細(xì)胞原代培養(yǎng)

1.細(xì)胞培養(yǎng)室管理規(guī)則（1）準(zhǔn)入制度

一、無(wú)菌培養(yǎng)基本技術(shù)在本室工作的實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)嚴(yán)格遵守本室工作守則，外來(lái)人員在進(jìn)入凈化室工作之前，必須接受培訓(xùn)；沒(méi)有經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員不得單獨(dú)進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室工作；進(jìn)入培養(yǎng)后要保持安靜，不得大聲喧嘩。第2頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）安全制度細(xì)胞必須注意安全用電；謹(jǐn)慎使用酒精燈，不能在有明火的情況下加、換酒精；實(shí)驗(yàn)人員自覺(jué)維護(hù)室內(nèi)設(shè)備的安全使用，對(duì)室內(nèi)的儀器如CO2孵箱等要經(jīng)常注意機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)情況，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)檢修或報(bào)告請(qǐng)人檢修；離開凈化室必須斷開必要的儀器電源；對(duì)不符合凈化室安全規(guī)定的行為主動(dòng)報(bào)告主管老師。

第3頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天安全！！第4頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）.衛(wèi)生消毒制度一般情況下細(xì)胞間每日消毒一次（包括緩沖間），方法為紫外線消毒（每次30分鐘至1小時(shí)）一次，另外每周用10％乳酸在緊閉門窗下熏蒸30分鐘；實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)及時(shí)清理所用物品，注意臺(tái)面整潔；及時(shí)清洗所用隔離衣，并高壓滅菌后存放于指定位置；除實(shí)驗(yàn)必須的用品外，其它物品不得帶入細(xì)胞室；細(xì)胞室內(nèi)所用儀器及附屬設(shè)備均應(yīng)在指定范圍內(nèi)使用，不得隨意轉(zhuǎn)移地點(diǎn)，以便他人順利使用；細(xì)胞室實(shí)施值日生負(fù)責(zé)制，值班人員負(fù)責(zé)檢查室內(nèi)是否保持清潔整齊，督促違反規(guī)定者改正錯(cuò)誤。第5頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天第6頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（4）出入制度細(xì)胞培養(yǎng)室共有兩個(gè)緩沖間，進(jìn)入每個(gè)緩沖間必須更換指定消毒的拖鞋；穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行離開細(xì)胞室；人員流動(dòng)：原則為進(jìn)出細(xì)胞室應(yīng)按次序開、關(guān)門，只有將前面打開的門關(guān)閉后才允許打開下一個(gè)門，出入線路絕對(duì)不能逆行，使緩沖間起到應(yīng)有的作用。物品流動(dòng)：所有進(jìn)出細(xì)胞培養(yǎng)室的物品均應(yīng)通過(guò)傳遞窗進(jìn)行；物品進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室時(shí)，應(yīng)先打開傳遞窗外側(cè)門，將物品放入傳遞窗，關(guān)閉傳遞窗外側(cè)門，打開紫外燈照射15分鐘；人員進(jìn)入層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室后，關(guān)閉紫外燈，打開傳遞窗內(nèi)側(cè)門，取出物品；物品出室次序與以上進(jìn)室次序相反，但不需紫外線照射。第7頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天無(wú)菌間細(xì)胞室緩沖間第8頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)

體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會(huì)導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無(wú)菌，每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊和完全可靠。第9頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天消毒(disinfection)和消毒劑(disinfectant)滅菌(sterilization)防腐(antisepsis)和防腐劑抑菌(bacteriostasis)

無(wú)菌(asepsis)無(wú)菌技術(shù)/無(wú)菌操作(antiseptictechnique)Termstoremember第10頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天

在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無(wú)誤后將其放置操作場(chǎng)所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)?！九囵B(yǎng)前準(zhǔn)備】第11頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天無(wú)菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過(guò)多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果。操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒?！静僮饕跋尽康?2頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天第13頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天

原則上和外科手術(shù)相同。平時(shí)僅做觀察不做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺(tái)工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長(zhǎng)袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽?！鞠词趾椭b】第14頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天第15頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天

在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無(wú)菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過(guò)燒灼進(jìn)行。培養(yǎng)瓶滴管、試管、吸管【火焰消毒】第16頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天

進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換?！静僮鳌康?7頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天第18頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、原代培養(yǎng)

Primaryculture概念

從體內(nèi)取出組織細(xì)胞開始培養(yǎng)到第一次進(jìn)行傳代之前的時(shí)期，一個(gè)特征性的必然的生長(zhǎng)階段。完成了從體內(nèi)環(huán)境到體外環(huán)境的過(guò)渡和適應(yīng)過(guò)程，恢復(fù)了分裂增殖與生長(zhǎng)發(fā)育的能力。1.細(xì)胞原代培養(yǎng)概論第19頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天含義:包含

①原代培養(yǎng)實(shí)質(zhì)是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)器皿中就不再分割，任其生長(zhǎng)繁殖；

②原代培養(yǎng)中的“代”并不是指細(xì)胞繁殖的“代”數(shù)；

③原代培養(yǎng)過(guò)程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液。第20頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天特點(diǎn)(1)性質(zhì)

①性狀似體內(nèi)，可表達(dá)某些形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能,更能代表活體細(xì)胞最接近在體時(shí)的情況；

②細(xì)胞異質(zhì)性細(xì)胞成分混雜，除目的細(xì)胞之外，

其它各種細(xì)胞還存在；

③細(xì)胞活躍移動(dòng)，分裂不旺盛；

④相互依賴性強(qiáng)，獨(dú)立生存能力差,不易單個(gè)培養(yǎng)。第21頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天特點(diǎn)(2)發(fā)展過(guò)程:調(diào)整組成

原代培養(yǎng)的產(chǎn)生--選擇

結(jié)果:形成相對(duì)均一的細(xì)胞系選擇第一步:形成原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)

組織塊:能遷移出的細(xì)胞

消化分散:操作中能生存、附著，能懸浮生存。

第22頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天特點(diǎn)-發(fā)展過(guò)程選擇第二步:

時(shí)間：數(shù)小時(shí)后至鋪滿

(匯合confluence)

變化：數(shù)小時(shí)后至進(jìn)一步選擇中

3種情況:能增殖

能存活

不能存活

細(xì)胞類型繼續(xù)改變,至鋪滿

第23頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天特點(diǎn)-發(fā)展過(guò)程選擇第三步:

時(shí)間：鋪滿后

(可用于生長(zhǎng)區(qū)域已被利用)

變化：通過(guò)密度抑制

密度依賴性敏感的細(xì)胞(如正常細(xì)胞)-----

密度依賴性敏感低的細(xì)胞(如永生性細(xì)胞)---

第24頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天特點(diǎn)-發(fā)展過(guò)程需及時(shí)傳代

傳不傳代及何時(shí)傳代

根據(jù)：

接種的細(xì)胞數(shù)量

培養(yǎng)瓶皿的大小

培養(yǎng)條件

在一定程度上具有可人為操作的特征第25頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.原代細(xì)胞的取材

人和動(dòng)物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件，直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)。第26頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）取材的基本要求取材要注意新鮮和保鮮，取材部位準(zhǔn)確；應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌，盡快培養(yǎng)；防止機(jī)械損傷；去除無(wú)用組織和避免干燥；應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等；作好記錄。第27頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天第28頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）各類組織的取材技術(shù)皮膚和粘膜的取材內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材血液細(xì)胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材動(dòng)物組織取材人胚體組織取材雞（鴨）鳥類胚胎組織取材第29頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天皮膚和粘膜的取材主要取自于手術(shù)過(guò)程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般2－4平方厘米。內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材內(nèi)臟除消化道外基本是無(wú)菌的，但取材時(shí)要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實(shí)體瘤取材時(shí)要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織。第30頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天血液細(xì)胞的取材血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等）分離細(xì)胞，取材時(shí)應(yīng)注意抗凝。骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材

嚴(yán)格無(wú)菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無(wú)鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。第31頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天動(dòng)物組織取材①鼠胚組織取材首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動(dòng)物，然后將其整個(gè)浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后（注意時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力），取出動(dòng)物，在消毒過(guò)的木板上可用無(wú)菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無(wú)菌操作法解剖取胚或用無(wú)菌止血鉗挾起皮膚、用無(wú)菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾，把動(dòng)物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無(wú)菌解剖器材，采用無(wú)菌操作法解剖取出胚胎。第32頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天雞（鴨）鳥類胚胎組織取材步驟取孵化至適當(dāng)胚齡（9~12天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運(yùn)動(dòng)的胚蛋，說(shuō)明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干；經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無(wú)菌條件下采用無(wú)菌法用剪刀或中號(hào)鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚；用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無(wú)菌平皿中，解剖取材。第33頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天第34頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.原代細(xì)胞的分離和制作人或動(dòng)物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來(lái)。(1)懸浮細(xì)胞的分離方法?組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡(jiǎn)單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。第35頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)實(shí)體組織材料的分離方法對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。A.機(jī)械分散法方法:特點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速,但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。第36頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天B.消化分離法組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。第37頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶消化分離法

酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一種胰臟制品，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞分散開。第38頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天影響胰蛋白酶作用的主要因素

細(xì)胞類型酶的活力酶的濃度溫度pH無(wú)機(jī)鹽離子消化時(shí)間第39頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天膠原酶（CollagenaseCollagenase）消化法膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來(lái)的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用。第40頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天第41頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天第42頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天C.消化分離法的操作步驟剪切加液漂洗消化棄去消化液漂洗機(jī)械分散第43頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天D.消化分離法的注意事項(xiàng)組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。胰蛋白濃度不宜過(guò)高，作用時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免毒性作用。消化后組織不僅要盡量使消化液失活，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。第44頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的第一步，是一項(xiàng)基本技術(shù)。原代細(xì)胞最接近和最能反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，適宜用于藥物敏感性試驗(yàn)、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。第45頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天(1)組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。其基本方法是將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長(zhǎng)。第46頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.過(guò)程：第47頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天第48頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）消化培養(yǎng)法第49頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無(wú)需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。第50頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（4）器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)；器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對(duì)完整性，可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。第51頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、

細(xì)胞的原代培養(yǎng)和維持1.原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持(1)原代細(xì)胞培養(yǎng)：

靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)第52頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無(wú)限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞株細(xì)胞系5.如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；細(xì)胞株和細(xì)胞系？多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長(zhǎng)和分裂。隨細(xì)胞增多，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變第53頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天A.靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)要求細(xì)胞要通過(guò)充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性;細(xì)胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為5×108細(xì)胞/L;培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng);小牛血清濃度為10%-80%;應(yīng)在37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂浮;待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液。第54頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天B.懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求（以血液細(xì)胞培養(yǎng)為例）

原代培養(yǎng)時(shí)要盡量去除紅細(xì)胞；短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行；細(xì)胞濃度可在5-8×109/L范圍內(nèi)進(jìn)行分瓶實(shí)驗(yàn)；長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，淋巴細(xì)胞中要加入生長(zhǎng)因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)胞生長(zhǎng)；一般每隔3天需半量換液一次；細(xì)胞傳代一般待細(xì)胞增殖加快、細(xì)胞密度較高時(shí)才能進(jìn)行。第55頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)原代細(xì)胞的維持貼壁細(xì)胞長(zhǎng)成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，未達(dá)到飽和密度，需采取換液方式來(lái)更新營(yíng)養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖的需要。換入等量完全培養(yǎng)基或換成含2%小牛血清的維持液。懸浮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基中不僅會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會(huì)發(fā)生分裂繁殖，此時(shí)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求，需進(jìn)行換液。通常采用半量換液的方法。第56頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代原代培養(yǎng)后由于懸浮細(xì)胞增殖，數(shù)量增加甚至達(dá)飽和密度；貼壁細(xì)胞的相互匯合，使整個(gè)瓶底逐漸被細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞難以繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散接種的過(guò)程稱之為傳代。第57頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天首次傳代應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高時(shí)，不能急于傳代。原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時(shí)間。吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷。首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些。首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些。小牛血清濃度可加大至15%～20%左右。第58頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種：懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（293細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。3、傳代培養(yǎng)的方法第59頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天貼壁細(xì)胞的消化傳代步驟倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液；用D-Hank’s液洗兩遍；加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液，平放培養(yǎng)瓶，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，可見到細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大時(shí)迅速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離消化液；加培養(yǎng)液中止消化；吸取適量細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。

加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)內(nèi)。將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第60頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天消化傳代的步驟第61頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞消化過(guò)程鏡下觀察第62頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞消化的最佳程度第63頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、原代細(xì)胞的純化和克隆體外培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)都呈混合生長(zhǎng)，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，要求采用單一種類細(xì)胞來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因而培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為實(shí)驗(yàn)研究的重要一步。第64頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.細(xì)胞的純化細(xì)胞的純化分為自然純化：長(zhǎng)期傳代過(guò)程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長(zhǎng)慢的細(xì)胞，最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)旺的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。如腫瘤突變細(xì)胞通過(guò)此方法建立細(xì)胞系。人工純化：利用人為手段造成某一細(xì)胞生長(zhǎng)有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長(zhǎng)從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。主要有以下5種方法。Hela

cell第65頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）細(xì)胞因子依賴純化法：通過(guò)加入某些特殊的細(xì)胞因子而純化出只依賴于這種細(xì)胞因子生長(zhǎng)的細(xì)胞系。（2）酶消化法：利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開，達(dá)到純化的目的。另外對(duì)貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。Epitheliumcellfibroblast第66頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）機(jī)械刮除法

原代培養(yǎng)時(shí),如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為分區(qū)成片混雜生長(zhǎng)，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長(zhǎng)在瓶壁上。可采用機(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域，第67頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（4）反復(fù)貼壁法成纖維細(xì)胞其貼壁過(guò)程快，能在短時(shí)間內(nèi)完成附著過(guò)程，而上皮細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細(xì)胞。第68頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（5）電烙篩選法在貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層中會(huì)出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶，細(xì)胞密集、排列規(guī)則，有明顯生長(zhǎng)趨勢(shì)，與周邊未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限，可用烙篩選法燙死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞而保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。第69頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.細(xì)胞的克隆化細(xì)胞克隆技術(shù)又稱單個(gè)細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)，即從細(xì)胞群體中分離出一個(gè)細(xì)胞，并使其在體外培養(yǎng)體系中能繁殖成新的細(xì)胞群體，這種由單個(gè)細(xì)胞所形成的細(xì)胞群（或集落）稱為一個(gè)克隆，這種純化后的細(xì)胞群體稱為細(xì)胞株。第70頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天主要的克隆方法有5種毛細(xì)管克隆法有限稀釋克隆法平皿克隆分離法軟瓊脂克隆分離法單細(xì)胞顯微克隆法第71頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）毛細(xì)管克隆法：

將一定量的細(xì)胞懸液（如105/mL或更低）稀釋至1個(gè)細(xì)胞/mL；取10mL稀釋的細(xì)胞懸液，用直徑為0.5mm，長(zhǎng)為8mm的毛細(xì)玻璃管若干（30～50只），在負(fù)壓作用下，使懸液吸入各毛細(xì)管中；在倒置顯微鏡下檢查出每管只進(jìn)入一個(gè)細(xì)胞的毛細(xì)管，然后放入適應(yīng)性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)板）內(nèi)；在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由一個(gè)細(xì)胞在毛細(xì)管繁殖后，并向管外擴(kuò)展，并形成單個(gè)克隆的細(xì)胞群體。第72頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）有限稀釋克隆法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成懸液(貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，測(cè)定活細(xì)胞數(shù)及濃度（細(xì)胞存活率及單個(gè)細(xì)胞百分率應(yīng)高于90%以上）。消化法制備低密度細(xì)胞懸液（1－2個(gè)/ml），0.5ml/孔接種于培養(yǎng)板，6－12h后觀察標(biāo)記含單個(gè)細(xì)胞的孔。待孔內(nèi)細(xì)胞增至500-600個(gè)時(shí)進(jìn)行分離培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補(bǔ)加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)。待克隆長(zhǎng)至孔底面的1/3～1/2時(shí)，可用消化法將96孔中的單一克隆的細(xì)胞分別移至24孔板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。第73頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天第74頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天有限稀釋法計(jì)數(shù)103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔第75頁(yè),共81頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）平皿克隆分離法：

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備單個(gè)細(xì)胞懸液（懸浮細(xì)胞用吸管吹打分散，貼壁細(xì)胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培養(yǎng)基吹打分散）計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，使5mL培養(yǎng)液內(nèi)含有50～200個(gè)細(xì)胞（細(xì)胞存活率及單個(gè)細(xì)胞百分率應(yīng)大于90%以上）。將上述細(xì)胞懸液迅速移入60mm平皿中，在37℃5%