重組DNA技術的基本工具學歷案下學期高二生物人教版選擇性必修三

重組DNA技術的基本工具預習案基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。思考·討論

基因工程的遺傳學原理是基因重組?；蚬こ虥]有（選填“有”、“沒有”）創(chuàng)造新基因，有（選填“有”、“沒有”）創(chuàng)造了新的基因型，沒有（選填“有”、“沒有”）創(chuàng)造新物種。思考·討論

1972年，美國斯坦福大學的伯格(PaulBerg,1926)等人把一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA分子連接起來，產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子。這是世界上第一個重組DNA分子。1973年，科恩(StanleyCohen,1935)和博耶(HerbertBoyer,1936)等人把兩個不同質(zhì)粒的DNA拼接起來，構成一個重組質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，使轉(zhuǎn)入的基因表達，第一次完整地建立起了基因克隆體系，被稱為基因工程誕生的里程碑。對DNA如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。那么，科學家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？

“工欲善其事，必先利其器”。在培育轉(zhuǎn)基因大腸桿菌時，首先要在體外對含有所需要基因的DNA分子進行“切割”、改造和“拼接”；然后，將重組DNA分子導入受體細胞內(nèi)，并使其在細胞中表達。實現(xiàn)這一精確的操作過程至少需要三種“分子工具”，即準確切割DNA分子的“分子手術刀”——限制性內(nèi)切核酸酶、將DNA片段再連接起來的“分子縫合針”——DNA連接酶，以及將體外重組好的DNA分子導入受體細胞的“分子運輸車”——載體?？茖W家正是靠這三種必需的工具(如圖),才使培育轉(zhuǎn)基因大腸桿菌這一奇妙構想變成了現(xiàn)實。圖

重組DNA技術所需的三種基本工具示意圖一、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術刀”切割DNA分子的工具是限制性內(nèi)切核酸酶(restrictionendonuclease)，又稱限制酶(restrictionenzyme)。1.來源這類酶主要是從原核生物中分離純化出來的。迄今分離的限制酶有數(shù)千種，許多已經(jīng)被商業(yè)化生產(chǎn)。2.

功能它們能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。（內(nèi)切的含義：從中間切開，不是從邊緣一個個切斷。）圖

雙鏈DNA的結構和磷酸二酯鍵的位置示意圖（關注：單鏈方向以及磷酸二酯鍵的位置）

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磷酸二酯鍵是一種化學基團，指一分子磷酸與兩個醇（羥基）酯化形成的兩個酯鍵。磷酸二酯鍵成了兩個醇之間的橋梁。例如前一個核苷酸的羰基中的3'碳上的—OH（羥基）和后一個核苷酸的5'—磷酸基形成酯鍵，此處的磷酸基同時與前后兩個羥基形成酯鍵，故稱磷酸二酯鍵。依次連下去，形成多核苷酸鏈。3.

剪切結果大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成。例如，EcoRI、SmaI限制酶的識別序列均為6個核苷酸，也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式——黏性末端和平末端

(如圖)。當限制酶在它識別序列的中心軸線(圖中虛線)兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生的是黏性末端（指單鏈末端）；當限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時，產(chǎn)生的是平末端。圖

限制酶切割DNA分子產(chǎn)生兩種不同末端的示意圖(箭頭表示酶的切割位置)思考·討論

你能根據(jù)所掌握的知識，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？限制酶會不會剪切細菌本身的DNA?查閱資料尋找原因。原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制。限制酶就是它的一種防御性工具。當外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。不會，細菌DNA缺乏特定的核苷酸序列,或修飾（如甲基化）可以被識別的堿基序列,故限制酶無法識別這些DNA,不能剪切。二、DNA連接酶——“分子縫合針”將切下來的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA連接酶來完成的。1967年，世界上幾個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了一種能夠?qū)蓚€DNA片段連接起來的酶，稱之為DNA連接酶(DNAligase)。1.

功能：連接具有相同黏性末端或平末端的DNA分子，恢復核苷酸之間的磷酸二酯鍵。（當能發(fā)生堿基互補的末端聚集在一起，溫度下降后，即可自行形成氫鍵）圖

限制酶和DNA連接酶的作用示意圖思考·討論

DNA連接酶需要在一條DNA鏈的3'末端具有一個游離的羥基(OH),在另一條DNA鏈的5'末端具有一個磷酸基團(P),只有在這種情況下，才能發(fā)揮其連接DNA分子的作用，形成新的磷酸二酯鍵。微閱讀

值得注意的是，DNA連接酶并不能連接兩條單鏈的DNA分子，被連接的DNA分子必須是雙螺旋的一部分。實際上，DNA連接酶封閉的是雙螺旋DNA分子的缺口(nick),即在雙鏈DNA的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂。2.分類：根據(jù)酶的來源不同，可分為兩類。種類來源作用E.

coli

DNA連接酶大腸桿菌只能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端。T4

DNA連接酶T4噬菌體既可以連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端的效率較低。思考·討論

DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？不是一回事。雖然DNA連接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯鍵形成的酶，但兩者存在顯著的區(qū)別。(1)DNA聚合酶只能催化單個核苷酸加到已有的核酸片段3'末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是催化單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。(2)DNA聚合酶以一條DNA鏈為模板，催化形成與模板鏈互補的DNA鏈；而DNA連接酶催化具有互補黏性末端或平末端的DNA片段連接起來，它不需要（選填“需要”、“不需要”）模板。此外，兩者雖然都是蛋白質(zhì)，但它們的組成和性質(zhì)各不相同。歸納：與DNA相關的五種酶的比較:名稱作用部位作用結果限制酶磷酸二酯鍵將DNA切成兩個片段DNA連接酶磷酸二酯鍵將兩個DNA片段（雙鏈）連接為一個DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈,形成兩條長鏈三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”怎樣才能將外源基因送入細胞呢?通常是利用質(zhì)粒(plasmid)作為載體(vector)，將基因送入細胞。1.

作用：作為運載工具，將目的（外源）基因轉(zhuǎn)移到宿主細胞中去。也可以利用它在宿主細胞內(nèi)對目的基因進行大量的復制。2.

種類：質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動植物病毒等。它們的來源不同，在大小、結構、復制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差別。3.質(zhì)粒相關問題（1）定義：質(zhì)粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。（2）作為載體的特點：質(zhì)粒DNA分子上有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段(基因)插入其中。攜帶外源DNA片段的質(zhì)粒進入受體細胞后，能在細胞中進行自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制。這些質(zhì)粒上常有特殊的標記基因，如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，便于重組DNA分子的篩選(如圖)。圖

大腸桿菌及質(zhì)粒結構模式圖歸納：作為載體的質(zhì)粒應具備的特點特點相關說明一個或多個限制酶的切割位點供外源DNA片段插入其中。且這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活能在受體細胞中復制自我復制（含一個復制原點），或整合到受體細胞DNA上同步復制含有標記基因便于重組DNA分子的篩選安全的對受體細胞無害；不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去大小應適合以便提取和在體外進行操作，太大不便操作注：天然的質(zhì)粒很難能滿足以上全部條件?；蚬こ滩僮髦杏玫馁|(zhì)粒多數(shù)是在天然質(zhì)粒的基礎上進行過人工改造的。思考·討論

根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點、質(zhì)粒上的限制酶切割位點以及是否破壞目的基因和標記基因來確定限制酶的種類。1.應選擇酶切位點位于目的基因兩端的限制酶,如圖甲可選擇PstⅠ;不能選擇酶切位點位于目的基因內(nèi)部的限制酶,如圖甲不能選擇SmaⅠ。2.為避免目的基因及質(zhì)粒自身環(huán)化、正向連接、反向連接,也可使用不同的限制酶切割目的基因所在片段和質(zhì)粒(雙酶切),如圖甲可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點)。3.切割質(zhì)粒的限制酶不能同時切開質(zhì)粒上的所有標記基因,即至少要保存一個標記基因,以用于重組DNA的篩選,如圖乙中的質(zhì)粒不能使用SmaⅠ切割。4.如果使用兩種識別序列不同、但黏性末端相同的限制性內(nèi)切核酸酶分別切開目的基因和載體,兩者連接后，對于得到的重組DNA分子還能否用相應的限制性內(nèi)切核酸酶從中重新“卸下”目的基因呢？不能。思考·討論

如圖為四種限制酶BamHⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ以及BglⅡ的辨識序列。箭頭表示每一種限制酶的特定切割部位。1.其中BamHⅠ和BglⅡ限制酶所切割出來的DNA片段末端可以互補黏合，其末端互補序列為GATC。2.現(xiàn)有一種限制酶X的識別序列和酶切位點是

,則用此酶還能和圖中哪種酶的識別序列進行連接?BamHⅠ和BglⅡ。（不同的限制酶切割可以產(chǎn)生相同的黏性末端,只要切下的游離堿基互補即可互補黏合）思考·討論

下列科爾學發(fā)展史，哪些為基因工程發(fā)展奠定了理論基礎：①②③④⑤⑥⑦⑧。結合基因工程的相關工具研究，可以看出：基因工程是在遺傳學、微生物學、生物化學和分子生物學等學科基礎上發(fā)展而來的。①19世紀，在發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的基礎上，1869年瑞士生物學家米歇爾首次從細胞核中分離得到了DNA。②1944年，艾弗里(O.Avery,18771955)等人通過肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實驗,不僅證明了遺傳物質(zhì)是DNA，還證明了DNA可以在同種生物的不同個體之間轉(zhuǎn)移。③1950年，埃德曼(P.V.Edman,19161977)發(fā)明了一種測定氨基酸序列的方法。2年后，桑格(F.Sanger,19182013)首次完成了對胰島素氨基酸序列的測定。④1953年，沃森(J.D.Watson,1928)和克里克(F.Crick,19162004)建立了DNA雙螺旋結構模型并提出了遺傳物質(zhì)自我復制的假說。⑤1958年，梅塞爾森(M.Meselson,1930)和斯塔爾(F.W.Stahl,1929)用實驗證明了DNA的半保留復制。隨后不久，克里克提出中心法則。⑥1961年，布倫納、雅各布和梅瑟生發(fā)現(xiàn)了mRNA。⑦1961年，尼倫伯格(M.W.Nirenberg,19272010)和馬太(J.H.Matthaei,1929)破譯了第一個編碼氨基酸的密碼子。截至1966年,64個密碼子均被成功破譯。⑧1967年，科學家發(fā)現(xiàn)，在細菌擬核DNA之外的質(zhì)粒有自我復制能力，并可以在細菌細胞間轉(zhuǎn)移。圖

基因工程的理論基礎和技術支撐（過渡：這些復雜的發(fā)現(xiàn)我們高中生很難能夠親身體驗到，但是教材安排了一個我們能夠?qū)崿F(xiàn)的實驗，來體驗基因工程得以成功的前提。）

四、探究·實踐：DNA的粗提取與鑒定1.實驗原理DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當?shù)奈锢砘蚧瘜W方法對它們進行提取。例如，DNA不溶于（選填“溶于”、“不溶于”）酒精，某些蛋白質(zhì)溶于（選填“溶于”、“不溶于”）酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2

mol/L的NaCl溶液。在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色，因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑。2.目的要求（1）了解DNA的物理和化學性質(zhì)，理解DNA粗提取和鑒定的原理。（2）學會DNA粗提取的方法以及用二苯胺試劑對DNA進行鑒定。3.材料用具（1）材料:新鮮洋蔥(也可以選擇香蕉、菠菜、菜花和豬肝等作為實驗材料，提取DNA的方法可能稍有不同)、研磨液、體積分數(shù)為95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑和蒸餾水等。研磨液和二苯胺試劑的配制方法參見教材附錄2。注：二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會影響鑒定的效果。我們學習過的實驗試劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用的還有斐林試劑。其中，需要水浴加熱的有斐林試劑和二苯胺試劑。（2）用具:燒杯、量筒、玻璃棒、研缽、紗布、漏斗、試管、試管架、試管夾、酒精燈、石棉網(wǎng)、三腳架、火柴、刀片和天平等。4.方法步驟（1）稱取約30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨。（2）在漏斗中墊上紗布，將研磨洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可以直接將研磨液倒入塑料離心管中，在1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min,再取上清液放入燒杯中。（3）在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液(體積分數(shù)為95%)，靜置2