幾種農(nóng)藥對(duì)中華蟾蜍的生態(tài)毒理效應(yīng)及分子毒性研究

幾種農(nóng)藥對(duì)中華蟾蜍的生態(tài)毒理效應(yīng)及分子毒性研究農(nóng)藥作為人類的生產(chǎn)物資,在一定時(shí)期內(nèi)無(wú)法替代。隨著人類健康和生態(tài)環(huán)境的惡化,農(nóng)藥產(chǎn)生的負(fù)面影響必然成為人類關(guān)注的問(wèn)題之一。我國(guó)是農(nóng)藥生產(chǎn)大國(guó),在創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價(jià)值的同時(shí),農(nóng)藥中毒事件層出不窮,農(nóng)藥殘留引起的貿(mào)易爭(zhēng)端懸而未決,生物種群的日漸衰退甚至瀕臨滅絕,尤其是兩棲動(dòng)物的滅絕速度非常之快,令人吃驚。隨著這些問(wèn)題的日益突出,國(guó)內(nèi)外專家對(duì)農(nóng)藥的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)十分關(guān)注,并提到政府的議事日程。生態(tài)毒理學(xué)研究是生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)重要的科學(xué)基礎(chǔ),其研究的基本方法是通過(guò)對(duì)代表性的生物個(gè)體或群體進(jìn)行研究。兩棲動(dòng)物在環(huán)境安全性評(píng)價(jià)中具有重要地位。從整個(gè)環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)看,兩棲類處于食物鏈中物質(zhì)和能量傳遞的重要地位;從環(huán)境生態(tài)監(jiān)測(cè)角度看,兩棲類對(duì)環(huán)境污染物非常敏感:從模式生物角度來(lái)看,國(guó)外選用了非洲爪蟾作為動(dòng)物模型進(jìn)行各種環(huán)境化學(xué)物質(zhì)篩選和評(píng)價(jià)。隨著對(duì)人類回歸大自然的重要性以及對(duì)人類與非人類生物之間相互依存關(guān)系重要性的深入了解,在環(huán)境毒理學(xué)的模式生物不可替代的情況下,也要進(jìn)行野外生物物種生態(tài)毒性效應(yīng)的研究。因此,本論文選用農(nóng)田目前大量使用的幾種殺蟲劑(毒死蜱、二嗪磷和氟蟲腈)和除草劑(乙草胺、丁草胺、百草枯、二氯喹啉酸和氯嘧磺隆),以國(guó)內(nèi)農(nóng)田和濕地環(huán)境生態(tài)中普遍存在的兩棲動(dòng)物——中華蟾蜍這種野生動(dòng)物為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)這些農(nóng)藥的一般毒性作用、致突變作用、生殖發(fā)育毒性作用研究,初步評(píng)價(jià)幾種農(nóng)藥對(duì)中華蟾蜍的毒性效應(yīng)。(1)一般毒性效應(yīng)評(píng)價(jià):通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)研究了幾種農(nóng)藥對(duì)中華蟾蜍的毒性強(qiáng)度,并且明確了毒物濃度與蟾蜍蝌蚪死亡率之間的劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明:對(duì)中華蟾蜍蝌蚪的毒性分別為毒死蜱和丁草胺屬于高毒農(nóng)藥;二嗪磷和乙草胺屬于中等毒性;二氯喹啉酸、百草枯和氯嘧磺隆屬于低毒。從以上幾種農(nóng)藥中選毒死蜱、乙草胺進(jìn)行亞慢性毒性實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示的0.1mg/l毒死蜱和乙草胺處理組的中華蟾蜍蝌蚪體長(zhǎng)的日增長(zhǎng)率與對(duì)照有顯著性差異(P＜0.01)。結(jié)果表明這兩種農(nóng)藥對(duì)蝌蚪有慢性毒性風(fēng)險(xiǎn)。(2)致突變效應(yīng)研究:運(yùn)用微核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)幾種農(nóng)藥對(duì)蝌蚪血細(xì)胞染色體損傷,結(jié)果顯示毒死蜱、二嗪磷、乙草胺、丁草胺和百草枯高濃度處理組血細(xì)胞微核率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01),氟蟲腈、氯嘧磺隆和二氯喹啉酸處理組血細(xì)胞微核率與對(duì)照差異不顯著,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;計(jì)算農(nóng)藥處理組的核異常率,并進(jìn)行線性回歸,得出毒死蜱、二嗪磷、乙草胺、丁草胺和百草枯的處理濃度與細(xì)胞核異常率呈線性相關(guān)性,說(shuō)明劑量-反應(yīng)關(guān)系。通過(guò)彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)幾種農(nóng)藥對(duì)蝌蚪血細(xì)胞DNA的損傷作用,結(jié)果顯示毒死蜱、二嗪磷、氟蟲腈、乙草胺、丁草胺和百草枯的處理濃度與彗星Oliver尾矩呈線性相關(guān),并且與對(duì)照差異顯著(P＜0.01);氯嘧磺隆和二氯喹啉酸均在較低濃度處理時(shí),與對(duì)照差異顯著。結(jié)果表明毒死蜱、二嗪磷、丁草胺、乙草胺和百草枯對(duì)中華蟾蜍蝌蚪具有遺傳毒性,氟蟲腈、二氯喹啉酸和氯嘧磺隆不引起染色體損傷,但對(duì)DNA損傷有更復(fù)雜的作用機(jī)理。(3)生殖發(fā)育毒性效應(yīng)研究:通過(guò)精子畸形實(shí)驗(yàn)研究了農(nóng)藥毒死蜱、二嗪磷、丁草胺、百草枯和乙草胺對(duì)雄性中華蟾蜍生殖毒性作用。結(jié)果顯示,毒死蜱、二嗪磷、丁草胺和百草枯各處理組均引起精子畸形,其中毒死蜱、二嗪磷和百草枯處理濃度與精子畸形率有劑量-相關(guān)性,說(shuō)明這精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。通過(guò)胚胎致畸實(shí)驗(yàn)研究幾種農(nóng)藥的胚胎發(fā)育毒性,結(jié)果顯示:農(nóng)藥毒死蜱、氟蟲腈、二嗪磷、丁草胺、二氯喹啉酸、氯嘧磺隆和乙草胺TI值分別為:0.64,1.30,1.33,0.39,0.45,0.33和0.55,均小于1.5。因此,對(duì)中華蟾蜍的胚胎發(fā)育可能不具有致畸影響。在上述研究的基礎(chǔ)上,論文繼續(xù)深入。以成年蟾蜍(雌雄分組)為研究對(duì)象,通過(guò)腹腔注射法,低劑量連續(xù)曝露10d,從細(xì)胞和分子水平上開展了農(nóng)藥對(duì)中華蟾蜍的分子致突變效應(yīng)、致癌作用和細(xì)胞凋亡研究。主要從以下幾個(gè)方面開展:(1)DNA鏈斷裂的檢測(cè):通過(guò)堿性單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)幾種低劑量農(nóng)藥影響蟾蜍血細(xì)胞和肝細(xì)胞DNA鏈斷裂情況。結(jié)果顯示,0.05mg/kg毒死蜱、二嗪磷和百草枯連續(xù)處理10d后,彗星實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出雄性蟾蜍血細(xì)胞和肝細(xì)胞彗星Oliver尾矩與對(duì)照組差異顯著(P＜0.01),并且肝細(xì)胞彗星Oliver尾矩顯著大于血細(xì)胞的;雌性蟾蜍血細(xì)胞和肝細(xì)胞彗星Oliver尾矩(除百草枯外),均與對(duì)照的彗星Oliver尾矩沒有顯著差異。0.01mg/kg丁草胺和乙草胺處理組的雄性和雌性蟾蜍血細(xì)胞彗星Oliver尾矩均顯著大于對(duì)照組(P＜0.01)。結(jié)果表明,低劑量的毒死蜱、二嗪磷、丁草胺、乙草胺和百草枯連續(xù)處理中華蟾蜍,對(duì)血細(xì)胞和肝細(xì)胞DNA鏈有斷裂作用。(2)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的檢測(cè):DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)可以作為生物體潛在突變的分子標(biāo)志物,并在一定程度上闡明致癌作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)通過(guò)加入蛋白酶K后過(guò)夜孵育,改良彗星實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)DPC,用加入蛋白酶K前后的處理組彗星尾矩的比值反映DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)作用強(qiáng)度。統(tǒng)計(jì)分析TE處理組和PK處理組的彗星尾矩,求出比值。結(jié)果顯示0.1mg/kg處理組PK/TE值顯著高于對(duì)照組(P＜0.01),大小依次為百草枯、毒死蜱、丁草胺和乙草胺。結(jié)果表明這幾種農(nóng)藥對(duì)蟾蜍(雄性)血細(xì)胞產(chǎn)生DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)作用。(3)DNA堿基突變的檢測(cè):RAPD-PCR對(duì)于檢測(cè)DNA堿基序列突變作用有較高的優(yōu)越性,通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化RAPD-PCR反應(yīng)條件,檢測(cè)中華蟾蜍肝細(xì)胞DNA多態(tài)性,篩選出兩個(gè)引物(S1,S8),并對(duì)反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物分析統(tǒng)計(jì),引物S1擴(kuò)增毒死蜱、二嗪磷和百草枯處理后的蟾蜍肝細(xì)胞DNA的產(chǎn)物與對(duì)照有差異,出現(xiàn)明顯的譜帶增加或消失現(xiàn)象;引物S8擴(kuò)增丁草胺、乙草胺和陽(yáng)性對(duì)照,出現(xiàn)明顯的譜帶增加或消失現(xiàn)象。說(shuō)明以上農(nóng)藥可能對(duì)DNA堿基序列突變有一定的貢獻(xiàn)。(4)DNA甲基化水平的檢測(cè):DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分,致癌物常常對(duì)DNA甲基化水平產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)幾種農(nóng)藥對(duì)蟾蜍肝細(xì)胞和生殖細(xì)胞DNA甲基化水平的影響。結(jié)果顯示0.1mg/kg的毒死蜱和百草枯處理組的肝細(xì)胞(雄)和精細(xì)胞DNA水平與對(duì)照相比顯著差異(P＜0.01);二嗪磷處理組的精細(xì)胞DNA甲基化水平與對(duì)照差異顯著(P＜0.01)。(5)細(xì)胞凋亡的研究:細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡,指有核細(xì)胞在一定條件下,通過(guò)啟動(dòng)其自身內(nèi)部機(jī)制,主要通過(guò)內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞自然死亡過(guò)程。DNA損傷是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的一個(gè)誘因。通過(guò)Giemsa-Wright染色法和彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)較高濃度處理的中華蟾蜍蝌蚪血細(xì)胞凋亡指數(shù),結(jié)果顯示毒死蜱、百草枯、丁草胺和乙草胺的濃度與血細(xì)胞凋亡指數(shù)呈一定的劑量關(guān)系效應(yīng),并且與對(duì)照差異顯著(P＜0.01),二嗪磷處理組與對(duì)照差異不顯著。通過(guò)DNA-Lander實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)低劑量農(nóng)藥對(duì)中華蟾蜍肝細(xì)胞的凋亡影響,瓊脂糖凝膠電泳圖片顯示,0.1mg/kg毒死蜱、百草枯、丁草胺和乙草胺處理組的肝細(xì)胞均在180-200bp產(chǎn)生小的DNA片段,結(jié)果表明這幾種農(nóng)藥低劑量連續(xù)曝露誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。綜上所述,通過(guò)研究幾種殺蟲劑和除草劑的生態(tài)毒理效應(yīng)研究及其評(píng)價(jià),得出毒死蜱、二嗪磷、丁草胺和百草枯具有生殖毒性和致突變效應(yīng),并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;乙草胺具有致突變效應(yīng),并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究從一定程度上突破傳統(tǒng)的思路,并通過(guò)細(xì)胞和分子水平研究了致突變效應(yīng)類