血清球蛋白的分離純化與鑒定

關(guān)于血清球蛋白的分離純化與鑒定一、目的和要求學(xué)習(xí)鹽析法分離血清蛋白的原理和技術(shù)掌握凝膠過濾層析法脫鹽的基本操作技術(shù)掌握用醋酸纖維膜電泳法分離血清蛋白的原理及方法第2頁,共27頁，2024年2月25日，星期天二、原理（一）鹽析1.概念和原理鹽析是指溶液中加入無機鹽類而使某種物質(zhì)溶解度降低而析出的過程。

蛋白質(zhì)在純水中溶解度較低，若稍加一些無機鹽則溶解度增加，這種現(xiàn)象稱為“鹽溶”(saltin)。而當鹽濃度繼續(xù)增加到某一濃度時，蛋白質(zhì)又變得不溶而自動析出，這種現(xiàn)象稱為“鹽析”(saltout)。

第3頁,共27頁，2024年2月25日，星期天“鹽析”破壞了蛋白質(zhì)作為親水膠體的兩個穩(wěn)定因素但當鹽濃度增加到一定濃度時，一方面大量的水同鹽分子結(jié)合，使得蛋白質(zhì)沒有足夠的水維持溶解狀態(tài)，破壞了維持蛋白質(zhì)親水膠的水化膜另一方面加入的鹽離子中和了蛋白質(zhì)分子相互排斥的電荷相互聚集沉淀出來表面電荷水化膜第4頁,共27頁，2024年2月25日，星期天2.常用中性鹽：鹽析可用硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等中性鹽，其中運用最廣的是硫酸銨。硫酸銨的優(yōu)點

1.在水中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，2.溶解度大，3.溶解度的溫度系數(shù)變化較小，4.硫酸銨價廉易得，分離效果好，5.性質(zhì)溫和，高濃度時也不會影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。第5頁,共27頁，2024年2月25日，星期天3.鹽濃度計算各種蛋白質(zhì)“鹽析”出來所需的鹽濃度各異，所需的最小鹽量稱做鹽析濃度。A，GAG↓半飽和(NH4)2SO4飽和(NH4)2SO4A↓血清中清蛋白和球蛋白的分離按體積：

12（50%）；

14（25%）第6頁,共27頁，2024年2月25日，星期天(1)飽和硫酸銨溶液法

將飽和硫酸銨溶液的飽和度定為100%或1按體積：

12（50%）；

14（25%）(2)固體硫酸銨法可采用直接加入固體硫酸銨的方法。硫酸銨飽和度的計算第7頁,共27頁，2024年2月25日，星期天離心力(F)等于被離心的物體質(zhì)量與向心加速度的乘積向心加速度=4π2V2r

（其中V為每秒的轉(zhuǎn)數(shù)，r為離心半徑，單位cm）

F=m

4π2V2r相對向心加速度=4π2V2rg多少個g（二）離心(centrifugation)----分離1.離心力第8頁,共27頁，2024年2月25日，星期天2.離心機分類根據(jù)離心機的轉(zhuǎn)數(shù)分類可以分為三類

①<5000rpm普通離心機②5,000-25,000rpm高速離心機③25,000-10,000rpm超速離心機因離心時與空氣摩擦產(chǎn)熱很多，所以高速離心機有制冷裝置超速離心機不但有制冷裝置，而且離心室密封真空第9頁,共27頁，2024年2月25日，星期天3.離心機的使用0.1g50g2000rpmr=12cm配平

在對稱位置重量一致Balancedloadingpatternsfora12-positoncentrifugerotor第10頁,共27頁，2024年2月25日，星期天三、操作2ml血清+2mlPBS逐滴加入飽和(NH4)2SO42ml2→6ml33%棄上清，2mlPBS+1ml飽和(NH4)2SO4

1→3ml33%棄上清，1mlPBS+0.5ml飽和(NH4)2SO4

0.5→1.5ml33%棄上清，洗滌0.5mlPBS溶解↓搖勻

↓

混勻靜置30min，離心3000rpm10min↓

↓

混勻靜置30min，離心3000rpm10min↓

混勻靜置30min，離心3000rpm10min第11頁,共27頁，2024年2月25日，星期天層析利用物質(zhì)在固定相（stationaryphase）與流動相（mobilephase）之間不同的分配比例，達到分離待測物質(zhì)的技術(shù)。

(三)層析(chromatography)---純化凝膠過濾層析法（gelfiltrationchromatography）離子交換層析法（ionexchangechromatography）親和層析法（affinitychromatography）第12頁,共27頁，2024年2月25日，星期天凝膠過濾層析法（gelfiltrationchromatography）第13頁,共27頁，2024年2月25日，星期天葡聚糖凝膠（Sephadex）第14頁,共27頁，2024年2月25日，星期天離子交換層析法（ionexchangechromatography）第15頁,共27頁，2024年2月25日，星期天親和層析法（affinitychromatography）第16頁,共27頁，2024年2月25日，星期天脫鹽常用透析法和凝膠過濾層析法前者的優(yōu)點是透析后樣品終體積較小，但所需時間較長，且鹽不易除盡凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時間也明顯縮短，但其凝膠過濾后樣品體積較大。本實驗中樣品體積較小，凝膠過濾后樣品體積不會太增加，所以選用凝膠過濾法。第17頁,共27頁，2024年2月25日，星期天透析(dialysis)第18頁,共27頁，2024年2月25日，星期天凝膠過濾層析法（gelfiltrationchromatography）第19頁,共27頁，2024年2月25日，星期天按流出的時間收集不同組分第20頁,共27頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果12345678910proteinNH4+11121314151617181920proteinNH4+-

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±++

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第21頁,共27頁，2024年2月25日，星期天(四)電泳(electrophoresis)---鑒定帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳血清蛋白包括多種蛋白質(zhì)，它們的等電點大都在pH7.0以下，清蛋白的等電點為4.6，球蛋白為5-7在PH高于它們等電點的緩沖液均帶負電荷，在電場中向正極移動由于各種蛋白質(zhì)所帶電荷的數(shù)量和分子的大小有差別，在電場中泳動的速度也不同第22頁,共27頁，2024年2月25日，星期天血清中清蛋白電荷數(shù)量較多，分子量小，泳動最快。γ球蛋白則相反，泳動最慢，適當?shù)臅r間電泳后，不同的蛋白泳動到不同的位置。Albuminα1α2βγ+-血清樣品電泳法可以將血清蛋白質(zhì)分成多條區(qū)帶

第23頁,共27頁，2024年2月25日，星期天原理

1.蛋白的分離2.純化3.鑒定

利用醋酸纖維薄膜為支持物可將血清蛋白分開，經(jīng)染色可顯示五條區(qū)帶，從正極端起，依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白。第24頁,共27頁，2024年2月25日，星期天操作方法一、儀器和薄膜的準備1．將醋酸纖維薄膜浸泡于TEB緩沖液中，一小時以上備用。2．在電泳槽內(nèi)加TEB緩沖液每槽100ml（視槽的大小而定）。放置好濾紙橋。第25