腫瘤分子檢測(cè)與質(zhì)量控制課件

深圳市人民醫(yī)院病理科分子實(shí)驗(yàn)室姜陽(yáng)陽(yáng)2021-10-27腫瘤分子檢測(cè)方法與質(zhì)量控制醫(yī)學(xué)開(kāi)展歷程的啟示經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)循證醫(yī)學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷靠治療后期經(jīng)驗(yàn)積累。診斷治療以人群、科學(xué)研究證據(jù)指導(dǎo)臨床實(shí)踐。診斷治療以個(gè)體為根底，更加提前、具體與精確。分子時(shí)代腺癌鱗癌21%25%36%7.8%3.3%2.6%2.2%0.8%0.7%0.7%0.1%肺腺癌：EGFR\KRAS\BRAF\ALK-ROS1\RET等檢測(cè)已是共識(shí)；肺鱗癌發(fā)生模式不同，檢測(cè)靶標(biāo)以擴(kuò)增為主，同時(shí)EGFR、ALK\ROS1某些病例也有必要檢測(cè)。我們可以用的分子生物學(xué)手段：實(shí)時(shí)熒光PCR方法〔擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)法〔AmplificationRefractoryMutationSystem，ARMS〕、PCR-高分辨溶點(diǎn)曲線(xiàn)分析〔HRM〕、數(shù)字PCR等〕PCR-雜交法〔膜上、芯片[基因芯片]、乳膠顆粒[Luminex]〕PCR-Sanger測(cè)序PCR-焦磷酸測(cè)序新一代高通量測(cè)序PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等熒光原位雜交〔FISH〕直接雜交免疫組化分子病理檢測(cè)的主要方法基因突變(SNPs)拷貝數(shù)改變(CopyNumberVariation,CNV)基因重排（Gene

rearrangement)蛋白(質(zhì))表達(dá)(Proteinexpression)免疫組織化學(xué)（IHC）…基因表達(dá)(mRNA/RNA

expression）反轉(zhuǎn)錄+熒光定量PCR（RT-qPCR)…FISH…DNAsequencing，

ARMS…檢測(cè)對(duì)象檢測(cè)基因檢測(cè)水平EGFR，KRAS，BRAF，BRCA,BCR-ABL，JAK2…EML4-ALK，ROS1，HER2，RET…BRCA1，TOP2A，TYMS…EGFR，EML4-ALK，HER2…國(guó)際肺癌協(xié)會(huì)專(zhuān)家共識(shí)

中國(guó)基因突變檢測(cè)專(zhuān)家共識(shí)

日本臨床專(zhuān)家共識(shí)IPASSINFORM大型臨床研究所采用DNA基因重排融合mRNA或5’/3’mRNA差異表達(dá)嵌合蛋白表達(dá)肺癌中ALK基因變異的表達(dá)調(diào)控FISH/CISHNGSRT-PCR5’/3’比較qRT-PCRRACE-PCR…IHC2個(gè)信號(hào)別離直徑的要求，使實(shí)際應(yīng)用中結(jié)果難以判斷有5-11%出現(xiàn)假陽(yáng)性信號(hào)別離1，2，3工作強(qiáng)度大，費(fèi)時(shí)主觀性強(qiáng)，受人為因素影響大橫向縱向操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短結(jié)果客觀，易于判讀，減少人為因素的影響除FFPE樣本外，還適用其他類(lèi)型樣本組織1與EGFR、RET、ROS1等其他檢測(cè)不沖突，共用相同組織切片和PCR擴(kuò)增程序，節(jié)約有限資源和時(shí)間中國(guó)熒光PCR儀器普及率更高，更加適合國(guó)情NTCPCFusionSample實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄法〔RealTime-PCR〕CFDA批準(zhǔn)的基因檢測(cè)產(chǎn)品項(xiàng)目EGFRALKROS1ALK/ROS1IHC

√

FISH

√

RealTime-PCR√√√√基于RealTime-PCR方法檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因的分子診斷產(chǎn)品獲得CFDA批準(zhǔn)最多2-3片F(xiàn)FPE樣品同時(shí)將DNA和RNA別離出來(lái)同時(shí)獲得EGFR、ALK和ROS1檢測(cè)結(jié)果節(jié)約樣本、節(jié)約時(shí)間、節(jié)約本錢(qián)DNA/RNAEGFR突變型ALK陽(yáng)性或ROS1陽(yáng)性EGFR野生型ALK陰性ROS1陰性吉非替尼厄洛替尼?？颂婺岚⒎ㄌ婺峥诉蛱婺嵘鹛婺崞渌委煼绞紻NA/RNA共別離劑盒EGFR/ALK+ROS12.5小時(shí)PCR4.5小時(shí)FFPE切片1-3片或活檢小標(biāo)本2021NSCLCNCCN指南對(duì)于NSCLC患者建議檢測(cè)EGFR和ALK基因狀態(tài)；對(duì)于ROS1/MET/RET/BRAF/HER2等嶄露頭角的靶基因也給予關(guān)注1.室內(nèi)質(zhì)量控制2.室間質(zhì)量評(píng)價(jià)分子病理實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制1.建立標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室2.具備資質(zhì)且相對(duì)固定的人員3.性能穩(wěn)定的試劑4.持續(xù)不斷的學(xué)習(xí)和開(kāi)展質(zhì)控?醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室管理方法?〔衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2021]194號(hào)〕?醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)展檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)那么?〔衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2021]194號(hào)〕試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向標(biāo)本制備區(qū)空氣流向擴(kuò)增區(qū)空氣流向產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間工作走向FISH實(shí)驗(yàn)區(qū)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作文件〔sop〕1.寫(xiě)你所做2.做你所寫(xiě)3.實(shí)驗(yàn)室的精髓可操作性的sop文件人員資質(zhì)理想的試劑試劑方法的性能驗(yàn)證及每批試劑的質(zhì)檢性能指標(biāo)：重復(fù)性〔精密度〕準(zhǔn)確性〔定量：回收率、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等；定性：方法學(xué)比較等〕線(xiàn)性范圍〔定量〕分析特異性測(cè)定下限抗干擾能力

資質(zhì)認(rèn)證試劑質(zhì)量試劑反響性能前后批號(hào)結(jié)果一致性測(cè)定下限批內(nèi)變異〔<10%)和批間變異〔<15-25%)你其實(shí)做了這些，但是你有記錄么？1.日常維護(hù)2.定期保養(yǎng)3.維修記錄實(shí)驗(yàn)室最忠實(shí)的員工-----儀器全流程：標(biāo)本接收-石蠟切片-核酸提純-實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增-結(jié)果分析分析前：標(biāo)本接收、制片、填寫(xiě)檢測(cè)申請(qǐng)單分析中：核酸提取、擴(kuò)增、產(chǎn)物分析、檢測(cè)有效性判斷分析后：結(jié)果分析、報(bào)告審核、結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)：重復(fù)，可控，標(biāo)準(zhǔn)全流程室內(nèi)質(zhì)控組織蠟塊切片病理學(xué)評(píng)估核酸純化實(shí)驗(yàn)/數(shù)據(jù)DNA模板質(zhì)量更重要，建議對(duì)提取的DNA模板進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)：

OD260/OD280=1.8±0.2，

OD260/OD230≥1.7全流程室內(nèi)質(zhì)控檢查設(shè)定參數(shù)平臺(tái)期背景熒光閾值線(xiàn)設(shè)定閾值檢查對(duì)照組及內(nèi)外控曲線(xiàn)情況陽(yáng)性質(zhì)控品突變樣本突變分析RNA制備逆轉(zhuǎn)錄選用CFDA認(rèn)證的檢測(cè)試劑認(rèn)證的核酸抽提試劑病理小樣本中性福爾馬林組織保護(hù)液快速低溫放置微量紫外分光光度計(jì)Q-PCREGFREML4-ALKK-rasB-rafPI3K好流程才有好結(jié)果F