蛋白質(zhì)定位方法

關(guān)于蛋白質(zhì)定位方法導(dǎo)言

真核細(xì)胞具有復(fù)雜的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，已發(fā)現(xiàn)數(shù)十種細(xì)胞器，每種細(xì)胞器都有一組特定的蛋白。真核細(xì)胞除葉綠體，線粒體能少量合成蛋白外，絕大部分蛋白是在胞漿或粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，最終運(yùn)送到不同地點(diǎn)，形成成熟蛋白并行使功能。轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物中很大一部分是以前體蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信號(hào)，可引導(dǎo)蛋白在胞內(nèi)定位。蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位問題，是細(xì)胞生物學(xué)研究的中心問題，也是分子生物學(xué)研究的熱門話題。目前，這方面的工作己取得很人進(jìn)展。細(xì)胞器不同，相應(yīng)的靶向蛋白的定位過程也不同。第2頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天GFP及其在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用

簡(jiǎn)介GFP

海洋生物發(fā)光是個(gè)非常普遍的現(xiàn)象。從原生生物到脊椎動(dòng)物均有生物發(fā)光，如海螢，磷蝦，腔腸動(dòng)物等。從不同動(dòng)物體內(nèi)提取的熒光蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)不盡相同，不同動(dòng)物熒光發(fā)生機(jī)制有很大差別。多管水母體內(nèi)存在兩種發(fā)光蛋白綠色熒光蛋白:GFP和aequorin。當(dāng)aequorin與3個(gè)Ca2+結(jié)合后，即發(fā)生氧化反應(yīng)并發(fā)射藍(lán)光，最大發(fā)射波長(zhǎng)469nm。GFP被紫外光或藍(lán)光激發(fā)后發(fā)出綠色熒光(Morise,H.，Shimomura,1974)。第3頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天GFP在水母體內(nèi)的發(fā)光機(jī)制如下：第4頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天

GFP熒光的產(chǎn)生主要?dú)w功于分子內(nèi)第65,66,67位絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色團(tuán)的功效。翻譯出的蛋白折疊環(huán)化后，在O2存在下分子內(nèi)第67位甘氨酸的?；鶎?duì)第65位絲氨酸的羧基的親核攻擊形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的a-β鍵脫氫反應(yīng)之后，導(dǎo)致芳香團(tuán)與咪唑基結(jié)合。這樣GFP分子中形成對(duì)羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團(tuán)，該過程可自動(dòng)催化合成(HeimR,DouglasCP.,1994)

第5頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天GFP晶體結(jié)構(gòu)(如圖)顯示：

蛋白中央是一個(gè)圓柱形水桶樣結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)420nm,寬240nm，由11個(gè)圍繞中心a螺旋的反平行β折疊組成，熒光基團(tuán)的形成是從這個(gè)螺旋開始，桶的頂部由3個(gè)短的垂直片段覆蓋，底部由1個(gè)短的垂直片段覆蓋，生色團(tuán)位于大空腔內(nèi)(CubittAB,1999)。第6頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天

GFP在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用

GFP雖能自發(fā)熒光，但野生型GFP熒光較弱。為了改善GFP熒光特性，對(duì)GFP進(jìn)行了突變和重組實(shí)驗(yàn)。Pang等獲得的GFP突變型比野生型亮度增強(qiáng)20倍;Tian等發(fā)現(xiàn)野生型GFP是低水平表達(dá)，而改良后的GFP表達(dá)量增加100倍。Cormack等獲得的三位點(diǎn)替代突變體的熒光強(qiáng)度比野生型高100倍，而且在自然光下就能觀察到綠色熒光，使得gfp作為報(bào)告基因更為靈敏和迅速。Confocal能有效消除同一焦平面上非檢測(cè)點(diǎn)的雜散熒光和非焦平面熒光的干擾，使分辨率提高，獲得清晰圖象，而且它具有逐層掃描功能，可對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行無損傷的系列光學(xué)切片。Confocal的應(yīng)用更有利于GFP在生物學(xué)研究中的應(yīng)用。第7頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天原理

應(yīng)用DNA亞克隆技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，通過愈傷組織轉(zhuǎn)化法、基因槍、顯微注射、電激轉(zhuǎn)化等方法轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，利用目的基因的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，如啟動(dòng)子和信號(hào)序列來控制融合基因的表達(dá)，在熒光顯微觀察系統(tǒng)下監(jiān)測(cè)融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的存在狀態(tài)。目的基因融合基因gfp轉(zhuǎn)化表達(dá)熒光顯微觀察第8頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)研究

將GFP作為熒光探針，與要研究的蛋白質(zhì)融合在一起，進(jìn)行活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分布與變化研究。此方法在過去幾年中對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的觀察有著顯著影響。水稻的CaM類蛋白OsCaM61，含有N一端CaM區(qū)域，C端有異戊二烯化位點(diǎn)。將OsCaM61與GFP融合起來，研究其亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)GFP-OsCaM61融合蛋白是膜結(jié)合的，而OsCaM61-GFP卻主要在核質(zhì)。用mevinolin處理細(xì)胞，阻止類異戊二烯合成，引起GFP-OsCaM61運(yùn)輸?shù)胶速|(zhì)。前者C端的異戊二烯化位點(diǎn)是活躍的而后者的位點(diǎn)被掩蓋。此蛋白的異戊二烯化狀態(tài)對(duì)于細(xì)胞定位起決定性作用。亞細(xì)胞定位依賴于蛋白的異戊二烯化狀態(tài)，表明在不同的生理?xiàng)l件下，這種類CaM可能通過結(jié)合到定位于不同細(xì)胞成分的靶子上，起到不同的功能作用(AiwaDongeta1.,2002)第9頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天

A、B:僅轉(zhuǎn)入GFPC、D:轉(zhuǎn)入PF40-GFP融合蛋白第10頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天

用GFP還可以用于基因沉默、啟動(dòng)子活性、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞局部區(qū)域的pH、內(nèi)生菌和植物相互作用研究等。GFP在動(dòng)物學(xué)研究方面的應(yīng)用也非常廣泛(比如用于研究腫瘤發(fā)生機(jī)制、轉(zhuǎn)移機(jī)制、基因治療等)。

gfp用作報(bào)告基因有眾多優(yōu)點(diǎn)：1靈敏度高，易檢測(cè)并且是活體檢測(cè)，對(duì)細(xì)胞組織不具破壞性。而當(dāng)選用gus作報(bào)告基因時(shí)，在組織學(xué)檢測(cè)時(shí)，一定程度上具有破壞性。因?yàn)橐獙?duì)材料進(jìn)行固定，保溫和脫色，并且植物中存在GUS本底，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性；2在活體內(nèi)表達(dá)不受生物類型、基因型、細(xì)胞和組織類型的限制；3不需任何底物和外源輔因子參與；4便于早期篩選轉(zhuǎn)基因材料。

GFP在生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，有很大優(yōu)越性，但也存在一定的問題。GFP的檢測(cè)受背景熒光和光漂白現(xiàn)象的限制，它的過量