋白絲/蘇氨酸磷酸酶(PP1、PP2A、PP2B、PP2C)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶等。第14頁,共60頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共60頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定量直接紫外吸收法

含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸280nm附近的紫外吸收峰測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)干擾適合于與色譜柱聯(lián)用，達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)控，較不準(zhǔn)確比色測定法第16頁,共60頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定量比色測定法

在典型的蛋白測定中，化學(xué)試劑加入到蛋白樣品溶液里產(chǎn)生顏色變化，這一變化可由分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀檢測，并與已知濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較。Bradford法蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合最大吸收峰從465nm變?yōu)?95nm在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋白量成正比不能含有太高濃度的去污劑，對樣品的要求較高。第17頁,共60頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定量Lorry法蛋白質(zhì)與堿性銅溶液中的Cu2+絡(luò)和使肽鍵伸展，暴露出酪氨酸和色氨酸，在堿性銅條件下與福林試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色，在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各種蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測定時(shí)需使用同種蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)。Lorry法進(jìn)行了改良第18頁,共60頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定量Bicinchoninicacid(BCA)法近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+。BCA與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562nM處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比。靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小。BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。第19頁,共60頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線分別取一定體積的濃度為2mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液，加PBS溶液至20ul配成如下濃度梯度的BSA溶液:0mg/ml、0.015625mg/ml、0.03125mg/ml、0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml。樣品(樣品BSA溶液或蛋白質(zhì)溶液)與PBS共25ul（0.1ml）加樣，最后每孔均加200ul（2ml）工作液（BCA：Cu50：1嫩綠色）混勻，37"C孵育30min,冷卻到室溫后，酶標(biāo)儀上562nm處讀數(shù)。第20頁,共60頁，2024年2月25日，星期天WesternBlot蛋白免疫印跡（Immunoblotting）

凝膠電泳（SDS-聚丙烯酰胺凝膠）樣品的印跡（蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移固相支持物：硝酸纖維素膜（NC膜）和PVDF膜）免疫學(xué)檢測（用特異性的抗體檢測所要研究的相應(yīng)抗原）第21頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SDS第22頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

SDS原理蛋白質(zhì)中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的pH值下表現(xiàn)出不同的電荷。為了使蛋白在電泳中的遷移率只與分子量有關(guān)，我們在上樣前，通常會進(jìn)行一些處理(上樣緩沖液)。即在樣品中加入含有SDS和β-巰基乙醇的上樣緩沖液。第23頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SDSSDS即十二烷基磺酸鈉（CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na）：一種陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)。β-巰基乙醇：強(qiáng)還原劑，它可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。第24頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SDS溴酚藍(lán)染料：用于監(jiān)控整個電泳過程。蔗糖或甘油：增大溶液密度，使加樣時(shí)樣品溶液可以快速沉入樣品凹槽底部。高溫處理，其目的是將SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)同時(shí)使整個蛋白帶上負(fù)電荷。第25頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SDS1xSamplebuffer:60mMTris-ClpH6.82%SDS（心臟，肌肉5%）10%glycerol0.01%Bromophenolblue1.5%2-mercaptoethanol第26頁,共60頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SDSSample第28頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SDSpH不連續(xù)和膠孔徑大小不連續(xù)電泳啟動時(shí)，蛋白樣品處于pH6.8的上層（孔徑大），pH8.8的分離膠層在下層（孔徑?。?，上槽為負(fù)極，下槽為正極。第29頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SDSPAGE膠的聚合原理：甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺在過硫酸胺的作用下聚合，形成膠。第30頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SDS在濃縮膠運(yùn)動中，Clˉ解離度大，Proˉ解離度居中，甘aaCOOˉ解離度小，遷移順序?yàn)椋≒H6.8）Clˉ>Proˉ>—COOˉ，一個Clˉ領(lǐng)路，—COOˉ推動，蛋白在中間，這樣就起到濃縮的作用了。由于膠聯(lián)度小，孔徑大，Proˉ受阻小，因此不同的蛋白質(zhì)就濃縮到分離膠之上成層，起濃縮效應(yīng)，使全部蛋白質(zhì)處于同一起跑線上。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入分離膠時(shí)，此時(shí)Proˉ，Clˉ，甘aa離子在PH8.8的溶液中，Clˉ完全電離而很快到達(dá)正極，甘aa電離度加大很快躍過蛋白質(zhì)，而到達(dá)正極，只有蛋白質(zhì)分子在分離膠中較為緩慢的移動。第31頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SDS由于Proˉ在電泳過程中，帶負(fù)電荷多者遷移快，反之則慢，這就現(xiàn)了電荷效應(yīng)。由于膠孔徑小，而且成為一個整體的篩狀結(jié)構(gòu)，它們對大分子阻力大，小分子阻力小，起著分子篩效應(yīng)，也就是蛋白質(zhì)在分離膠中，以分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)而出現(xiàn)遷移率的差異，最終達(dá)到彼此分開。第32頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SDS第33頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SDS催化劑：過硫酸銨（AP）在隔氧的狀態(tài)下，最好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用新鮮的。加速催化劑：TEMED，四甲基乙二胺。催化劑的作用是使單體聚合成網(wǎng)狀聚合物。第34頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SDS第35頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SDS上樣量：總蛋白量20-50ug（上樣量過多使電泳條帶變形）70V，30min；110V，與待分離樣品靶蛋白分子量相適應(yīng)。第36頁,共60頁，2024年2月25日，星期天SDSElectrophoresis第37頁,共60頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)膜（電轉(zhuǎn)移）印跡中常用的固相材料有NC膜、尼龍膜、PVDF等。PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。有兩種規(guī)格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2umforMW<20kDa)。第38頁,共60頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)膜NC膜及濾紙的預(yù)處理：

剪裁與膠大小一致的NC膜，將其浸入1×轉(zhuǎn)移緩沖液平衡5分鐘以上。（注意：必須保證NC膜始終完全浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中）PVDF膜的預(yù)處理：

剪裁與膠大小一致的膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。將其浸入1×轉(zhuǎn)移緩沖液平衡5分鐘以上。第39頁,共60頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)膜緩沖液通過凝膠時(shí)會將蛋白質(zhì)帶到硝酸纖維素（或PVDF）膜上，膜可以與蛋白質(zhì)通過疏水相互作用產(chǎn)生不可逆的結(jié)合。有孔的塑料和有機(jī)玻璃板將凝膠和硝酸纖維素膜夾成"三明治"形狀，而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進(jìn)行電泳，選擇適當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)離開凝膠結(jié)合在硝酸纖維素（或PVDF）膜上。第40頁,共60頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)膜第41頁,共60頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)膜電流1mA-2mA/cm2，我們通常200mA-350mA，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時(shí)間第42頁,共60頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共60頁，2024年2月25日，星期天WesternBlot第44頁,共60頁，2024年2月25日，星期天WesternBlot封閉（2h）：用蛋白溶液（如5％的脫脂奶粉或BSA）處理以封閉硝酸纖維素（或PVDF）膜上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)。（先用0.2-0.5%麗春紅預(yù)染）一抗（過夜或2h）：只有待研究的蛋白質(zhì)與一抗結(jié)合，而其它蛋白質(zhì)不與一抗結(jié)合，這樣清洗去除未結(jié)合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)的位置上結(jié)合著一抗。（反貼法）第45頁,共60頁，2024年2月25日，星期天WesternBlot第46頁,共60頁，2024年2月25日，星期天WesternBlot二抗（1h）：帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。最常用的一種是酶連的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當(dāng)?shù)牡孜锶芤禾幚?，?dāng)酶純化底物生成有顏色的產(chǎn)物時(shí)，就會產(chǎn)生可見的區(qū)帶，指示所要研究的蛋白質(zhì)的位置。eg：辣根過氧化物酶；堿性磷酸酶第47頁,共60頁，2024年2月25日，星期天第48頁,共60頁，2024年2月25日，星期天WesternBlot檢測辣根過氧化物酶的方法增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL；2min）辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾（luminol，氨基苯二酰一肼）并發(fā)光，在化學(xué)增強(qiáng)劑存在下光強(qiáng)度可以增大1000倍，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。第49頁,共60頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共60頁，2024年2月25日，星期天WesternBlot必需要內(nèi)參！第51頁,共60頁，2024年2月25日，星期天WesternBlot一、二抗的選擇及比例凝膠質(zhì)量（氣泡，脆）電轉(zhuǎn)方向，氣泡，電流電壓，溫度NCTween20<0.3%洗膜第52頁,共60頁，2024年2月25日，星期天免疫共沉淀（co-IP）免疫沉淀(IP)

利用抗原抗體特異性結(jié)合的特性，將抗原（靶蛋白）從混合體系沉淀下來，初步分離靶蛋白的一種方法。免疫共沉淀(co-IP)

在體外探測2個蛋白質(zhì)分子之間是否存在特異性相互作用的一種方法。第53頁,共60頁，2024年2月25日，星期天免疫共沉淀原理

如果2個蛋白質(zhì)分子能夠發(fā)生特