2-2-免疫組織化學技術-課件

第四章、免疫組織化學技術Immunohistochemistry吉林大學白求恩醫(yī)學院組織胚胎學系李樹蕾2013-11-19第四章、免疫組織化學技術Immunohistochemist1（二）冰凍切片免疫組化染色1.恒冷箱切片：新鮮組織或－80℃保存組織切片10-14um；2.裱片和晾干,密封-20℃短期保存；3.染色前冷丙酮4℃固定10-20分，PBS沖洗2次×5min；4.必要時細胞膜打孔。5.通常蘇木精復染細胞核，水溶性封片劑封片。（二）冰凍切片免疫組化染色2(三)培養(yǎng)細胞免疫細胞化學染色1.固定貼壁細胞制備細胞爬片；懸浮細胞制備滴片或者甩片4%多聚甲醛或冷丙酮室溫固定10-20min2.晾干易脫片的細胞大于2h，PBS沖洗2次×5min；3.細胞膜打孔(三)培養(yǎng)細胞免疫細胞化學染色3二、免疫組織化學染色其它方法比較（一）DAKO公司EnVisionTMSystems

將二抗和酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個多聚體（即EnVision）直接放大信號40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。特點：敏感、省時、方便、背景低（避免了內源性生物素干擾）。

二、免疫組織化學染色其它方法比較（一）DAKO公司EnVis4（二）邁新公司的Maxvision試劑盒

根據(jù)聚合物技術把過氧化物酶與抗鼠或/和抗兔IgG分子結合在多聚物上形成多聚物分子。該試劑盒僅一瓶裝，具有以下特點：多聚物技術，使得酶分子與二抗IgG分子直接結合形成的多聚物分子高度的敏感性、染色強度可與SP法媲美；可以避免由于生物素引起的非特異性背景顯色，更適合于生物素含量較高的組織細胞的免疫組化實驗；孵育時間短，只需孵育15分鐘。試劑盒不含顯色系統(tǒng)，需要另購DAB（二）邁新公司的Maxvision試劑盒5邁新公司EliVisionTM

plus試劑盒將多個抗鼠和抗兔的IgG分子標記在辣根過氧化物酶聚合物上，所形成的聚合物直接與一抗結合，從而放大了抗原抗體結合的信號，其放大效應比SPTM、MaxVisonTM試劑盒更高，背景更清晰，鼠、兔抗體均適用，核定位更強。特別適合于生物素含量較高的組織細胞的免疫組化研究；邁新公司EliVisionTM

plus試劑盒6EliVisionTM

Super檢測試劑盒ElivisionTMplus的基礎上，改進了增強劑，使更多辣根過氧化酶聚合物與一抗結合，以增強放大效果。與ElivisionTMplus試劑盒比較，它對鼠一抗的放大效果與ElivisionTMplus相似，但對兔一抗的放大效果，要比ElivisionTMplus提高2-3倍。其次，增強劑與酶標志聚合物在組織切片上的培育時間均只需10分鐘，較ElivisionTMplus所需的20分鐘與30分鐘，大大節(jié)約了時間。EliVisionTM

Super檢測試劑盒7（三）北京康為Polymer-二步法IHC試劑盒(帶DAB顯色液)

將多個抗鼠和抗兔的IgG分子與多個辣根過氧化物酶標記到同一大分子骨架上形成聚合物。（三）北京康為Polymer-二步法IHC試劑盒(帶DAB顯8（四）美國GBI的Polink-2plus兔超敏二步法免疫組化試劑盒將二抗的單價Fab片段和酶聚合在一起，替代傳統(tǒng)方法中的二抗和三抗，直接放大抗原抗體結合的信號，既保留抗體特異性結合抗原的能力，又可有效地避免聚合分子過大而造成的空間位阻。用于檢測一抗是兔來源的抗體。具有簡單、快速、敏感等特點，因為系統(tǒng)中不再使用生物素，所以避免由于內源性生物素所造成的背景染色。獨特的PolymerHelper可以使細胞的通透性發(fā)生改變，有利于大分子的檢測系統(tǒng)更好地結合所檢測的一抗分子，此檢測系統(tǒng)是目前已知的靈敏度最高的系列免疫組化檢測系統(tǒng)。

（四）美國GBI的Polink-2plus兔超敏二步法免疫9（五）巴傲得SuperSensitive

TMIHC試劑盒（鼠/兔通用）

聚合技術將更多HRP偶聯(lián)在一個IgG分子上，克服了生物素標記引起的背景問題和葡聚糖偶聯(lián)HRP造成的空間位阻問題，使信號放大效果更強，并減少了非特異性背景。用全新特制的HRP保護劑，使HRP活性和敏感性長期保持穩(wěn)定；同時高活性的IgG和放大劑使得反應時間大大縮短，每步只需10分鐘。產(chǎn)品特點：1）特異性強，背景極低2）反應時間短，每步只需10分鐘3）鼠、兔通用，無交叉反應

（五）巴傲得SuperSensitive

TMIHC試劑10三、免疫組織化學染色結果評價排除非特異性染色、假陰性、假陽性結果陽性對照實驗陰性對照實驗非特異性染色細胞和間質染色無區(qū)別，或間質更強染色無特定部位、無結構性染色分布無規(guī)律，某一部位均勻染色染色出現(xiàn)在干燥部位、邊緣、刀痕、組織折疊處。三、免疫組織化學染色結果評價排除非特異性染色、假陰性、假陽性11（一）以抗原表達模式定位1．細胞質內彌漫性分布，即胞質型陽性反應；2．細胞核周邊胞質內分布，其判別要點是細胞核輪廓被勾畫得很清楚。（一）以抗原表達模式定位123．胞漿內局限點狀陽性反應。4．細胞膜線性陽性反應，大多數(shù)淋巴細胞標志物的染色均如此。3．胞漿內局限點狀陽性反應。135.細胞核陽性反應如BrdU及雌、孕激素受體蛋白等。有些抗原的陽性表達也可同時出現(xiàn)在細胞的不同部位，如細胞質和細胞膜等。5.細胞核陽性反應如BrdU及雌、孕激素受體蛋白等。14(二)陽性染色結果定量1．計算免疫反應陽性細胞數(shù)每個樣品中10個非重疊視野；至少三個條件相同的樣品；柱形圖；(二)陽性染色結果定量152．以染色陽性強度和陽性檢出率相結合而定陰性0~25個﹢25~50﹢﹢50~75﹢﹢﹢﹥753.圖像分析系統(tǒng)檢測陽性結果（詳見第七章）2．以染色陽性強度和陽性檢出率相結合而定16四、討論（一）實驗計劃目的擬用方法操作流程方案預期結果分組試劑準備:一抗二抗的種類和效價器材準備：冰箱濕盒免疫組化筆玻璃筆濾紙等設置對照對每一抗體均應配陽性和陰性對照。

四、討論（一）實驗計劃17（二）抗體的稀釋度最佳抗體濃度可提高染色質量，與周圍組織形成良好對比

表4-1.確定一抗的最佳工作濃度一抗稀釋度特異性染色強度非特異性染色背景強度1:50十十十十十十1:100十十十十1:200十十一陰性對照一一在一抗稀釋度1:100和1:200之間可找出最佳稀釋度?？贵w的種類（多、單克隆抗體；即用、濃縮抗體）抗體的稀釋液：10mg/mlBSA和0.05(v/v)%Tween20加入0.01molPBS液（二）抗體的稀釋度18(三)滴加抗體注意事項

（組織切片、細胞培養(yǎng)）吸掉多余液體；注意：避免碰到組織或細胞避免干燥；注意：一次處理少數(shù)切片滴加抗體在組織表面免疫組化筆適用于培養(yǎng)細胞，注意：輕搖動數(shù)秒，使抗體分布均勻

(三)滴加抗體注意事項（組織切片、細胞培養(yǎng)）19（四）抗體的保存

1．抗體分裝濃縮型-20℃冰箱保存2．抗體稀釋用前渦旋混勻，4℃，1-2個月3．無菌與消毒與抗體接觸的工具消毒(五)對照實驗非常重要

（四）抗體的保存20常用的對照組有以下幾種：一、陽性對照

用已證實含用待測抗原的組織，與待檢標本做同樣處理后，進行免疫組化染色，結果應為陽性，稱為陽性對照。每次實驗都應做陽性對照，通過陽性對照可證明靶抗原有一定活性，染色過程中各個步驟以及所用的試劑都合乎標準，染色方法可靠。特別是當待檢的標本為陰性結果時，陽性對照呈陽性反應，可排除待檢標本假陽性的可能。所以若預期染色結果是陰性時，就必須設陽性對照。二、陰性對照

用確知不存在待檢抗原的組織切片染色，結果為陰性。陰性對照可證實組織內若不含靶抗原，就不應染色，可排除在染色過程中由于非特異性染色或交叉反應等因素造成的“假陽性”結果。三、空白對照

是最常用的對照，用不加一抗的緩沖液，如PBS替代一抗，染色結果應為陰性，說明染色方法可靠，可排除組織的內源性過氧化物酶、堿性磷酸酶、自發(fā)熒光等物質引起的非特異性顯色。

常用的對照組有以下幾種：一、陽性對照

用已證實含用待測抗原21四、替代對照

用與一抗來源相同動物非免疫血清來替代一抗，以相同的稀釋倍數(shù)進行對照染色?？勺C明待檢切片中陽性結果不是抗體以外混雜的血清成分所致，而是所用特異性抗體與組織細胞內待檢抗原的特異性反應的結果。五、吸收試驗對照

用過量已知相應的純化抗原與第一抗體反應，抗體結合點全部被抗原結合，這種被抗原吸收的抗體不能再與組織內的抗原反應，故再做免疫組化染色時，結果應為陰性。六、自身對照

用同一組織切片上與待檢抗原無關的其它結構做對照。陰性反應與陰性結構同在一個視野中，相互印證，這本身就是對陽性反應的特異性對照。但進行科研工作中，單純用這種對照是不科學的。必須增加如空白對照、替代對照等，才能使染色結果得到承認。四、替代對照

用與一抗來源相同動物非免疫血清來替代一抗，以相22對照實驗方法和結果分析對照種類靶組織實驗試劑陽性反應意義陽性組織對照組織中含待測抗原按常規(guī)操作流程提示操作系統(tǒng)的試劑和操作方法無誤一抗陰性對照/替代組織中待測抗原未定用與第一抗體相同種屬正常血清取代一抗或用PBS取代一抗，其余步驟不變。提示有非特異性反應存在二抗陰性對照/替代組織中待測抗原未定用與第二抗體相同種屬正常血清取代二抗或用PBS取代二抗，其余步驟不變。提示一抗對組織有非特異性吸附或組織內未滅活內源性酶對照實驗方法和結果分析對照種類靶組織實驗試23(六)免疫組織化學技術應用的基本原則

免疫組織化學技術的局限性：組織細胞內的待測物質要有抗原性；有一定濃度方可檢測出；檢測出的陽性蛋白不能被確定是細胞新合成的蛋白還是通過細胞間運輸而來的蛋白。

(六)免疫組織化學技術應用的基本原則免疫組織化學技術的局24應用的基本原則確定細胞類型和形態(tài)組織特異性蛋白GFAP、NF2．辨認細胞產(chǎn)物的來源針對細胞產(chǎn)物的抗體胰島素3．確定細胞的分化程度不同時期的標志性蛋白NestinvimentinTublinNF4．追蹤神經(jīng)纖維束和它的投射區(qū)軸質逆行運輸5.在臨床病理中的應用如鑒定病變性質，發(fā)現(xiàn)微小病灶，探討腫瘤起源或分化表型，確定腫瘤分期，指導治療和預后，輔助疾病診斷和分類，尋找感染病因等。AFP應用的基本原則25順向示蹤皮質脊髓束（皮層注射）熒光紅逆向示蹤（單側坐骨神經(jīng)末梢注射熒光紅）順向示蹤皮質脊髓束（皮層注射）熒光紅逆向示蹤（單側坐骨26第三節(jié)免疫組織化學雙重染色需要檢測兩種不同物質是否在同一樣品中共存或同一種細胞中共存。

1.條件：不同種屬來源的特異性抗體雙重染色；兩種抗原最好在不同部位；兩種抗體的抗原修復方法一致;應用兩種不同的顯色系統(tǒng)或不同顏色的熒光（HRP和AP或FITC和TRITC)。第三節(jié)免疫組織化學雙重染色需要檢測兩種不同272.與單染不同點：在第一種抗原顯色后，加雙標阻斷液或0.05%鹽酸,RT，10min，避免已顯色的抗原褪色。

滴加非免疫血清（與二抗同種屬）37℃，10分鐘。（不洗）接著加入第二種一抗37℃孵育，30min或4℃過夜；重復以前的步驟