小麥春化相關(guān)基因的克隆及其功能研究

小麥春化相關(guān)基因的克隆及其功能研究春化階段是小麥生長發(fā)育進(jìn)程中一個(gè)及其關(guān)鍵的時(shí)期。本研究從不同春化發(fā)育特性小麥遼春10和京841春化響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組Illumina高通量測(cè)序結(jié)果中,篩選出2個(gè)強(qiáng)烈上調(diào)的ESTsCL13519、Unigene1312和2個(gè)下調(diào)ESTsUnigene4460、Unigene20。以春性小麥遼春10和冬性小麥京841為材料,系統(tǒng)分析了4個(gè)候選ESTs在轉(zhuǎn)錄水平的序列差異及春化處理過程中的表達(dá)特性,利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)進(jìn)行基因功能驗(yàn)證;構(gòu)建CL13519過表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組載體導(dǎo)入擬南芥中,分析轉(zhuǎn)基因材料的生長發(fā)育特性。主要研究結(jié)果如下:1、以春性品種遼春10號(hào)和冬性品種京841為材料,克隆并分析4個(gè)ESTs的序列差異。結(jié)果顯示:CL13519長1010bp,ORF長681bp,編碼226個(gè)氨基酸,與TaHOX1（GenBank:JQ915062.1）相似度87.49%;Unigene1312長度為479bp,ORF全長282bp,5′UTR169bp,3′UTR26bp,編碼93個(gè)氨基酸,與硬質(zhì)四倍體小麥脫水素（GenBank:X78432.1）一致性高達(dá)85%;Unigene4460長361bp,經(jīng)TAIR在線分析,可能與H3蛋白甲基化相關(guān);Unigene20長632bp,與中國春3B染色體上一段序列（GenBank:HG670306.1）相似度高達(dá)83.91%,與山羊草hypotheticalproteinF775₃2582序列（GenBank:KD510223.1）相似度達(dá)77.15%。2、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了4個(gè)ESTs在不同春化特性小麥中的表達(dá)特性,結(jié)果表明:CL13519、Unigene1312在遼春10號(hào)中表達(dá)量呈拋物線型表達(dá),第5周時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值;Unigene1312在京841中的表達(dá)量呈拋物線型表達(dá),第5周時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值;CL13519在京841中表達(dá)模式中有兩個(gè)峰值,最大值出現(xiàn)在春化處理第五周;Unigene4460在遼春10號(hào)中表達(dá)量呈波動(dòng)式下調(diào)表達(dá);Unigene4460在京841中第1周急劇升高后急劇下降之后一直下調(diào)表達(dá);Unigene20在遼春10號(hào)和京841中均呈波浪型表達(dá),在第5周時(shí)表達(dá)量最低。3、以遼春10號(hào)為試驗(yàn)材料,利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（VIGS）,成功構(gòu)建了小麥VIGS基因功能驗(yàn)證的技術(shù)體系,并對(duì)所挑選的4個(gè)ESTs進(jìn)行驗(yàn)證分析。結(jié)果顯示:BSMV的侵染對(duì)小麥植株幼穗的分化進(jìn)程產(chǎn)生了一定的影響。本試驗(yàn)中空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組之間小麥幼穗分化幾乎無差異,BSMV:CL13519、BSMV:Unigene1312、BSMV:Unigene20幼穗分化發(fā)育晚于對(duì)照,而BSMV:Unigene4460侵染卻加速了幼穗分化。4、以pCAMBIA3301為表達(dá)載體成功構(gòu)建CL13519過表達(dá)載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化,