《沉淀反應(yīng)》課件

第六章沉淀反應(yīng)1精選課件ppt

第六章沉淀反應(yīng)1精選課件ppt第六章沉淀反應(yīng)第一節(jié)沉淀反應(yīng)的特點(diǎn)第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)一、絮狀沉淀試驗(yàn)二、免疫濁度測(cè)定2精選課件ppt第六章沉淀反應(yīng)第一節(jié)沉淀反應(yīng)的特點(diǎn)2精選課件ppt第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)一、單向擴(kuò)散試驗(yàn)二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)第四節(jié)免疫電泳技術(shù)一、對(duì)流免疫電泳二、火箭免疫電泳三、免疫電泳四、免疫固定電泳思考題小結(jié)3精選課件ppt第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)思考題3精選課件ppt

第一節(jié)沉淀反應(yīng)原理及特點(diǎn)

沉淀反應(yīng)（precipitation）是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象,其特性與經(jīng)典的抗原抗體反應(yīng)相同。4精選課件ppt

第一節(jié)沉淀反應(yīng)原理及特點(diǎn)

沉淀反應(yīng)（precipita形成肉眼可見的大的免疫復(fù)合物。沉淀線或沉淀環(huán)的觀察以及免疫比濁法中的終點(diǎn)法就是測(cè)定此階段形成的復(fù)合物

第一階段第二階段沉淀反應(yīng)分兩個(gè)階段抗原抗體特異性結(jié)合，快速但不可見。免疫比濁法中的速率法就是利用此階段測(cè)定免疫復(fù)合物形成的速率。5精選課件ppt形成肉眼可見的大的免疫復(fù)合物。沉淀線或沉淀環(huán)的觀察以及免疫比免疫濁度測(cè)定絮狀沉淀試驗(yàn)單向擴(kuò)散試驗(yàn)雙向擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)流免疫電泳火箭免疫電泳免疫電泳免疫固定電泳液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z免疫電泳技術(shù)沉淀反應(yīng)可分三類6精選課件ppt免疫濁度測(cè)定單向擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)流免疫電泳液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)7精選課件ppt第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)7精選課件ppt絮狀沉淀試驗(yàn)是將抗原與相應(yīng)抗體混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原抗體結(jié)合形成肉眼可見的絮狀沉淀物。方法受抗原抗體比例的影響非常明顯應(yīng)用于測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的最適比例(三種類型)一、

絮狀沉淀試驗(yàn)8精選課件ppt絮狀沉淀試驗(yàn)是將抗原與相應(yīng)抗體混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗抗原稀釋法：抗原最適比例抗體稀釋法：抗體最適比例方陣滴定法：抗原抗體最適比例絮狀沉淀試驗(yàn)9精選課件ppt抗原稀釋法：抗原最適比例抗體稀釋法：抗體最適比例方陣滴定法：表6-1最適比方陣測(cè)定法抗體稀釋度抗原稀釋度1/101/201/401/801/1601/3201/640對(duì)照1/5++++++++++++±—1/10+++++++++++++—1/20+++++++++++++—1/40—±+++++++++—1/80————+++—10精選課件ppt表6-1最適比方陣測(cè)定法抗體抗原稀釋度1/101/201當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時(shí)，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。利用現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量?jī)x器對(duì)濁度進(jìn)行測(cè)定從而檢測(cè)抗原含量。

原理二、免疫濁度測(cè)定11精選課件ppt當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時(shí)，在特殊的1.抗原抗體的比例：反應(yīng)體系中保持抗體過(guò)量2.抗體的質(zhì)量：特異性強(qiáng)，效價(jià)高，親和力強(qiáng)并使用R型抗體3.抗原抗體反應(yīng)液的最適PH為6.5～8.54.使用增濁劑影響因素免疫濁度測(cè)定12精選課件ppt1.抗原抗體的比例：反應(yīng)體系中保持抗體過(guò)量影響因素免疫濁度測(cè)1.透射免疫比濁法2.散射免疫比濁法3.免疫膠乳比濁法分類免疫濁度測(cè)定13精選課件ppt1.透射免疫比濁法分類免疫濁度測(cè)定13精選課件ppt第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)14精選課件ppt第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)14精選課件ppt可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠。原理15精選課件ppt可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原抗原理：抗體與待測(cè)的抗原,在兩者比例合適的部位結(jié)合形成沉淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原的濃度成正相關(guān)。技術(shù)要點(diǎn)：將抗體混入0.9%瓊脂糖內(nèi)（50℃），未凝固前傾注成平板，凝固后打孔（直徑3～5mm），孔中加入抗原溶液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，置濕盒內(nèi)37℃,24～48h觀察孔周圍是否出現(xiàn)沉淀環(huán)。定量試驗(yàn)

一、單向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）16精選課件ppt原理：抗體與待測(cè)的抗原,在兩者比例合適的部位結(jié)合形成沉淀環(huán)?？贵w+瓊脂沉淀環(huán)抗原傾注平板打孔加樣放置37℃24～48h觀察沉淀環(huán)

單向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）17精選課件ppt抗體+瓊脂沉淀環(huán)抗原傾注平板打孔加樣放置37℃24沉淀環(huán)的直徑與待測(cè)標(biāo)本含量?jī)煞N計(jì)算方法Mancini曲線：大分子抗原（IgM）時(shí)間擴(kuò)散＞48h，常數(shù)K＝C∕d2普通坐標(biāo)紙曲線Fahey曲線：小分子抗原（IgG,IgA）擴(kuò)散時(shí)間24h常數(shù)K＝logC∕d半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙曲線C為抗原濃度，d為沉淀環(huán)直徑單向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）18精選課件ppt沉淀環(huán)的直徑與待測(cè)標(biāo)本含量?jī)煞N計(jì)算方法Mancini曲線：F

T1為16～24h；T2為24～48h；T3為48h以上,可見T3為直線，T1為反拋物線

t1為16～24h；t2為24～48h；t3為48h以上,可見t1為直線，t3為反拋物線Mancini曲線Fahey曲線19精選課件pptMancini曲線Fahey曲線19精選課件ppt影響因素：抗體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，質(zhì)控血清結(jié)果與真實(shí)含量不符

單克隆抗體；多克隆抗體；可出現(xiàn)假性降低與增高

雙環(huán)現(xiàn)象

不同擴(kuò)散率抗原性相同的兩個(gè)組分

單向擴(kuò)散試驗(yàn)上排為5個(gè)不同濃度的參考品；下排為患者血清，下排右2為異常病理血清

單向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）20精選課件ppt影響因素：?jiǎn)蜗驍U(kuò)散試驗(yàn)單向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）20精選課件p原理：將抗原抗體分別加在瓊脂糖不同的對(duì)應(yīng)孔中，兩者在凝膠中自由擴(kuò)散，在比例合適處形成白色沉淀線。技術(shù)要點(diǎn)：平板玻璃上傾注一層均勻的瓊脂糖薄層，凝固后打孔，孔徑為3mm，孔間距在3～5mm之間，在相對(duì)的孔中加入抗原或抗體，放置濕盒37℃18～24h后，觀察孔周圍是否出現(xiàn)沉淀環(huán)。鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）21精選課件ppt原理：將抗原抗體分別加在瓊脂糖不同的對(duì)應(yīng)孔中，兩者在凝膠應(yīng)用1.抗原或抗體的存在與否以及相對(duì)含量的估計(jì)

2.抗原或抗體相對(duì)分子量的估計(jì)

雙向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）22精選課件ppt應(yīng)用1.抗原或抗體的存在與2.抗原或抗體相對(duì)分子雙向擴(kuò)散試驗(yàn)應(yīng)用3.抗原性質(zhì)的分析

雙向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）23精選課件ppt應(yīng)用3.抗原性質(zhì)的分析雙向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）23精選課件應(yīng)用4.抗體效價(jià)的滴定

5.抗原或抗體純度的鑒定

雙向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）24精選課件ppt應(yīng)用4.抗體效價(jià)的滴定5.抗原或抗體純度雙向擴(kuò)散試驗(yàn)（平第四節(jié)免疫電泳技術(shù)25精選課件ppt第四節(jié)免疫電泳技術(shù)25精選課件ppt優(yōu)點(diǎn)：1.加快反應(yīng)的速度。2.提高了靈敏度。3.增加了分辨率。

電泳分析＋沉淀反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的高度特異性電泳技術(shù)的高分辨率、快速、微量免疫電泳技術(shù)26精選課件ppt優(yōu)點(diǎn)：電泳分析＋沉淀反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)電泳技術(shù)的高免疫電泳技術(shù)原理：雙向擴(kuò)散+電泳比雙向擴(kuò)散試驗(yàn)靈敏度提高8～16倍技術(shù)要點(diǎn)：制備1.2%巴比妥瓊脂凝膠板，在其上成對(duì)打孔，孔徑3mm，孔距6mm，于陰極側(cè)孔內(nèi)加待測(cè)血清，陽(yáng)性側(cè)孔加抗血清，電泳條件3～4mA/cm，30min～1h。一、對(duì)流免疫電泳27精選課件ppt原理：雙向擴(kuò)散技術(shù)要點(diǎn)：制備1.2%巴比妥一、對(duì)流免疫電泳2通電－蛋白質(zhì)抗原常帶較強(qiáng)的負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)抗體球蛋白帶負(fù)電荷較少，籍電滲作用向負(fù)極泳動(dòng)

＋對(duì)流免疫電泳28精選課件ppt通電－蛋白質(zhì)抗原常帶較強(qiáng)的負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)抗體球蛋結(jié)果分析：無(wú)沉淀線出現(xiàn)則表明無(wú)相應(yīng)的抗原。沉淀線位于抗原抗體孔中間，說(shuō)明兩者比例較適合。沉淀線偏向抗原孔一方，表示抗體濃度＞抗原，反之，則是抗體濃度＜抗原濃度。對(duì)流免疫電泳29精選課件ppt結(jié)果分析：對(duì)流免疫電泳29精選課件ppt電泳時(shí)凝膠中抗體不移動(dòng)，樣品孔中的抗原向正極泳動(dòng)，隨著抗原量的逐漸減少，抗原泳動(dòng)的基底區(qū)越來(lái)越窄，抗原抗體分子復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個(gè)形狀如火箭的不溶性復(fù)合物沉淀峰，抗體濃度固定時(shí)，峰的高度與抗原量呈正相關(guān)。

原理單向免疫擴(kuò)散＋電泳,定量檢測(cè)技術(shù)二、火箭免疫電泳30精選課件ppt電泳時(shí)凝膠中抗體不移動(dòng)，樣品孔中的抗原向正極泳動(dòng)，隨著抗原量1.2%巴比妥瓊脂糖約55℃，加入適量抗血清，混勻后制板，打孔，孔內(nèi)加待測(cè)樣品，樣品孔放負(fù)極側(cè)，6h后觀察瓊脂板上沉淀峰，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測(cè)樣品濃度。技術(shù)要點(diǎn)火箭免疫電泳31精選課件ppt1.2%巴比妥瓊脂糖約55℃，加入適量抗血清，混勻后制板，打1.瓊脂（無(wú)電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規(guī)則。2.電泳終點(diǎn)時(shí)間的確定。

3.標(biāo)本數(shù)量多時(shí)應(yīng)先通電后加樣,防止寬底峰形.4.IgG定量時(shí)，可用甲醛與IgG上的氨基結(jié)合（甲?；?，抵消了電滲作用。影響因素火箭免疫電泳32精選課件ppt1.瓊脂（無(wú)電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規(guī)則。影響因素火火箭免疫電泳圖①②③④為標(biāo)準(zhǔn)抗原；⑤⑥為標(biāo)本-+火箭免疫電泳示意圖33精選課件ppt火箭免疫電泳圖-+火箭免疫電泳示意圖33精選課件pp原理：區(qū)帶電泳＋雙向擴(kuò)散1、將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中電泳分成肉眼不可見的若干區(qū)帶2、沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清進(jìn)行雙向擴(kuò)散。技術(shù)要點(diǎn)：制備瓊脂板打孔，加樣于孔內(nèi)，電泳2～3mA/cm，0.5～1h后，槽內(nèi)加入相應(yīng)抗血清作雙向擴(kuò)散。三、免疫電泳34精選課件ppt原理：區(qū)帶電泳＋雙向擴(kuò)散技術(shù)要點(diǎn)：制備瓊脂板三、免疫電泳34純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常免疫球蛋白的識(shí)別與鑒定影響因素抗原抗體比例不當(dāng),需測(cè)抗原抗體最適比

抗血清的的抗體譜，混合抗血清的使用電泳條件直接影響分辨率應(yīng)用免疫電泳35精選課件ppt純化抗原和抗體成分的分析及正常和影響因素抗原抗體比例不當(dāng),需-+免疫電泳示意圖36精選課件ppt-+免疫電泳示意圖36精選課件ppt免疫電泳原理，不同之處是將抗血清直接加于電泳后的蛋白質(zhì)區(qū)帶表面，抗原抗體在凝膠中直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，在適當(dāng)位置形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)染色后，可對(duì)各類免疫球蛋白及其輕鏈進(jìn)行分型原理區(qū)帶電泳＋沉淀反應(yīng)四、免疫固定電泳37精選課件ppt免疫電泳原理，不同之處是將抗血清直接加于電泳后的蛋白質(zhì)區(qū)帶表先將患者血清或血漿在醋纖膜或瓊脂上作區(qū)帶電泳，根據(jù)血清蛋白質(zhì)的電荷不同將其分開，然后將IgG、IgA、IgM、κ輕鏈和λ輕鏈的抗血清加于分離的蛋白質(zhì)泳道，參考泳道則加蛋白質(zhì)固定劑，用于區(qū)帶對(duì)照，作用一定時(shí)間后洗去游離蛋白質(zhì)，染色后則可見被固定的相應(yīng)M蛋白成分。技術(shù)要點(diǎn)免疫固定電泳38精選課件ppt先將患者血清或血漿在醋纖膜或瓊脂上作區(qū)帶電泳，根據(jù)血清蛋白質(zhì)

左圖為IgGκ型,

中圖為IgGλ型，右為正常

SPGAMκλSPGAMκλSPGAMκλ免疫固定電泳示意圖39精選課件ppt左圖為IgGκ型,中圖為IgGλ型，右為正常SPG分辨率強(qiáng)，敏感度高，操作周期短，僅需數(shù)小時(shí)，結(jié)果易于分析。應(yīng)用最常用于M蛋白的鑒定與分型，也用于尿中本周氏蛋白質(zhì)的檢測(cè)與κ、λ分型，腦脊液中寡克隆蛋白的檢測(cè)與分型。優(yōu)點(diǎn)免疫固定電泳40精選課件ppt分辨率強(qiáng)，敏感度高，操作周期短，僅需數(shù)小時(shí)，結(jié)果易于分析。1.主要用于血液、體液中蛋白質(zhì)的測(cè)定。2.優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性好，敏感度高，精確度高，簡(jiǎn)便快速，易于自動(dòng)化，無(wú)放射性核素污染，適合大批量標(biāo)本檢測(cè)。

3.對(duì)流免疫電