2023-2024學年高二下學期生物人教版選擇性必修三3-1+重組DNA技術的基本工具教學設計

3.1重組DNA技術的基本工具一、教材分析（一）教學目標1.闡明重組DNA技術所需的三種基本工具的作用。2.認同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術創(chuàng)新。3.進行DNA的粗提取與鑒定。（二）教學重點和難點1.教學重點（1）重組DNA技術所需的三種基本工具的作用。（2）DNA的粗提取與鑒定。2.教學難點（1）基因工程載體需要具備的條件。（2）DNA的粗提取與鑒定。（三）編寫思路本節(jié)內容是學習本章其他內容的基礎。由于重組DNA技術所需的“分子工具”對學生而言是抽象的，因此教材在“從社會中來”欄目中創(chuàng)設了具體的培育轉基因番木瓜的情境，讓學生認識到培育轉基因番木瓜需要用到專門的“分子工具”，進而引導他們思考用到了哪些“分子工具”，以及這些“分子工具”各具有什么特征。本節(jié)內容的編排主要遵循“簡約、形象、誘思”的原則。“簡約”體現(xiàn)在重組DNA技術所需的“分子工具”種類多樣，根據(jù)課程標準的內容要求，同時考慮到高中生物學課程的基礎性，教材只把三種基本的工具介紹給學生，并未拓展?！靶蜗蟆币环矫骟w現(xiàn)在教材給一些抽象的文字描述配了形象、直觀的插圖，如“限制酶切割DNA分子產(chǎn)生兩種不同末端的示意圖”可以使學生準確地理解切割的部位和“黏性”的內涵；“大腸桿菌及質粒結構模式圖”可以使基因工程載體需要具備的條件的相關內容變得容易理解。另一方面，教材采用了打比方的方法，使三種基本工具的作用“形象化”，這樣也是為了便于學生理解和掌握?！罢T思”體現(xiàn)在教材針對學習的內容，提出一些相應的問題，啟發(fā)學生思考。例如，在介紹限制酶時，提出“推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么”的問題，是為學生深入理解限制酶在生物體中的作用打開思路；學，生在學習DNA連接酶時，很自然地會想到學過的催化脫氧核糖核昔酸聚合的DNA聚合酶，提出"DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎”的問題，可以引導學生分析兩者的不同作用，從而達到讓他們深入認識DNA連接酶的目的。本節(jié)安排的“思考，討論重組DNA分子”，意在讓學生通過模擬制作和討論相關問題，初步感受構建重組DNA分子的過程，并進一步熟悉、理解限制酶和DNA連接酶的作用。“到社會中去”安排了讓學生了解生產(chǎn)和銷售“分子工具”的公司生產(chǎn)產(chǎn)品的情況，分析相關上市公司的股票價格走勢的活動，這些活動超越了生物技術本身的范疇，突出了生物技術在社會經(jīng)濟活動及日常生活中的重要作用。對學生而言，活動既新穎又具有積極的意義，他們在完成活動的過程中，能體會到科學、技術、社會三者間的關系。由于重組DNA技術是在DNA分子水平上進行的操作，提取和鑒定DNA是該技術涉及的最基礎的操作，因此本節(jié)最后安排了“探究，實踐DNA的粗提取與鑒定”活動，讓學生學習相關操作。通過這個活動還可以幫助學生鞏固在必修課中已經(jīng)學過的DNA的結構和理化性質的知識，使他們對DNA這一微觀分子形成一定的感性認識。二、教學建議本節(jié)教學建議安排2課時，其中1課時用于開展“探究，實踐”活動。在教學中可以按照教材的安排先講解重組DNA技術的基本工具的內容，再開展探究實踐活動，也可以先開展探究實踐活動后講解。具體的教學建議如下。（一）結合基因工程應用的實例引人本節(jié)課的學習本節(jié)課是學習基因工程的開端，課前可以帶領學生參觀當?shù)嘏e辦的與基因工程有關的展覽、轉基因實驗基地、轉基因作物種植基地等，或指導學生借助互聯(lián)網(wǎng)、科普雜志等，初步了解一些基因工程應用的實例；也可以利用教材中的素材，如章引言中培育轉基因抗蟲棉的實例，本節(jié)開篇“從社會中來”欄目中培育轉基因番木瓜的實例，提出本節(jié)課要解決的問題，即在基因工程的操作中需要用到哪些“分子工具”，從而引人本節(jié)課的學習。（二）引導學生在分析舊知識的基礎上理解和掌握新知識本節(jié)的內容是建立在必修1教材中酶的作用和特性，必修2教材中噬菌體侵染細菌的實驗、DNA的結構和復制等相關內容的基礎上的。引導學生建立新舊知識之間的聯(lián)系，將有助于他們理解和掌握新知識。例如，在講授限制酶有關的內容時，可以設置問題“限制酶從哪里尋找”，引導學生聯(lián)系噬菌體侵染細菌的實驗，認識到細菌等原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但它們卻不受影響，這是因為它們在長期進化的過程中形成了一套防御機制，限制酶就是它們的一種防御性工具，從而讓學生了解限制酶的來源和理解它們存在的意義；在介紹限制酶的作用部位時，還要聯(lián)系DNA的結構來幫助學生理解限制酶作用的特點。此外，在介紹DNA連接酶有關的內容時，可以聯(lián)系學生已經(jīng)學過的DNA聚合酶的相關知識，通過對兩種酶進行比較，來加深他們對DNA連接酶的認識。（三）組織好教材中的“思考，討論”活動，幫助學生理解“分子工具”的本質特征基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，屬于微觀層面，學生在日常生活中很少接觸到，對此比較陌生，難于理解。因此，在教學中要充分利用教材中的生動形象的比喻、直觀的插圖、模擬制作活動等幫助學生增加感性認識。教材“思考，討論”中的模擬制作活動對學生理解“分子工具”的本質特征具有十分重要的作用。教材中主要模擬的是限制酶和DNA連接酶的作用，教學時可以讓活動內容更加豐富，如可以增加不同的DNA片段，模擬不同限制酶的切割，甚至可以增加對載體的模擬，在載體中畫出相應的關鍵結構以及需要切割的DNA片段等?；顒拥陌才趴梢园凑战滩闹械捻樞颍趯W生學習完本節(jié)內容后開展，以反饋檢測學生對前面內容的掌握情況；也可以邊講授相關的內容，邊帶領學生進行活動，通過任務驅動，讓學生在活動的過程中理解工具的作用。開展活動的同時，要注意利用好教材中的討論題引導學生展開討論，否則模擬活動可能會變成簡單的模仿。（四）借助科學史，讓學生認同基因工程的誕生離不開技術創(chuàng)新基因工程的原理看似很簡單，即將外源基因導入受體細胞，使這個基因能在受體細胞內復制、轉錄和翻譯，進而賦予生物新的遺傳特性。但其實從理論研究到工程實踐的過程并不簡單，這條發(fā)展之路離不開一項項創(chuàng)新技術的推動，教學中應該讓學生明白這一點?？梢酝ㄟ^引導學生自主閱讀本章的“科技探索之路”，補充與三種“分子工具”發(fā)現(xiàn)歷程相關的科學史資料，或讓學生在課下查找相關資料，幫助他們認識到基因工程得以實現(xiàn)離不開三種“分子工具”的發(fā)現(xiàn)和成功運用，進而深刻體會到技術創(chuàng)新的重要意義。三、“探究·實踐”指導DNA的粗提取與鑒定提取與鑒定DNA是基因工程中獲取目的基因的基礎，本實驗通過讓學生體驗DNA的粗提取與鑒定的過程，幫助學生了解DNA的理化性質，讓他們明白如何利用物質的理化性質，用物理和化學的方法進行分離和提純。（一）材料準備植物材料：新鮮的洋蔥、菠菜、菜花、香蕉、草莓等，若準備的植物材料不馬上使用，可以將其放入冰箱冷藏或冷凍保存。動物材料：新鮮的豬肝、魚白（魚的精巢）等，若準備的動物材料不馬上使用，也可以將其冷藏或冷凍保存。（二）實施建議1.DNA的粗提?。?）如果以菜花為實驗材料，由于它的硬度較高，容易出現(xiàn)研磨不充分的情況，需要延長研磨的時間，而如果研磨時間太長，研磨時產(chǎn)生的熱量可能會影響DNA的提取量，因此有條件的學?？梢栽诓牧咸幚淼倪^程中加入纖維素酶，這樣研磨的效果較好。如果以洋蔥為實驗材料，它的氣味相對刺激，可以為學生準備護目鏡，并注意通風。不同的實驗材料，其DNA的含量有所差別，香蕉、草莓、魚白等材料中的DNA含量較高。該實驗也可以選取各種植物的葉為實驗材料。葉中往往含有大量的蛋白多糖、丹寧和色素等雜質。在粗提取過程中大多數(shù)蛋白質可以通過氯仿處理變性、沉淀后被除去（參見本部分第5條建議的內容）；大多數(shù)糖類雜質較難除去，它們在濃度較高時常常會使提取物呈膠狀，從而影響鑒定的結果，實驗前可將材料置于低溫、暗處保存，以降低多糖的含量。[2]（2）本實驗處理植物材料的研磨液中含有SDS（十二烷基硫酸鈉），EDTA（乙二胺四乙酸）、Tris（三甲基氨基甲燒）等試劑。SDS可使蛋白質變性與DNA分離；EDTA是一種DNA酶的抑制劑，可防止細胞破碎后DNA酶降解DNA；Tris提供緩沖體系，DNA在這個緩沖體系中呈穩(wěn)定狀態(tài)。實驗中若遇到實驗試劑缺乏的情況，可以用家用洗潔精（含有SDS）或質量百分比為10%的洗衣粉水溶液（含有蛋白酶和表面活性劑，可用溫水溶解洗衣粉）替代研磨液，也能達到裂解細胞膜、讓蛋白質變性的目的。還可以在研磨、過濾后得到的濾液中加入嫩肉粉（含有木瓜蛋白酶），并在適宜溫度的水浴中加熱以加快反應速率，促使部分蛋白質水解。下面以香蕉為例，介紹學生在家就可以完成的DNA粗提取的操作。香蕉中DNA的粗提取實驗①取一段長約2cm的去皮香蕉，剪碎置于玻璃杯中。②加入10mL溫水，2g食鹽，5滴洗潔精，充分研磨。③用雙層紗布過濾研磨液，收集濾液。④向濾液中加人2g嫩肉粉，混合均勻。⑤將濾液置于55~60℃（木瓜蛋白酶作用的最適溫度）的水浴中加熱5~10min。⑥冷卻，加入等體積、預冷的體積分數(shù)為95%的酒精。⑦靜置2~3min，用玻璃棒（或筷子）挑取白色絮狀析出物。（3）教師還可以布置學生在課前查閱有關DNA在不同濃度NaCI溶液中溶解度發(fā)生變化的資料，以此為依據(jù)設計其他粗提取DNA的方案，從而加深學生對DNA理化性質的認識，提高他們的科學探究能力。（4）若提取的DNA中含有較多的雜質，鑒定效果不明顯，教師可以引導學生思考提取的DNA中可能有哪些雜質，能用什么方法鑒定這些雜質等。例如，雙縮脈試劑可用于鑒定蛋白質。（5）若想提高提取的DNA的純度，可以在研磨、過濾后得到的濾液中加入等體積的氯仿，離心后取上清液，再加人等體積、預冷的體積分數(shù)為95%的酒精以析出DNA。這樣操作的原因是氣仿能使蛋白質失去水合狀態(tài)而變性，從而析出；離心后，溶液會分層，上層為水相，下層為有機相（氯仿）；DNA溶解在上層，析出的蛋白質的密度比水的大，比氛仿的小，它分布在水相與有機相中間，這樣就實現(xiàn)了蛋白質與DNA的分離。2.DNA的鑒定（1）DNA中嘌呤核昔酸上的脫氧核糖遇酸生成w-羥基-y-酮基戊醛，后者再和二苯胺試劑作用呈現(xiàn)藍色。鑒定時溶液藍色的深淺，與溶液中DNA含量的多少有關，可以加入適量乙醛.以提高反應的靈敏度。（2）DNA與二苯胺試劑反應后的溶液對波長為595nm的光有最大吸收峰，并且DNA的含量在一定范圍時，吸光度的值與DNA的含量成正比，利用這個原理可以測定DNA的含量。（三）注意事項1.在將待鑒定的提取物加人2mol/L的NaCI溶液中溶解時，需要不斷攪拌以增加溶解的DNA的量，建議攪拌3min以上。2.二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，以保證實驗效果。同時，加入二苯胺試劑后沸水浴處理的時間要在5min以上，且要等到冷卻后再觀察結果，這樣才可以觀察到較為明顯的顯色反應。四、答案和提示（一）從社會中來提示

科學家用到了限制酶、DNA連接酶、載體等“分子工具”。限制酶能識別雙鏈DNA分子的特定核昔酸序列，并將DNA雙鏈切斷，形成具有黏性末端或平末端的片段。DNA連接酶催化磷酸二酯鍵的形成，即催化一個DNA片段3'端的羥基與另一個DNA片段5'端的磷酸基團上的輕基連接起來形成酯鍵。載體上可以插入外源基因，它能攜帶該基因進入受體細胞，并在受體細胞中進行自我復制，或者整合到受體DNA上，隨著受體DNA同步復制。載體一般還帶有標記基因，以便進行重組DNA分子的篩選。（二）旁欄思考題1.提示原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制。限制酶就是它的一種防御性工具。當外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。2.不是一回事。雖然DNA連接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯鍵形成的酶，但兩者存在顯著的區(qū)別。（1）DNA聚合酶只能催化單個核苷酸加到已有的核酸片段3'末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是催化單個核昔酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶以一條DNA鏈為模板，催化形成與模板鏈互補的DNA鏈；而DNA連接酶催化具有互補黏性末端或平末端的DNA片段連接起來，它不需要模板。此外，兩者雖然都是蛋白質，但它們的組成和性質各不相同。（三）思考·討論1.剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.提示根據(jù)學生實際操作的情況進行指導。如果制作的黏性末端的堿基不能互補配對，可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。3.不能，因為基因的長度一般在100個堿基對以上。（四）到社會中去提示

在調查中需要了解企業(yè)的生產(chǎn)技術、產(chǎn)品的種類和產(chǎn)量、銷售渠道和銷售情況等，這樣才有可能對企業(yè)的經(jīng)營狀況進行正確的判斷。（五）練習與應用概念檢測1.C。2.A。拓展應用1.提示迄今為止，在基因工程操作中使用的限制酶絕大部分都是從細菌或霉菌中提取出來的，它們可以識別DNA上特定的堿基序列并使特定部位的磷酸二酯鍵斷開。微生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，可以將外源入侵的DNA降解。細菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因為含有某種限制酶的細胞的DNA分子或者不具備這種限制酶的識別序列，或者通過甲基化酶將甲基轉移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶，也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA人侵。2.（1）XbaI。因為XbaI與SpeI切割產(chǎn)生了相同的黏性末端。（2）提示識別DNA分子中不同核昔酸序列，但能切割產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶。同尾酶使構建載體時，切割位點的選擇范圍擴大。例如，我們選擇了用某種限制酶切割載體，如果目的基因的核昔酸序列中恰好含有該限制酶的識別序列，那么用該限制酶切割含有目的基因的DNA片段時，目的基因就很可能被切斷；這時可以考慮用合適的同尾酶（目的基因的核昔酸序列中不能有它的識別序列）來獲取目的基因。（六）探究·實踐結果分析與評價1.提示觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質較多。二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍色說明實驗基本成功；如果不呈現(xiàn)藍色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實驗操作過程中出現(xiàn)了失誤等。2.本實驗粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質。3.提示本實驗可以采取分組的方式進行?？梢赃x取不同的實驗材料；也可以查閱資料了解其他提取DNA的方法，對同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實驗結果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺試劑顯色的深淺等，看看哪種實驗材料、哪種提取方法的效果更好。進一步探究提示

實驗室提取純度較高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加質量分數(shù)為25%的SDS溶液，使蛋白質變性后與DNA分開；隨后，加入氣仿一異丙醇混合液（體積比為24：1），通過離心將蛋白質及其他雜質除去，取上清液；可重復上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。此外由于苯酚可以迅速使蛋白質變性，抑制核酸酶的活性，因此還可以先用苯酚處理，然后離心分層，這時DNA溶于上層水相，蛋白質變性后存在于酚層中，用吸管、微量移液器等實驗用具就可以將兩者分開。教師可以根據(jù)學校的條件讓學生自己設計實驗方案，比較實驗結果。五、背景資料（一）轉基因抗病毒番木瓜的培育過程番木瓜是一種廣受人們喜愛的水果，但是它的生產(chǎn)卻一直受到番木瓜環(huán)班病毒（PRSV）的嚴重威脅。PRSV是一種單鏈RNA病毒，主要經(jīng)蚜蟲傳播，能侵染多種葫蘆科植物。病毒傳播嚴重時，會導致番木瓜減產(chǎn)80%~90%。早在1928年就有人觀察到，接種了煙草花葉病毒弱毒株的煙草，雖然接種葉會出現(xiàn)壞死斑，但整個植株獲得了對同種及相近種病毒的抗性。研究發(fā)現(xiàn)，在其他植物中也大多存在類似的現(xiàn)象，人們把此現(xiàn)象稱為交叉保護。美國夏威夷大學和康奈爾大學的科研人員于1986年開始研究培育抗PRSV的轉基因番木瓜。當時科學家認為番木瓜染病是病毒外殼蛋白誘發(fā)的，于是他們根據(jù)交叉保護現(xiàn)象，通過基因槍法將PRSV毒株HA5-1的外殼蛋白（coatprotein，CP）基因導入了番木瓜的愈傷組織內，并于1990年獲得了世界上首例轉PRSV-CP基因的番木瓜。1998年4月，兩個品種的轉基因番木瓜在美國獲準商業(yè)化種植。美國培育出的抗PRSV番木瓜品種，主要是對夏威夷地區(qū)的HA病毒株系具有抗性，對我國華南地區(qū)主要存在的四個番木瓜環(huán)斑病毒株系Ys、Vb、Sm和Lc不具有抗性。因此，我國科學家開始選用我國存在的病毒株系的基因進行轉基因番木瓜研究，以期獲得具有良好適應性的轉基因品系。隨著RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，科學家認識到交叉保護現(xiàn)象主要是通過RNA介導的轉錄后基因沉默引起的，而不是由病毒的外殼蛋白誘導的。我國華南農(nóng)業(yè)大學的科研人員利用農(nóng)桿菌轉化法，將病毒株系Ys的復制酶基因轉入番木瓜，成功培育出轉基因番木瓜“華農(nóng)一號”?！叭A農(nóng)一號”于2006年獲得了生產(chǎn)應用安全證書，目前已在華南地區(qū)廣泛種植。該品種抗性廣，對華南地區(qū)流行的各種番木瓜環(huán)斑病毒毒株都具有很好的抗性，深受瓜農(nóng)喜愛，產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟、社會和環(huán)境效益。（二）限制酶簡介限制酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特定核昔酸序列的DNA水解酶。最初，限制酶是從微生物中分離純化得到的，而現(xiàn)在基本都采用基因重組的方法進行生產(chǎn)。20世紀60年代，阿爾伯（W.Arber）等人在研究λ噬菌體侵染大腸桿菌的機制時，發(fā)現(xiàn)來源于大腸桿菌K菌株的入噬菌體（簡稱λk）和來源于大腸桿菌B菌株的λ噬菌體（簡稱λa），可以高效感染它們各自的大腸桿菌宿主菌株，但是當用λk感染B菌株或用λg感染K菌株時，其感染效率大大下降，這說明λk受到了B菌株的限制，入g則受到了K菌株的限制，這一現(xiàn)象稱作限制。科學家還發(fā)現(xiàn)，當用入k感染B菌株時，即便感染效率很低，也仍然有極少數(shù)的λx感染成功，如果用B菌株繁殖出來的λg再次感染B菌株，這時λx可以像λB一樣高效感染B菌株，而不會出現(xiàn)上述限制現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱作修飾。宿主細胞的限制和修飾作用廣泛存在于細菌中。通過進一步研究，科學家弄清了細菌限制和修飾作用的分子機制。大腸桿菌K菌株和B菌株擁有不同的限制和修飾系統(tǒng)，它們受hsdR、hsdM和hsds基因的調控。hsdR編碼產(chǎn)生限制酶，它能識別雙鏈DNA分子上特定的核昔酸序列并將雙鏈DNA分子切斷；hsdM編碼產(chǎn)生DNA甲基化酶，它催化DNA分子特定位點上的堿基的甲基化反應；hsdS編碼的產(chǎn)物能協(xié)助限制酶和DNA甲基化酶識別作用位點。大腸桿菌細胞內的DNA甲基化酶封閉了其自身DNA上能被自身所產(chǎn)生，的限制酶識別的位點。λk和λg長期寄生在宿主細胞中，宿主細胞中的DNA甲基化酶也封閉了其DNA上能被宿主細胞所產(chǎn)生的限制酶識別的位點，所以大腸桿菌的限制酶不會降解自身的DNA以及長期在它體內生存的噬菌體的DNA。外來的DNA入侵時，宿主細胞中的限制酶會將其降解，但是這種降解作用并不完全，總有少數(shù)人侵的DNA能在宿主細胞中復制，并在復制過程中被宿主的DNA甲基化酶所修飾，這就是為什么B菌株繁殖出來的λk可以高效感染B菌株的原因。根據(jù)結構和功能的差異，限制酶可以分為三類：1型、II型、III型。Ⅰ型和II型限制酶的應用價值不大，I型限制酶廣泛用于重組DNA技術。1968年，科學家首次采用硫酸按沉淀、透析、DEAE-纖維素離子交換層析等技術，從大腸桿菌K菌株中分離、純化出了Ⅰ型限制酶。1970年，史密斯（H.O.Smith）等人將流感嗜血桿菌Rd菌株與同位素標記的沙門氏菌噬菌體P22的DNA一起解育，發(fā)現(xiàn)這些DNA無法通過氯化艷密度梯度離心回收，說明這些DNA被細菌中的酶降解了。接著，他們利用細菌細胞粗提物消化外源DNA，發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌的DNA溶液黏度沒有變化，說明粗提物中含有某種限制酶。（進一步，史密斯等人同樣利用硫酸按沉淀、透析、DEAE-纖維素離子交換層析等技術從流感嗜血桿菌中分離、純化出了I型限制酶HindII。他們還分析了用這種限制酶切割后的DNA的末端序列，指出這段序列是一段回文序列。自此以后，分子生物學界掀起了尋找限制酶的熱潮，至今已發(fā)現(xiàn)3800余種限制酶。（三）磷酸二酯鍵在核酸中一個核昔酸核糖上第3位的羥基與下一個核昔酸核糖上第5位的磷酸羥基脫水縮合就形成了3'，5'-磷酸二酯鍵，它是核酸中核背酸的連接方式。若干個核昔酸通過3'，5'-磷酸二酯鍵連接成的多核昔酸鏈為核酸。在核昔酸鏈的一端的一個核昔酸，其核糖上第5位連接的磷酸只有一個酯鍵，此核昔酸被稱為DNA鏈的5"磷酸末端或5'端；另一端的一個核昔酸上第3位的羥基是自由的，此核昔酸被稱為DNA鏈的3'羥基末端或3'端。鏈內的核昔酸第5位上的磷酸和第3位上的羥基均已參與二酯鍵的形成，故它被稱為核苷酸殘基。（四）天然質粒的改造在基因工程中，人們需要對天然質粒進行改造，以獲得理想、實用的載體，從而滿足各種實驗要求。1.基因工程中理想的載體一般至少應具備以下條件。（1）具有合適的限制酶切割位點，外源基因片段容易插入載體，插入后不影響載體進入受體細胞和在受體細胞中復制，并且載體能夠保持穩(wěn)定的復制狀態(tài)和遺傳特性。（2）容易進入受體細胞，且轉化效率越高越好。（3）能在受體細胞中復制繁殖，且具有較強的自主復制能力。（4）容易從宿主細胞中分離、純化出來。（5）有用于識別、篩選的選擇性標記，便于重組DNA分子的檢測。2.對天然質粒的改造主要包括以下幾個方面。（1）一般載體越小，轉化的效率越高；小的載體外源DNA片段的裝載量更大。因此，要刪除天然質粒不必要的DNA區(qū)域，盡量減小質粒的相對分子質量。（2）在質粒上引入含有多種限制酶切割位點的多克隆位點，以便外源基因的重組。一般還要刪除重復的限制酶切割位點，使環(huán)狀的質粒經(jīng)限制酶處理后只在一處斷裂，從而保證外源基因的準確插入。（3）加入易于識別的選擇性標記，如各種抗生素抗性基因，以便檢測重組質粒是否成功進人受體細胞。（4）為了保證實驗的安全性，杜絕重組質粒擴散，污染環(huán)境，要滅活某些質粒的編碼基因，如促進質粒在細菌間轉移的mob基因。為了提高質粒的拷貝數(shù)，還要滅活那些抑制質粒復制的基因。（5）在質粒中引入特定用途的輔助序列，以滿足更多的實驗要求。例如，引入Lacz基因用于藍白斑篩選；引入用于檢測和分離表達產(chǎn)物的標簽編碼序列，如多聚組氨酸標簽、由8個氨基酸組成的Flag-tag標簽等。（五）基因工程中載體的分類基因工程中使用的載體可以按照以下標準進行分類。1.按來源和性質分類基因工程中使用的載體按照來源和性質可以分為質粒載體、噬菌體載體、病毒載體、人造染色體載體等。質粒載體教材中已經(jīng)有介紹，在這里不再展開。（1）噬菌體載體噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱，噬菌體能夠在宿主菌內實現(xiàn)復制，部分噬菌體能引起宿主菌裂解。噬菌體中首先被改造成載體的是入噬菌體。野生型的入噬菌體具有過多的限制酶切割位點，因此在改造時要去掉一些限制酶切割位點，同時切除非必需的區(qū)段。與質粒載體相比，噬菌體載體主要有以下特點。第一，噬菌體的結構更為復雜，能夠攜帶更大的DNA片段，噬菌體可以裝載5~20kb的外源DNA，而質粒一般只能攜帶10kb以下的DNA片段。第二，噬菌體感染細菌的效率一般要比質粒轉化細菌的效率高很多，它常被用于構建DNA文庫或基因組文庫。第三，噬菌體的克隆操作比質粒的復雜。噬菌體和質粒作為載體各有利弊，因此人們構建了噬菌體一質粒雜合載體，該載體由噬菌體DNA的某個特征區(qū)域與質粒DNA重組而成。（2）病毒載體質粒與噬菌體都有嚴格的宿主選擇性，只能在相應的菌體中生存和繁殖，所以它們遠不能完成載體在基因工程中所承擔的全部使命。動物細胞沒有質粒，如果要向動物細胞導人外源基因，通常需要用到DNA病毒或RNA病毒。病毒具有高效入侵細胞的能力，能將自身的基因組轉移到細胞中，掠奪細胞的“生物合成機器”生產(chǎn)它自己的DNA、RNA和蛋白質，因此它是功能強大的基因轉移載體。動物病毒載體，如腺病毒載體、桿狀病毒載體等，是比較理想的真核基因工程載體。雖然對它們的研究和應用遠沒有質粒那樣成熟，但它們具有潛在的應用前景。（3）人造染色體載體對一些大型染色體組的序列分析往往需要克隆具有數(shù)十萬甚至上百萬個堿基對的DNA片段，為了滿足克隆大片段外源基因的需要，科研工作者構建了人造染色體載體，如酵母人工染色體克隆載體、細菌人工染色體克隆載體等。[5.9]2.按功能和用途分類基因工程中使用的載體按照功能和用途可以分為克隆載體、表達載體、穿梭載體等。克隆載體指可以攜帶外源基因進入宿主細胞，并能夠大量復制從而實現(xiàn)外源基因擴增的載體。常見的克隆質粒載體有pBR332質粒和pUC質粒。表達載體就是在克隆載體基本骨架的基礎上增加了基因表達調控元件，如啟動子、核糖體結合位點、終止子等，從而使得整合在它上面的外源基因能在受體細胞中高效表達。穿梭載體指含有兩個親緣關系不同的復制子，能在兩種不同的生物中復制的載體。例如，有些載體不僅具有細菌質粒的復制起點和選擇性標記，還具有真核生物的自主復制序列和選擇性標記，所以它們既能在