《Hela細胞傳代培養(yǎng)》課件

Hela細胞傳代培養(yǎng)實驗?zāi)康模赫莆談游锛毎囵B(yǎng)的基本原理和方法。實驗用具：離心管（2支），移液槍（每個臺面一把），槍頭（每個臺面一盒），吸管（4根），培養(yǎng)皿（每組2個）實驗藥品：0.25％胰酶，D－Hanks，1640培養(yǎng)基1整理pptHela細胞傳代培養(yǎng)1整理ppt2整理ppt2整理ppt培養(yǎng)板3整理ppt培養(yǎng)板3整理ppt常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干4整理ppt常用玻璃器皿清洗4整理ppt清潔液的配制5整理ppt清潔液的配制5整理pptHeLa是HenriettaLacks的簡稱，HenriettaLacks是一位患有子宮頸癌的美國婦女的名字，在她死后，該細胞走被廣泛散發(fā)到各研究機構(gòu)，并無限次地繁殖分裂下去。

6整理pptHeLa是HenriettaLacks的簡稱，Henri細胞培養(yǎng)的甚本概念傳代細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。

原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。

7整理ppt細胞培養(yǎng)的甚本概念傳代7整理ppt培養(yǎng)細胞的特性貼附生長：必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細胞。懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞。8整理ppt培養(yǎng)細胞的特性貼附生長：必須貼附于支持物表面才能生長。見于各每代貼附生長細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）9整理ppt每代貼附生長細胞的生長過程游離期9整理ppt游離期

細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。

10分鐘一4小時10整理ppt游離期10整理ppt貼壁期細胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團）11整理ppt

12整理ppt12整理ppt13整理ppt13整理ppt

潛伏期此時細胞有生長話動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為6～24小時。14整理ppt潛

對數(shù)生長期：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。15整理ppt對數(shù)生長期：15整理ppt停止期（平臺期）細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性16整理ppt停止期（平臺期）16整理pp17整理ppt17整理ppt培養(yǎng)細胞生長的條件1細胞的營養(yǎng)需要2細胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4滲透壓3無污染4無毒18整理ppt培養(yǎng)細胞生長的條件1細胞的營養(yǎng)需要18整理pptCO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。19整理pptCO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃細胞傳代方法根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3種1懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。2.懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3.貼壁生長細胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。20整理ppt細胞傳代方法根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3種20整理ppt2細胞培養(yǎng)用液的配制D-Hanks原液試劑配方氯化鈉80.0g

磷酸氫二鈉（NaHPO·2HO）0.6g

氯化鉀4.0g

磷酸二氫鉀0.6g

三蒸水1000mlD-Hanks工作液試劑配方D-Hanks原液100ml

三蒸水896ml

0.5%酚紅液4ml21整理ppt2細胞培養(yǎng)用液的配制21整理pptD-Hanks工作液試劑配方D-Hanks原液100ml

三蒸水896ml

0.5%酚紅液4ml22整理pptD-Hanks工作液試劑配方22整理ppt消化液：胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。

胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用23整理ppt消化液：23整理ppt培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染24整理ppt培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點：標(biāo)準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。25整理ppt合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。

26整理ppt人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分27整理ppt血清中含有：27整理ppt一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死．但支持細胞生長一般需加10％血清．對于血清支持細因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚．血清中不僅存在促細胞生長因子，同對也存在細胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞所反映的生物學(xué)特性是細胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞．28整理ppt一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，如激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴展因子等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。1975年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細胞株，近20多年來已報道了幾十種細胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長和增殖。無血清細胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，，減少了細胞污染，簡化了提純和鑒定各種細胞產(chǎn)物的程序。29整理ppt無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，向無清培養(yǎng)液中能促進細胞系生長的補加物都是獨特的。適用于某種細胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細胞株的生長。即使同源組織的不同細胞株，所需補加物也不同。

無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加血清30整理ppt向無清培養(yǎng)液中能促進細胞系生長的補加物都是獨特的。適用于某種血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌31整理ppt血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。31整理ppt抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定32整理ppt抗菌素的使用：32整理ppt完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％（一般加10％）碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100卑位／毫升33整理ppt完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基實驗前的準備培養(yǎng)基的配置RPMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.0g青、鏈霉素各100單位／毫升加三蒸水至1000ml,過濾除菌。調(diào)節(jié)pH值至7.2加血清（終濃度10％）34整理ppt實驗前的準備培養(yǎng)基的配置34整理ppt消化液的配置胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用D－h(huán)anks配置。配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌35整理ppt消化液的配置35整理ppt實驗步驟1.打開超凈臺，把實驗中所需用具放到超凈臺上。2．從冰箱中取出0.25％胰酶、D－Hanks、培養(yǎng)基?？梢园岩让负虳－Hanks的瓶蓋打開或者擰松。3.取待傳代的細胞，用尖吸管棄去舊的培養(yǎng)基，加入D－Hanks。輕輕搖動后將Hanks棄掉。4.用尖吸管吸取適量胰酶加入，加入的量以覆蓋整個細胞培養(yǎng)面為宜，輕輕搖動。2－5分鐘后迅速將消化液吸出。消化時間長短是實驗成敗的關(guān)鍵，寧可短消化，不能過消化。否則細胞會變死。在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞質(zhì)回縮，胞間間隙加大為消化適宜。36整理ppt實驗步驟1.打開超凈臺，把實驗中所需用具放到超凈臺上。36整5．取培養(yǎng)基加入細胞，反復(fù)輕輕吹打培養(yǎng)皿壁，制備細胞細胞懸液。吹打的部位均勻，從上到小，從左到右，順序進行吹打，保證各個部位的培養(yǎng)細胞均能吹打到，成片的細胞已經(jīng)分散成小的細胞團或者單細胞便停止吹打。吹打時用力不要過猛，盡量不要出現(xiàn)氣泡，以免損傷細胞。6．至所有細胞從培養(yǎng)皿底部脫落下來，然后吸取至離