蛋白質(zhì)分離純化和表征

關(guān)于蛋白質(zhì)分離純化和表征蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)可以用滴定法滴定注意：1、某些天然蛋白質(zhì)中有一部分可解離基團(tuán)由于埋在分子內(nèi)部或參與氫鍵形成而不能被滴定。

2、如果蛋白質(zhì)變性后可解離基團(tuán)全部可被滴定。

第2頁,共74頁，2024年2月25日，星期天什么叫等電點(diǎn)？

對某一種蛋白質(zhì)來說，在某一pH值，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

第3頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和它所含的酸性氨基酸和堿性氨基酸的數(shù)量比例有關(guān)。第4頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

二、蛋白質(zhì)的大小與形狀(蛋白質(zhì)分子量測定)

(一)根據(jù)化學(xué)組成測定分子量：

用化學(xué)分析方法測出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量，并假設(shè)蛋白質(zhì)分子中只含有一個被測的元素原子，則可以由此計(jì)算出蛋白質(zhì)的最低分子量。例如:肌紅蛋白含鐵0.335%，其最低分子量可按下式算出：最低分子量=鐵的原子數(shù)55.8

鐵的百分含量X100=0.335X100=16700

有時(shí)蛋白質(zhì)分子中某一氨基酸的含量特別少，也可以用這一氨基酸含量的分析結(jié)果，計(jì)算蛋白質(zhì)的最低分子量。第5頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

(二)利用滲透壓測定分子量：

當(dāng)用一種半透膜將蛋白質(zhì)溶液與純水隔開時(shí)，只有水分子能自由地通過半透膜進(jìn)入蛋白質(zhì)溶液,而蛋白質(zhì)分子卻不能透過它進(jìn)入純水中。這種溶劑分子向溶液單方向的擴(kuò)散現(xiàn)象稱為滲透。由于滲透的結(jié)果，溶液內(nèi)的體積增加，液面升高，直至達(dá)到一定的靜水壓力時(shí)維持平衡。這時(shí)的靜水壓力就是溶液在平衡濃度時(shí)的滲透壓。第6頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

利用滲透壓的測定來計(jì)算蛋白質(zhì)分子量時(shí)，是通過測定幾個不同濃度的滲透壓，用范霍夫公式(略)求出蛋白質(zhì)分子量。

滲透壓法測定蛋白質(zhì)分子量的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：所用的實(shí)驗(yàn)裝置簡單。

缺點(diǎn)：要求被測蛋白質(zhì)純度要高，如果蛋白質(zhì)樣品中含有其他雜質(zhì)蛋白，那么由滲透壓測得的結(jié)果實(shí)際上代表幾種蛋白質(zhì)的平均分子量。

第7頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

(三)蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和擴(kuò)散系數(shù)

1、什么叫擴(kuò)散？

如小心地把純水放在蛋白質(zhì)溶液的上面，則蛋白質(zhì)分子將從下面的高濃度區(qū)向上面的低濃度區(qū)遷移，直至達(dá)到平衡為止。由于濃度差引起的這種溶質(zhì)分子的遷移稱為擴(kuò)散。擴(kuò)散是高濃度向低濃度方向進(jìn)行的。

第8頁,共74頁，2024年2月25日，星期天2、擴(kuò)散系數(shù)

它在數(shù)值上等于當(dāng)濃度為一個單位時(shí)，在一秒鐘內(nèi)通過1厘米2面積而擴(kuò)散的溶質(zhì)量

3、影響擴(kuò)散系數(shù)的因素

1)與蛋白質(zhì)的分子大小和形狀有關(guān)，擴(kuò)散系數(shù)隨分子量的增加而降低。

2)與溶劑的粘度有關(guān)，擴(kuò)散系數(shù)隨溶劑的粘度增加而降低。

擴(kuò)散系數(shù)一般不單獨(dú)用來決定分子量，但與沉降系數(shù)結(jié)合可精確測量蛋白質(zhì)分子量。第9頁,共74頁，2024年2月25日，星期天(四)

沉降分析法測定分子量(超速離心機(jī)的使用)

在強(qiáng)大的離心力作用時(shí)，蛋白質(zhì)分子就會沉降。沉降的速度：1)與蛋白質(zhì)的分子大小和密度有關(guān)；

2)也與蛋白質(zhì)分子形狀、溶液的密度

和粘度有關(guān)。

超速離心法的二個用途

1、測定蛋白質(zhì)的分子量；

2、分離純化蛋白質(zhì)。第10頁,共74頁，2024年2月25日，星期天超速離心基本原理

1、離心力(Fc)

離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運(yùn)動的任何物體都受到一個向外的離心力進(jìn)行的。離心力的大小等于離心加速度ω2X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：

FC＝mω2X

其中ω是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度／秒為單位；X是顆粒離開旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位：m是質(zhì)量，以克為單位。

第11頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

2、相對離心力(RCF)

由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力隨之變化，因此常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。相對離心力（RCF）和每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）之間相互轉(zhuǎn)換的計(jì)算方法。

RCF=1.119*10-5*r*(rpm）2

式中r為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，rpm為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)。

第12頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共74頁，2024年2月25日，星期天離心分離方法1、差速離心法：(分級超速離心法)

不同的粒子在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。2、速率區(qū)帶離心法：在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。3、等密度離心法：(密度梯度離心法)

是在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，當(dāng)梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時(shí)原來分布均勻的粒子也發(fā)生重新分布。常用的梯度液是CsCl。第14頁,共74頁，2024年2月25日，星期天分析性超速離心結(jié)構(gòu)及用途

用途：1．測定生物大分子的相對分子量

2、生物大分子的純度估計(jì)

3、分析生物大分子中的構(gòu)象變化

第15頁,共74頁，2024年2月25日，星期天超速離心機(jī)工作原理第16頁,共74頁，2024年2月25日，星期天密度梯度離心法超速離心操作方法第17頁,共74頁，2024年2月25日，星期天不同的離心轉(zhuǎn)子第18頁,共74頁，2024年2月25日，星期天(五)凝膠過濾法測定分子量(凝膠層析、分子排阻層析、分子篩層析、凝膠滲透層析)原理

分子形狀為線形的或與凝膠能發(fā)生吸附作用的蛋白質(zhì)，則不能用此方法測定分子量。第19頁,共74頁，2024年2月25日，星期天凝膠過濾的介質(zhì)（填料）1、葡聚糖凝膠：(Sephadex)Pharmacia公司(瑞典)SephadexG-25G-75G-1001000-50003000—800004000—150000

2、聚丙烯酰胺凝膠:(Bio-gel)Bio-Rad公司(美國)Bio-gelP-4P-10P-150500-40005000-1700050000-150000

3、瓊脂糖凝膠：(Sepharose)pharmacia公司(瑞典)Sepharose2B4B6B7-4000萬6-2000萬1-400萬

凝膠珠是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，凝膠的交聯(lián)度或孔度決定了凝膠的分級范圍。第20頁,共74頁，2024年2月25日，星期天舉例

實(shí)驗(yàn)中只要測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve，并以它們的分子量對數(shù)(logM)對Ve作圖得一直線，用待測樣品的Ve即可從圖中確定它的分子量。

第21頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

(六)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法

聚丙烯酰胺凝膠板狀電泳第22頁,共74頁，2024年2月25日，星期天聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳第23頁,共74頁，2024年2月25日，星期天SDS應(yīng)用原理

蛋白質(zhì)顆粒在PAGE電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素。如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS和少量的巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與原來所帶的電荷和分子形狀無關(guān)。第一，由于SDS是陰離子，使多肽鏈復(fù)蓋上負(fù)電荷，該電荷量遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，結(jié)果，所有的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物電泳時(shí)都以同樣的電荷／蛋白質(zhì)比向正極移動。第二，改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在水溶液中的形狀被認(rèn)為是近似雪茄煙形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的直徑都是一樣的約為1.8nm，而長軸長度則隨蛋白質(zhì)的分子量而成正比例地變化。第24頁,共74頁，2024年2月25日，星期天舉例載脂蛋白A-IV的分離純化第25頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

分子量計(jì)算第26頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共74頁，2024年2月25日，星期天用聚丙烯酰胺凝膠法分離純化蛋白質(zhì)第28頁,共74頁，2024年2月25日，星期天(七)蛋白質(zhì)分子的形狀分析

1、X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析：此法測定蛋白質(zhì)分子的形狀或構(gòu)象最精確，但只能給出晶體狀態(tài)的蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)信息。而不能給出在溶液中的蛋白質(zhì)形狀或構(gòu)象。

2、摩擦比分析蛋白質(zhì)形狀：蛋白質(zhì)分子在溶液中的摩擦系數(shù)可通過實(shí)驗(yàn)測得，通過摩擦系數(shù)計(jì)算摩擦比。摩擦比越大，反映蛋白質(zhì)分子的不對稱性越高，可衡量蛋白質(zhì)分子形狀偏離真正球體的程度。

第29頁,共74頁，2024年2月25日，星期天三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀(一)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

三種溶液的區(qū)分：(以分散相質(zhì)點(diǎn)的直徑來衡量)1、真溶液：分散相質(zhì)點(diǎn)小于1nm。

2、懸濁液：分散相質(zhì)點(diǎn)大于100nm。

3、膠體溶液：分散相質(zhì)點(diǎn)介于1-100nm。

蛋白質(zhì)溶液屬于膠體系統(tǒng)。

第30頁,共74頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定所具備的三個條件1、分散相的質(zhì)點(diǎn)大小1-100nm，這樣大小的質(zhì)點(diǎn)在動力學(xué)上是穩(wěn)定的，介質(zhì)分子對這種質(zhì)點(diǎn)碰撞的合力不等于零，使它能在介質(zhì)中作不斷的布朗運(yùn)動；2、分散相的質(zhì)點(diǎn)帶有同種電荷，互相排斥，不易聚集成大顆粒而沉淀；3、分散相的質(zhì)點(diǎn)能與溶劑形成溶劑化層，例如與水形成水化層，質(zhì)點(diǎn)有了水化層，相互間不易靠攏而聚集。第31頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

(二)、蛋白質(zhì)的沉淀

蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的、相對的。如果條件發(fā)生改變，破壞了蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀出來。

引起蛋白質(zhì)沉淀的原因

1、加入脫水劑以除去它的水化層。

2、改變?nèi)芤旱膒H達(dá)到蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使質(zhì)點(diǎn)失去攜帶相同凈電荷。

3、加入電解質(zhì)破壞雙電層，蛋白質(zhì)分子就會凝集成大的質(zhì)點(diǎn)而沉淀。第32頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法1、鹽析法：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽(硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等)，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。鹽析沉淀一般不引起蛋白質(zhì)變性。2、有機(jī)溶劑沉淀法：向蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的極性有機(jī)溶劑(甲醇，乙醇或丙酮等)，因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉淀。3、重金屬鹽沉淀法：當(dāng)溶液pH大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，容易與重金屬離子(Hg2+、Pb2+、Cu2+，Ag+等)結(jié)成不溶性鹽而沉淀。第33頁,共74頁，2024年2月25日，星期天4、生物堿試劑和某些酸類沉淀法：

生物堿試劑是指能引起生物堿沉淀的一類試劑，如鞣酸(單寧酸)，苦味酸(2，4，6—三硝基酚)，鎢酸和碘化鉀等。某些酸類指的是三氯醋酸，磺基水揚(yáng)酸和硝酸等。當(dāng)溶液pH小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑和酸類的酸根負(fù)離子發(fā)生反應(yīng)生成不溶性鹽而沉淀。5、加熱變性沉淀法：

幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。少量鹽類能促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，加熱凝固最完全和最迅速。加熱變性可能是由于熱變性使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，因而破壞了水化層而致。第34頁,共74頁，2024年2月25日，星期天四、蛋白質(zhì)分離提純的一般原則

蛋白質(zhì)提純的總目標(biāo)1、增加純度或比活性(生物活性)。2、設(shè)法除去變性的和不要的蛋白質(zhì)。3、希望所得蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到最高值(得率)。

第35頁,共74頁，2024年2月25日，星期天分離純化蛋白質(zhì)的一般程序可分三步1、前處理：

破碎組織和細(xì)胞，提取組織或細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，并保持天然狀態(tài)，不丟失生物活性。破碎組織和細(xì)胞動物組織和細(xì)胞：用電動搗碎機(jī)、勻漿器或超聲波破碎；植物組織和細(xì)胞：由于細(xì)胞壁由纖維素、半纖維素和果膠等組成，用石英砂和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理；細(xì)菌細(xì)胞的破碎：細(xì)菌細(xì)胞壁由共價(jià)鍵連接而成的稱為肽聚糖的囊狀分子組成，非常堅(jiān)韌。常用超聲波振蕩、與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。第36頁,共74頁，2024年2月25日，星期天提取組織或細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)1)如果所要的蛋白質(zhì)主要集中在某一細(xì)胞組分，如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性的細(xì)胞漿等，可用差速離心方法將它們分開。2)如果所要蛋白質(zhì)是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。

第37頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

2、粗分級：

一般采用分級鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級分離等方法。這些方法的特點(diǎn)是簡便、處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)溶液。

3、細(xì)分級：

進(jìn)一步提純，一般使用層析法(包括凝膠過濾，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等)。必要時(shí)還可選擇電泳法(包括區(qū)帶電泳、等電聚焦等)作為最后的提純步驟。第38頁,共74頁，2024年2月25日，星期天結(jié)晶蛋白質(zhì)的制備

一定純度的蛋白質(zhì)才能形成結(jié)晶，結(jié)晶過程也能使蛋白質(zhì)純度進(jìn)一步提高，重結(jié)晶可除去少量夾雜的蛋白質(zhì)。一般結(jié)晶狀蛋白質(zhì)具有天然活性。

蛋白質(zhì)純度愈高，溶液愈濃就愈容易結(jié)晶。結(jié)晶的最佳條件是使溶液略處于過飽和狀態(tài)，要得到適度的過飽和溶液，可借控制溫度、加鹽鹽析，加有機(jī)溶劑或調(diào)節(jié)pH等方法來達(dá)到。接入晶種常能加速結(jié)晶過程。第39頁,共74頁，2024年2月25日，星期天五、蛋白質(zhì)的分離純化方法

(一)根據(jù)分子大小不同的分離方法

1、透析和超過濾透析和超過濾就是利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽，單糖、水等分開。常用的半透膜是玻璃紙、火棉紙和其他合成材料。

第40頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

透析：

是將待提純的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里放在緩沖液中進(jìn)行，使透析袋內(nèi)無機(jī)鹽等小分子物質(zhì)降低到最小值。第41頁,共74頁，2024年2月25日，星期天超過濾：是利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上。第42頁,共74頁，2024年2月25日，星期天2．密度梯度(區(qū)帶)離心：

前述，此略。3．凝膠過濾：前述，此略。

第43頁,共74頁，2024年2月25日，星期天(二)利用溶解度差別進(jìn)行分離

影響蛋白質(zhì)溶解度的外界因素

1)溶液的pH，2)離子強(qiáng)度，3)介電常數(shù)，4)溫度。

影響蛋白質(zhì)溶解度的內(nèi)在因素在同一條件下，不同蛋白質(zhì)具有不同的溶解度，這是因?yàn)槿芙舛热Q于它們本身的分子結(jié)構(gòu)，如：

1)分子中親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)的比例，

2)親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)在蛋白質(zhì)分子表面的排列和由此而產(chǎn)生的偶極距等。

第44頁,共74頁，2024年2月25日，星期天影響蛋白質(zhì)溶解度的外界因素

1、pH與蛋白溶解度

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，帶電基團(tuán)的電荷數(shù)量因pH不同而變化

1)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)pH時(shí)，蛋白質(zhì)的凈電荷為零，使相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力，趨于結(jié)聚而沉淀，因此當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)pH時(shí)的溶解度最低。

2)在等電點(diǎn)以上或以下的pH時(shí)，蛋白質(zhì)分子攜帶同種符號

(或正或負(fù))的凈電荷而互相排斥，阻止了單個分子結(jié)聚成沉淀物，因此溶解度較大。第45頁,共74頁，2024年2月25日，星期天2、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析：

鹽溶：低濃度中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽析：高濃度中性鹽則使蛋白質(zhì)沉淀出來，這種現(xiàn)象稱為鹽析。第46頁,共74頁，2024年2月25日，星期天鹽溶和鹽析原理1)鹽溶原理：

鹽溶是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用卻加強(qiáng)，因而溶解度提高。2)鹽析原理：

鹽析是由于大量中性鹽的加入，使水的活度降低，原來溶液中的大部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子間的相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。第47頁,共74頁，2024年2月25日，星期天鹽析法分離、純化并結(jié)晶牛胰臟中酶蛋白舉例第48頁,共74頁，2024年2月25日，星期天3．有機(jī)溶劑分級法：

與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低，引起蛋白質(zhì)沉淀和變性。

為了減少蛋白質(zhì)變性，可預(yù)先將有機(jī)溶劑冷卻到-40℃至-60℃，然后在不斷攪拌下逐滴加入有機(jī)溶劑。

蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度隨溫度、pH和離子強(qiáng)度而變化。在一定溫度，pH和離子強(qiáng)度條件下，控制有機(jī)溶劑濃度可以達(dá)到分離蛋白質(zhì)目的。

第49頁,共74頁，2024年2月25日，星期天原理：1、有機(jī)溶劑改變介質(zhì)的介電常數(shù)。水是高介電常數(shù)物質(zhì)(20℃時(shí)，80)，有機(jī)溶劑是低介電常數(shù)物質(zhì)(20℃時(shí)，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)，有機(jī)溶劑的加入使水溶液的介電常數(shù)降低。從而增加兩個相反電荷之間的吸引力。使蛋白質(zhì)分子表面可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，因此促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。2、有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀可能與鹽析相似，與蛋白質(zhì)爭奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集產(chǎn)生沉淀。第50頁,共74頁，2024年2月25日，星期天舉例

調(diào)節(jié)酒精濃度和PH值對血漿蛋白質(zhì)的分級分離

第51頁,共74頁，2024年2月25日，星期天4．溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響：1)在0-40℃范圍內(nèi)，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加。2)在40-50℃以上，大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定并開始變性，一般在中性pH介質(zhì)中即失去溶解力。3)多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分離操作一般都在0℃或更低的溫度下進(jìn)行。

第52頁,共74頁，2024年2月25日，星期天(三)根據(jù)電荷不同的分離方法

根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分離純化蛋白質(zhì)的方法有電泳和離子交換層析兩類。第53頁,共74頁，2024年2月25日，星期天1、電泳：定義：

在電場作用下，不處于等電狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱電泳。用途：電泳技術(shù)可用于氨基酸、肽，蛋白質(zhì)、核苷酸和核酸等生物分子的分離和制備。

影響因素帶電顆粒在電場中的泳動速度主要決定于它所帶的凈電荷量以及顆粒的大小和形狀。第54頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

區(qū)帶電泳：

是由于在支持物上電泳時(shí)各組分因遷移速度不同分布成區(qū)帶而得名。按其支持介質(zhì)的物理性狀不同可以分成四類

1)濾紙電泳和薄膜電泳：醋酸纖維薄膜電泳和聚酰胺薄膜電泳等

2)粉末電泳：支持介質(zhì)是淀粉，纖維素粉或硅膠粉等，粉末與適當(dāng)?shù)娜軇┱{(diào)和，鋪設(shè)成平板。

3)細(xì)絲電泳：如尼龍絲和其他人造絲電泳，這是一類微量電泳；

4)凝膠電泳：常用的支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠，前者適于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸，后者適于分離核酸。

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等電聚焦

等電聚焦時(shí)，蛋白質(zhì)混合物的分離是在含能形成pH梯度兩性電解質(zhì)(Ampholine)的蔗糖介質(zhì)中進(jìn)行的。在電場內(nèi)，每種蛋白質(zhì)成分將移向并“聚焦”(停留)在等于其等電點(diǎn)的pH梯度處，形成一個很窄的區(qū)帶。第56頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

雙向電泳：蛋白質(zhì)、氨基酸或寡核苷酸混合物一次電泳往往不能完全分開。在這種情況下可將第一次電泳分開的斑點(diǎn)通過支持介質(zhì)間的接觸吸印轉(zhuǎn)移到第二個支持介質(zhì)上，旋轉(zhuǎn)900，進(jìn)行第二次電泳。這種方法被稱為雙向電泳。

蛋白質(zhì)雙向電泳第57頁,共74頁，2024年2月25日，星期天InternalstandardShenyangxu

TreatedFig.12-Dproteinmapfromgel3(pH3-10NL,24cm)第58頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

InternalstandardDiseaseTreatedFig.2Fullimageoflivermitochondriaproteome第59頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Fig.33-Dchartsofspot1:Spot82:Spot16第60頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Tble2TheidentifiedproteinspotsbyMALDI-TOFMSandmationSpotNo.ProteinnamePIMrcontroldiseasetreateddisease/controltreated/disease1肌氨酸脫氫酶(Sarcosinedehydrogenase)6.151016797.78±0.4310.50±0.319.81±0.161.35-1.062氨甲酰磷酸合成酶(Carbamo-ylphosphatesynthetase1)6.331644768.21±0.3210.60±0.1811．23±0.361.291.064熱休克蛋白60(60kDaheatshockprotein）5.91609175.58±0.3811.43±0.2613.04±0.332.051.145熱休克蛋白70(70kDaheatshockprotein）5.97738147.23±0.359.98±0.249.78±0.351.38-1.026醛脫氫酶(Mitochondrialaldehydedehydrogenase）6.69555667.41±0.1910.44±0.3911.8±0.431.411.138硫辛酰胺脫氫酶(2-oxoisovaleratedehydrogenase)7.685013311.84±0.857.46±0.489.10±0.36-1.371.229鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Ornithineaminotransferase）6.534830210.85±0.487.48±0.566.81±0.40-1.31-1.0910脂酰輔酶A脫氫酶(Acyl-CoAdehydrogenase)8.474473711.70±0.459.37±0.347.21±0.46-1.20-1.2312亞硫酸氧化酶(Sulfiteoxidase）5.79543208.24±0.2111.20±0.6212.32±0.651.361.1015ATP合成酶(ATPsynthase）9.22587907.98±0.519.57±0.1511.58±0.241.201.2116NADH脫氫酶(NADHdehydrogenase）7.57208458.52±0.3610.74±0.347.84±0.681.26-1.27第61頁,共74頁，2024年2月25日，星期天5、離子交換柱層析

方法

陽離子交換樹脂含酸性基團(tuán)如-SO3H(強(qiáng)酸型)或-COOH(弱酸型)可解離出H+離子，當(dāng)溶液中含有其他陽離子時(shí)，如在酸性環(huán)境中的氨基酸陽離子，它們可以和H+發(fā)生交換而“結(jié)合”在樹脂上。同樣陰離子交換樹脂含有堿性基團(tuán)如-N(CH3)3OH(強(qiáng)堿型)或-NH3OH(弱堿型)可解離出OH—，能和溶液里的陰離子，如和堿性環(huán)境中的氨基酸陰離子發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。

原理第62頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

1、離子交換纖維素(Cellulose)和葡聚糖(Sephadex)陽離子交換劑

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陰離子交換劑第64頁,共74頁，2024年2月25日，星期天2、洗脫方法：1)改變緩沖液pH，使大分子的電荷減少，從吸附狀態(tài)變?yōu)榻馕鼱顟B(tài)。2)增加緩沖液離子強(qiáng)度，使離子的競爭力加大，將大分子從纖維素上替換下來。3、洗脫方式：1)階段洗脫，即用幾個具有不同洗脫能力的緩沖液分步洗脫。2)梯度洗脫，即在梯度洗脫中緩沖液的洗脫能力是逐漸連續(xù)性地增加的。第65頁,共74頁，2024年2月25日，星期天5、梯度洗脫的類型：通常采用的梯度形式有線形，凸形，凹形和復(fù)合形四種，使用最多的是線性梯度。一般采用梯度混合器。1)簡單型混合器：第66頁,共74頁，2024年2月25日，星期天2)復(fù)合型混合器：第67頁,共74頁，2024年