日本囊對(duì)蝦中抗菌肽分子基因克隆及功能分析

日本囊對(duì)蝦中抗菌肽分子基因克隆及功能分析在無(wú)脊椎動(dòng)物中,由于其缺少傳統(tǒng)意義上的適應(yīng)性免疫,先天免疫系統(tǒng)在宿主對(duì)抗病原體的反應(yīng)中發(fā)揮著非常重要的作用?？咕?antimicrobialpeptides,AMPs)在先天免疫防御中發(fā)揮著效應(yīng)分子的作用,可以直接殺死或清除病原微生物。在本論文中,我們以日本囊對(duì)蝦為材料,對(duì)抗菌肽家族(含WAP結(jié)構(gòu)域蛋白和抗脂多糖因子)中的成員進(jìn)行了研究,得到以下結(jié)果：1.日本囊對(duì)蝦含單一單一乳清酸性蛋白(WAP)結(jié)構(gòu)域的抗菌肽的功能研究甲殼動(dòng)物中含單一乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域(asinglewheyacidicproteindomain,SWD)的抗菌肽屬于Ⅲ型甲殼肽,具有蛋白酶抑制活性或抑菌活性。然而它在甲殼動(dòng)物體內(nèi)的功能尚未被闡述。在本論文中,我們?cè)谌毡灸覍?duì)蝦中擴(kuò)增得到一種SWD抗菌肽,稱為MjSWD。MjSWD的全長(zhǎng)為522bp,開(kāi)放閱讀框編碼一條含24個(gè)氨基酸信號(hào)肽的蛋白。組織分布結(jié)果顯示,MjSWD在血細(xì)胞、心、肝胰腺、鰓、胃和腸組織中均有表達(dá),qRT-PCR分析其表達(dá)模式表明,對(duì)蝦受到鰻弧菌、金黃色葡萄球菌和白斑病毒的刺激后MjSWD在鰓和胃中表達(dá)量上調(diào)。純化的重組蛋白MjSWD可以通過(guò)結(jié)合細(xì)菌表面的肽聚糖結(jié)合革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌,并且可以抑制絲氨酸蛋白酶活性,如枯草桿菌蛋白酶A、蛋白酶K,還可以抑制細(xì)菌分泌的蛋白酶活性。與重組蛋白孵育過(guò)的鰻弧菌在自然感染的情況下對(duì)日本對(duì)蝦的感染能力明顯低于對(duì)照組,說(shuō)明MjSWD在對(duì)蝦抗細(xì)菌免疫中發(fā)揮著重要的作用。2.日本囊對(duì)蝦一種新型抗脂多糖因子的功能研究抗脂多糖因子(ALF)是甲殼動(dòng)物中具有廣譜抗菌活性的效應(yīng)分子,在對(duì)蝦中已發(fā)現(xiàn)四類抗脂多糖因子(ALF-A—ALF-B)。我們?cè)谌毡灸覍?duì)蝦中得到一類新型抗脂多糖因子,命名為MjALF-E。E組中含有兩條新型抗脂多糖因子,MjALF-E1和MjALF-E2。組織分布分析表明MjALF-E1主要在血細(xì)胞、心臟和小腸中高表達(dá),而MjALF-E2主要表達(dá)在鰓、胃和小腸中,并且二者在受到細(xì)菌刺激后轉(zhuǎn)錄水平上都有所提高。重組表達(dá)的重組蛋白rMjALF-E2對(duì)細(xì)菌表面的多糖LPS和PGN表現(xiàn)出較弱的結(jié)合活性,人工合成的兩種抗脂多糖因子的LPS結(jié)合的結(jié)構(gòu)域多肽對(duì)細(xì)菌表面的多糖LPS和PGN有較強(qiáng)的結(jié)合活性。而且合成的多肽和重組表達(dá)的rMjALF-E2對(duì)革蘭氏陰性菌有抑制活性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,MjALF-E2可以幫助體內(nèi)弧菌清除。通過(guò)RNA干擾的方式敲降MjALF-EZ的表達(dá),然后感染鰻弧菌,相對(duì)于對(duì)照組對(duì)蝦的累計(jì)死亡率明顯升高。綜上所述,MjALF-E2在對(duì)蝦抵抗細(xì)菌侵染的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。3.日本囊對(duì)蝦中具有抗病毒的抗脂多糖因子(MjALF-D2)的功能研究抗脂多糖因子(ALF)的廣譜抗菌活性在很多甲殼動(dòng)物中都有報(bào)道,近幾年還發(fā)現(xiàn)其具有抗病毒活性,但具體的抗病毒機(jī)理還不清楚。在本研究中,我們構(gòu)建了日本囊對(duì)蝦的9種抗脂多糖因子的重組表達(dá)載體,進(jìn)行了重組表達(dá)與純化。將純化得到的重組蛋白與白斑綜合征病毒(WSSV)孵育注射到對(duì)蝦體內(nèi),分析對(duì)蝦體內(nèi)WSSV的復(fù)制,結(jié)果得到一種具有抗毒活性的抗脂多糖因子MjALF-D2。RT-PCR分析其在日本囊對(duì)蝦各組織中的表達(dá)情況,MjALF-D2在除肝胰腺外的各組織中均有所分布,在鰓和胃組織中表達(dá)量最高。白斑病毒刺激后不同時(shí)間段的表達(dá)模式分析結(jié)果表明,在受到病原刺激后MjALF-D2表達(dá)量明顯上調(diào)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：注射重組蛋白和白斑病毒的實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦體內(nèi)病毒的含量明顯低于對(duì)照組對(duì)蝦；相反的,通過(guò)注射雙鏈RNA將MjALF-D2干擾掉后,對(duì)蝦體內(nèi)的病毒復(fù)制率升高。因此,體內(nèi)感染白斑病毒的實(shí)驗(yàn)證明了MjALF-D2的抗毒活性。重組蛋白M