微生物中核黃素合成的生物技術(shù)策略

一、引言核黃素（riboflavin,RF），又稱維生素B2（圖1），是一種具有高熱穩(wěn)定性（熔點(diǎn)為280℃）的水溶性B族維生素，其在酸性或中性溶液中對(duì)熱穩(wěn)定，短時(shí)間內(nèi)加熱不會(huì)被破壞，然而在堿性溶液中加熱卻極易被破壞。同時(shí)，核黃素也一種光敏性物質(zhì)，暴露于短波輻射（<400nm）條件下會(huì)發(fā)生光降解。核黃素是人體必需的微量元素之一，具有廣泛的生理功能，已被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為評(píng)估人體生長、發(fā)育和營養(yǎng)狀況的六大指標(biāo)之一。一個(gè)健康成年人的核黃素日平均需求量為0.3~1.8mg，而當(dāng)其日攝入量低于0.2~0.3mg時(shí)，則會(huì)出現(xiàn)核黃素缺乏的癥狀。在某些特殊情況下，例如，重體力勞動(dòng)、精神緊張、懷孕及青少年生長期，人體對(duì)核黃素的需求會(huì)增加。目前，核黃素缺乏癥已引起了全球許多國家的關(guān)注。圖1.核黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。核黃素是維持細(xì)胞正常功能不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)。在被攝取后，核黃素在細(xì)胞內(nèi)通過黃素激酶和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）合成酶的作用，分別被轉(zhuǎn)化為黃素單核苷酸（FMN）和FAD。這兩種核黃素的主要生物活性衍生物隨后作為電子載體，以及部分催化氧化還原反應(yīng)的酶類（如琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素c還原酶、葡萄糖氧化酶、醛氧化酶和黃嘌呤氧化酶）的必需輔助因子，參與一系列對(duì)人體新陳代謝至關(guān)重要的氧化還原反應(yīng)。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，核黃素能夠影響鐵離子的吸收和代謝，補(bǔ)充核黃素可以提高鋅離子和鐵離子的吸收。鑒于這兩種微量金屬元素在細(xì)胞增殖中的關(guān)鍵作用，核黃素也將間接地對(duì)生長起到積極的作用。反之，核黃素缺乏則會(huì)降低鐵離子的吸收、儲(chǔ)存和利用，從而導(dǎo)致人體生長遲緩。此外，核黃素缺乏或轉(zhuǎn)運(yùn)障礙可能引發(fā)白內(nèi)障、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管異常，甚至癌癥。因此，保證有規(guī)律的核黃素日常飲食獲取對(duì)于核黃素缺乏相關(guān)疾病的預(yù)防是很有必要的。核黃素與大多數(shù)維生素一樣，無法在人體內(nèi)合成。因此，人體內(nèi)的核黃素主要獲取自日常飲食，也可能來源于人體腸道微生物菌群。核黃素以不同的含量天然存在于各種各樣的食品中。與天然植物源性食品相比，動(dòng)物源性食品是更好的核黃素來源，如內(nèi)臟、牛奶和雞蛋。此外，一些綠色蔬菜和豆類中也含有一定量的核黃素。雖然日常飲食中的核黃素易于吸收，但因其水溶性而無法在人體內(nèi)大量儲(chǔ)存，過量攝入的核黃素會(huì)隨尿液和糞便排出體外。二、核黃素的生產(chǎn)工藝2012年全球核黃素年產(chǎn)銷量達(dá)9000多噸，其中約1800t用于醫(yī)藥和飲料行業(yè)，約7200t用于動(dòng)物飼料生產(chǎn)。隨著功能性食品和動(dòng)物飼料工業(yè)的發(fā)展，核黃素的需求量也日益增加。目前，核黃素的生產(chǎn)工藝主要有三種，包括全化學(xué)合成法、化學(xué)半合成法和微生物發(fā)酵法。其中微生物發(fā)酵法可分為兩大類：傳統(tǒng)的產(chǎn)核黃素微生物發(fā)酵和基因工程微生物發(fā)酵。（一）全化學(xué)合成法核黃素的全化學(xué)合成以D-核糖或D-葡萄糖為起始原料，通過6~9步化學(xué)反應(yīng)合成核黃素，包括氧化、置換、轉(zhuǎn)位、酸化、內(nèi)酯化、還原、縮合、偶合和環(huán)化。顯而易見，核黃素全化學(xué)合成是一個(gè)既繁復(fù)又耗時(shí)的過程（圖2），而且生產(chǎn)成本高、環(huán)境污染嚴(yán)重。此外，通過該法制備的核黃素產(chǎn)品中通常含有難以消除且具有一定毒性的雜質(zhì)。因此，全化學(xué)合成法逐漸被微生物發(fā)酵法所取代。圖2.核黃素的全化學(xué)合成途徑。（二）化學(xué)半合成法核黃素的化學(xué)半合成工藝采用微生物發(fā)酵與全化學(xué)合成相結(jié)合的方式，首先利用微生物發(fā)酵將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-核糖，隨后以發(fā)酵生產(chǎn)的D-核糖作為主要原料進(jìn)行核黃素的化學(xué)合成。從D-葡萄糖到D-核糖的發(fā)酵生產(chǎn)能夠簡化核黃素的合成工藝流程，并降低生產(chǎn)成本，這也是全化學(xué)合成法與化學(xué)半合成法間的主要區(qū)別。然而，由于化學(xué)半合成法所用化學(xué)添加劑難以去除，導(dǎo)致其在最終產(chǎn)品中的殘留量過高，因此不適合核黃素的大規(guī)模生產(chǎn)。（三）微生物發(fā)酵法自20世紀(jì)中葉起，微生物發(fā)酵法便已被應(yīng)用于核黃素的商業(yè)生產(chǎn)，而最初使用的產(chǎn)核黃素微生物主要有三種，包括一種細(xì)菌[丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）]和兩種真菌[棉阿舒囊霉（Ashbyagossypii）和阿舒假囊酵母（Eremotheciumashbyii）]。然而，由于發(fā)酵周期長、產(chǎn)量低，早期的微生物發(fā)酵法無法與化學(xué)合成法相競爭，因此很難大規(guī)模商業(yè)化。之后，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，用于核黃素生產(chǎn)的基因工程菌被成功構(gòu)建，如枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）和產(chǎn)氨棒桿菌（Corynebacteriumammoniagenes）。這些細(xì)菌能夠有效地將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為核黃素，從而顯著縮短生產(chǎn)周期，提高核黃素產(chǎn)量。因此，基因工程菌的應(yīng)用最終促使微生物發(fā)酵生產(chǎn)核黃素的商業(yè)化變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)?？傮w而言，目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)核黃素具有生產(chǎn)周期短、原料簡單、產(chǎn)率高、生產(chǎn)成本遠(yuǎn)低于全化學(xué)合成法和化學(xué)半合成法等優(yōu)點(diǎn)。三、核黃素的微生物合成在真菌、酵母和真細(xì)菌等產(chǎn)核黃素微生物中，一分子核黃素的生物合成需要三分子磷酸鳥苷（GTP）和兩分子5-磷酸核酮糖。如圖3所示，作為核黃素生物合成的初始底物之一，GTP（1）在GTP環(huán)水解酶II（酶1）所催化的咪唑環(huán)開環(huán)水解反應(yīng)中，從核糖基側(cè)鏈處水解脫去無機(jī)焦磷酸基團(tuán)，生成2,5-二氨基-6-核糖氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸（DARPP,2）。DARPP（2）隨后經(jīng)還原和脫氨基兩個(gè)連續(xù)反應(yīng)被轉(zhuǎn)化為5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸（ArPP,5），但這兩個(gè)反應(yīng)的先后順序因微生物種類不同而異。在真菌中，DARPP（2）的核糖基側(cè)鏈?zhǔn)紫仍谶€原酶的催化作用下被還原為核糖醇基側(cè)鏈，產(chǎn)生的中間體2,5-二氨基-5-核糖醇氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸（DArPP,4）在脫氨酶的作用下進(jìn)一步脫去氨基，形成ArPP（5）。然而在真細(xì)菌中，DARPP（2）則首先在脫氨酶的作用下，脫氨基轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物5-氨基-6-核糖氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸（ARPP,3），后者繼而在還原酶的作用下，經(jīng)呋喃核糖基還原開環(huán)反應(yīng)生成ArPP（5）。由此可見，DARPP在細(xì)菌和真菌中的還原和脫氨基反應(yīng)順序是相反的。在隨后的反應(yīng)中，ArPP（5）在一種非特異性的磷酸酶的作用下進(jìn)一步脫去磷酸基團(tuán)，被轉(zhuǎn)化為5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮（ArP,6），但該磷酸酶至今尚未明確。近來研究發(fā)現(xiàn)，在枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和多形擬桿菌（Bacteroidesthetaiotaomicron）等菌株中，鹵代酸脫鹵酶（haloaciddehalogenase,HAD）超家族蛋白可以催化ArPP（5）的去磷酸化，與酶4的作用相符。另一方面，5-磷酸核酮糖（7）作為核黃素生物合成的另一初始底物，首先在磷酸丁酮合成酶（酶5）的催化作用下，經(jīng)分子骨架重排形成3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸（3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate,DHBP,8）。隨后，在二氧四氫喋啶合酶（或核黃素合酶β-亞基，酶6）的作用下，DHBP與Arp（6）發(fā)生縮合反應(yīng)，生成6,7-二甲基-8-核糖醇基-二氧四氫喋啶（6,7-dimethyl-8-ribityllumazine,DMRL,9）。作為核黃素合成的直接前體物質(zhì)，DMRL最終在核黃素合酶（或核黃素合酶α-亞基，酶7）的作用下，經(jīng)特殊的歧化反應(yīng)被轉(zhuǎn)化為核黃素（10）和ArPP（5）。其中，產(chǎn)物ArPP（5）可再次用于另一核黃素分子的生物合成。圖3.核黃素的生物合成途徑。化合物1是三磷酸鳥苷（GTP）；2是2,5-二氨基-6-核糖氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸（DARPP）；3是5-氨基-6-核糖氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸（ARPP）；4是2,5-二氨基-5-核糖醇氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸（DArPP）；5是5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸（ArPP）；6是5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮（ArP）；7是5-磷酸核酮糖；8是3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸鹽（DHBP）；9是6,7-二甲基-8-核糖醇基-二氧四氫喋啶（DMRL）；10是核黃素。酶1：GTP環(huán)水解酶II；酶2/酶3：雙功能核黃素特異性嘧啶脫氨酶/還原酶；酶4：非特異性磷酸酶；酶5：DHBP合成酶；酶6：二氧四氫喋啶合酶或核黃素合酶β-亞基；酶7：核黃素合酶或核黃素合酶α-亞基。核黃素的微生物發(fā)酵合成通常使用真菌和細(xì)菌。目前的研究主要集中于兩種類酵母真菌（阿舒假囊酵母和棉阿舒囊霉）以及三種細(xì)菌（枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和乳酸菌）的應(yīng)用。對(duì)于阿舒假囊酵母和棉阿舒囊霉這兩種真菌，可以通過化學(xué)誘變和基因工程的手段實(shí)現(xiàn)定向進(jìn)化，從而調(diào)節(jié)核黃素的生物合成，實(shí)現(xiàn)核黃素產(chǎn)量的提高。然而，改造后的真菌通常發(fā)酵周期較長、發(fā)酵液黏度高，且需要在含有多種成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這些不利因素將增加后期核黃素分離純化的難度，同時(shí)提高了生產(chǎn)成本。此外，培養(yǎng)基中還應(yīng)不斷補(bǔ)充外源物質(zhì)（不飽和脂肪酸），以提高真菌的生物合成能力。相比之下，使用細(xì)菌的優(yōu)勢更為明顯，例如，發(fā)酵周期短、培養(yǎng)基成分簡單，以及可用于細(xì)菌的基因工程技術(shù)已較為完善。（一）真菌

1.阿舒假囊酵母

阿舒假囊酵母（Eremotheciumashbyii,

E.ashbyii）是目前用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)核黃素的主要菌株之一，因此其發(fā)酵特性也得到了較為全面而詳細(xì)的研究。Kalingan和Krishnan證明了不同碳源和氮源及其初始濃度對(duì)E.ashbyii

NRRL1363核黃素產(chǎn)量的影響。在此基礎(chǔ)上，一系列針對(duì)核黃素工業(yè)生產(chǎn)工藝優(yōu)化的研究相繼開展。報(bào)道了pH值對(duì)阿舒假囊酵母的胞外核黃素產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，在pH值為4.5和5.5時(shí)其胞外核黃素產(chǎn)量較高，而在pH值為3.5和8.5時(shí)幾乎沒有核黃素合成。Pujari和Chandra通過紫外誘變的方式獲得了一株核黃素高產(chǎn)突變菌株

E.ashbyii

DT1，但該菌株產(chǎn)量低、遺傳特性不穩(wěn)定，限制了其核黃素產(chǎn)量的進(jìn)一步提升。根據(jù)微生物的代謝調(diào)控機(jī)制，使用具有核黃素及其代謝物類似物抗性的突變菌株，可以降低核黃素生物合成途徑中某些關(guān)鍵酶的反饋抑制，進(jìn)而可能提高核黃素的積累量。然而，阿舒假囊酵母不能在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長，同時(shí)也很難找到適合其生長的合成培養(yǎng)基。因此，找到適宜的合成培養(yǎng)基，將提高穩(wěn)定的核黃素高產(chǎn)阿舒假囊酵母突變菌株的篩選成功率，這些突變菌株的進(jìn)一步應(yīng)用將提高核黃素的產(chǎn)量。2.無名假絲酵母作為一種天然的核黃素高產(chǎn)菌株，無名假絲酵母（Candidafamata,C.famata,

C.flareri）曾被用于核黃素的工業(yè)生產(chǎn)。雖然近年來該酵母已不再被應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，但其在基因工程領(lǐng)域的研究仍在繼續(xù)且取得了不少進(jìn)展。這些研究進(jìn)展表明，無名假絲酵母具有改造為新型核黃素高產(chǎn)基因工程菌的潛力。以TEF1為啟動(dòng)子構(gòu)建了一個(gè)攜帶有漢遜德巴利酵母（Debaryomyceshansenii）FAD1基因（編碼FAD合成酶）和FMN1基因（編碼核黃素激酶）的質(zhì)粒pTFMN1-FAD1，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到FMN1基因過表達(dá)的重組無名假絲酵母T-OP13-76之中。在所獲得的重組菌株中，一株命名為C.famata

T-FD-FM27的菌株，在最佳條件下分批發(fā)酵40h后生成了451mg?L-1的黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。這是關(guān)于FAD高產(chǎn)酵母菌株構(gòu)建的首次報(bào)道。在另一項(xiàng)研究中，以非回復(fù)C.famata

AF-4菌株為出發(fā)菌種，構(gòu)建了共同過表達(dá)SEF1、RIB1和RIB7基因的高產(chǎn)核黃素菌株。利用7L的實(shí)驗(yàn)室生物反應(yīng)器進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，該菌株在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中的核黃素產(chǎn)量達(dá)到了16.4g?L-1，是目前已知的核黃素最高產(chǎn)菌株之一。此外，當(dāng)將修飾后的PRS3和ADE4基因（分別編碼PRPP合成酶和PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶，均來源于漢遜德巴利酵母）導(dǎo)入到上述構(gòu)建的菌株后，其核黃素產(chǎn)量增加了兩倍。3.棉阿舒囊霉絲狀半子囊菌棉阿舒囊霉最初是從染病的棉花植株（Gossypium

sp.）中分離出來的，繼而又被發(fā)現(xiàn)是一種天然的核黃素高產(chǎn)菌種。在營養(yǎng)應(yīng)激條件下，這種真菌的菌絲體會(huì)分化形成孢子囊，而孢子在孢子囊內(nèi)形成的同時(shí)，核黃素被合成，其作用可能是保護(hù)透明且對(duì)紫外線敏感的孢子。經(jīng)過數(shù)十年的菌種改良，1990年基于棉阿舒囊霉（Ashbyagossypii,

A.gossypii）的核黃素生物技術(shù)合成方法的建立，使核黃素的單位生產(chǎn)率達(dá)到了較高的水平，并取代了先前的核黃素多級(jí)化學(xué)反應(yīng)合成。棉阿舒囊霉具有天然的核黃素合成能力，其應(yīng)用于核黃素工業(yè)生產(chǎn)已有20多年的歷史。同時(shí)，棉阿舒囊霉也具有重要的科學(xué)價(jià)值，不僅在生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣闊的潛在應(yīng)用前景，而且被廣泛地用作真菌發(fā)育和進(jìn)化生物學(xué)研究的模式菌種。近年來，棉阿舒囊霉在工業(yè)應(yīng)用和基礎(chǔ)研究方面均取得了豐碩的成果，促進(jìn)了用于高端基因工程的分子和生物信息學(xué)工具的發(fā)展，充分發(fā)揮了它們的生物技術(shù)應(yīng)用潛力。除了核黃素生產(chǎn)之外，近年來對(duì)棉阿舒囊霉在其他生物技術(shù)應(yīng)用方面的研究也取得了重大進(jìn)展。盡管如此，基于棉阿舒囊霉的核黃素生產(chǎn)工藝優(yōu)化，以及核黃素高產(chǎn)棉阿舒囊霉菌株的開發(fā)，仍是眾多研究人員的主要目標(biāo)，且當(dāng)前的研究多集中于分子水平。利用13C同位素標(biāo)記技術(shù)對(duì)產(chǎn)核黃素真菌A.gossypii

B2的碳通量進(jìn)行了解析。該研究以植物油為原料，采用復(fù)雜的工業(yè)發(fā)酵工藝生產(chǎn)核黃素。根據(jù)13C標(biāo)記數(shù)據(jù)，甲酸和絲氨酸為一碳供體，可對(duì)核黃素的生物合成起到積極影響，而甘氨酸則為唯一的核黃素嘧啶環(huán)二碳供體。此外，核黃素合成后期內(nèi)源甲酸的積累可以克服初期細(xì)胞內(nèi)一碳代謝途徑存在的嚴(yán)重瓶頸問題，且少量、分批補(bǔ)充甲酸和絲氨酸可以增強(qiáng)兩者在細(xì)胞內(nèi)的可利用度，使核黃素產(chǎn)量增加45%。隨后，首次成功實(shí)現(xiàn)了A.gossypii

B2菌種在生長階段和核黃素生物合成階段的碳通量定量計(jì)算。結(jié)果表明，酵母提取物作為常用的工業(yè)培養(yǎng)基成分，是菌株生長過程中的主要碳源，對(duì)菌株的生長具有顯著影響。然而，菜籽油則為核黃素合成過程中的主要碳源，因此對(duì)核黃素生產(chǎn)的影響最大。這些結(jié)果突出了碳源對(duì)核黃素生產(chǎn)的重要性，需慎重選擇。該研究為A.gossypii

B2菌株在復(fù)雜的工業(yè)發(fā)酵條件下的物質(zhì)代謝帶來了一些全新的認(rèn)識(shí)，對(duì)進(jìn)一步的菌種改良和工藝優(yōu)化具有重要指導(dǎo)意義。利用13C同位素標(biāo)記技術(shù)對(duì)野生棉阿舒囊霉（ATCC10895）及其核黃素高產(chǎn)突變菌株（W122032）的代謝通量進(jìn)行了分析，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析了兩個(gè)菌種在中心碳代謝途徑上的差異，以期解析棉阿舒囊霉的核黃素過量合成途徑。代謝通量分析結(jié)果顯示，突變菌株W122032的磷酸戊糖途徑（pentosephosphatepathway,PPP）-磷酸戊糖合成的代謝通量比野生株高9%，其嘌呤合成途徑（purinesyntheticpathway,PSP）-核黃素合成的代謝通量（1.6%）比野生株（0.1%）高16倍。這些結(jié)果表明，棉阿舒囊霉突變菌株中由PPP和PSP代謝通量的變化所引起的GTP代謝通量的增加，是其核黃素產(chǎn)量提高的主要原因，這也同時(shí)說明增強(qiáng)與PPP和PSP相關(guān)基因的表達(dá)是提高核黃素產(chǎn)量的一種方案。以A.gossypii

ATCC10895為出發(fā)菌株，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一株尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株A.gossypii

Agura3，并研究了其嘧啶從頭生物合成途徑（denovopyrimidinebiosyntheticpathway）阻斷所帶來的影響。結(jié)果表明，該菌株在常規(guī)固體天然培養(yǎng)基上的核黃素產(chǎn)量得到了提高，且尿苷/尿嘧啶的外源添加會(huì)抑制核黃素的生成。此外，高濃度的尿嘧啶抑制了該菌株及其出發(fā)菌株（A.gossypii

ATCC10895）的生長，而過量的尿苷則加速了它們的生長。該研究首次通過實(shí)驗(yàn)探明了棉阿舒囊霉嘧啶生物合成途徑中相關(guān)基因的改變對(duì)其核黃素產(chǎn)量的影響。作為天然核黃素高產(chǎn)菌種，棉阿舒囊霉菌必須確保較高水平的鳥嘌呤核苷酸途徑（guaninenucleotidepathway）代謝通量，以提高核黃素限制性前體物質(zhì)GTP的生物可利用度。因此，該真菌核黃素產(chǎn)量的進(jìn)一步提高需要對(duì)其GTP生物合成途徑中關(guān)鍵酶的特性有充分的認(rèn)識(shí)。在嘌呤生物合成途徑中，肌苷酸（inosine-5'-monophosphate,IMP）是腺苷酸（AMP）和鳥苷酸（GMP）的共同前體物質(zhì)，其在肌苷酸脫氫酶（inosine-5'-monophosphatedehydrogenase,IMPDH）的催化作用下被氧化為黃苷酸（xanthosine-5'-monophosphate,XMP），該步反應(yīng)是一個(gè)限速反應(yīng)。經(jīng)過一系列連續(xù)反應(yīng)后，XMP最終被轉(zhuǎn)換成GTP。由此可見，IMPDH是嘌呤生物合成途徑的一個(gè)重要的代謝瓶頸。然而，從代謝工程技術(shù)角度來看，這種酶的基因改造可操作性高。對(duì)棉阿舒囊霉菌中的IMPDH進(jìn)行了詳細(xì)的功能分析和結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明，當(dāng)A.gossypii

ATCC10895菌株的IMPDH基因過表達(dá)時(shí)，鳥嘌呤生物合成途徑的代謝通量增加，最終使該菌株的核黃素產(chǎn)量提高了40%。這項(xiàng)研究極大促進(jìn)了旨在提高棉阿舒囊霉核黃素產(chǎn)量的代謝工程工具的開發(fā)。分析了每個(gè)rib基因?qū)γ薨⑹婺颐购它S素產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)rib基因的轉(zhuǎn)錄水平和底物GTP的生物可利用度較低時(shí)，棉阿舒囊霉的核黃素合成會(huì)受到阻礙；而當(dāng)rib基因（最多5個(gè)）共同過表達(dá)時(shí)，會(huì)顯著提高該菌的核黃素產(chǎn)量。研究還發(fā)現(xiàn)，編碼腺苷酸琥珀酸合成酶（adenylosuccinatesynthase）并調(diào)控嘌呤途徑的腺苷酸（adenosine-5'-monophosphate,AMP）分支第一步反應(yīng)的ADE12基因，其失活或低表達(dá)時(shí)對(duì)核黃素合成具有積極影響。此外，還利用代謝工程技術(shù)構(gòu)建了一株過表達(dá)所有rib基因并低表達(dá)ADE12基因的棉阿舒囊霉菌株A330，該菌株的核黃素產(chǎn)量高達(dá)523mg·L-1，是野生菌株（A.gossypiiATCC10895）的5.4倍。該研究為工業(yè)核黃素產(chǎn)量的增加提供了一種可控且可規(guī)模化的策略。利用差異誘變技術(shù)獲得了一株核黃素高產(chǎn)棉阿舒囊霉突變菌株（W122032）。使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，該菌株在3L發(fā)酵罐中的核黃素產(chǎn)量為13.7g·L-1，比野生菌株（A.gossypii

ATTC10895）的產(chǎn)量增加了9倍。蛋白質(zhì)組和DNA微陣列分析結(jié)果顯示，參與嘌呤和核黃素生物合成途徑的基因上調(diào)，與碳源同化、產(chǎn)能和糖酵解相關(guān)途徑的基因下調(diào)。這些結(jié)果表明，突變菌株核黃素產(chǎn)量的提升與碳代謝通量從β-氧化向核黃素生物合成途徑的轉(zhuǎn)移有關(guān)。（二）細(xì)菌核黃素在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中的生物合成已有較為詳細(xì)的研究，尤其是在枯草芽孢桿菌和大腸桿菌中。在產(chǎn)核黃素細(xì)菌中，核黃素的合成由編碼五個(gè)基因（ribGBAHT）的核黃素操縱子（rib操縱子）所控制（圖4）。然而，rib操縱子上前四個(gè)編碼核黃素合成酶的結(jié)構(gòu)基因的順序與核黃素生物合成途徑中的酶促反應(yīng)順序（圖3）不同。RibA是第三個(gè)rib基因，編碼一種具有GTP環(huán)水解酶II和3,4-二羥基磷酸丁酮合成酶活性的雙功能酶。該酶是一種限速酶，其GTP環(huán)水解酶II活性可催化核黃素合成的第一步酶促反應(yīng)。RibG是第一個(gè)rib基因，編碼另一種雙功能酶，其核黃素特異性脫氨酶/還原酶活性可依次催化第二和第三步酶促反應(yīng)。RibH是最后一個(gè)rib基因，編碼二氧四氫喋啶合成酶（或核黃素合成酶的β亞基），其催化倒數(shù)第二步酶促反應(yīng)。作為rib操縱子的第二個(gè)基因，ribB基因編碼核黃素合成酶的α亞基，催化最后一步酶促反應(yīng)。此外，rib操縱子還編碼一個(gè)功能尚未明確的基因ribT。該基因被注釋編碼了一個(gè)假定的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，且研究表明這個(gè)酶的失活雖不會(huì)導(dǎo)致核黃素營養(yǎng)缺陷現(xiàn)象，但會(huì)顯著降低核黃素的產(chǎn)量。最新的結(jié)構(gòu)研究表明，枯草芽孢桿菌的ribT基因所編碼的酶屬于GCN5（generalcontrolnonderepressible-5）相關(guān)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（GCN5-related

N-acetyltransferase,GNAT）超家族成員，該超家族的酶能夠催化多種底物的?；磻?yīng)，即將乙酰輔酶A的乙?；D(zhuǎn)移到底物上。圖4.細(xì)菌rib操縱子的結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)基因ribGBAH編碼代謝相關(guān)蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)基因ribT編碼轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白。細(xì)箭頭表示啟動(dòng)子P1、P2和P3的轉(zhuǎn)錄方向。此處，RFN指代RFNelement，即RFN元件。ribC、ribR和ribO是枯草芽孢桿菌rib操縱子上游存在的三個(gè)調(diào)控區(qū)域，被認(rèn)為是核黃素生物合成的假定抑制子，因?yàn)槊總€(gè)區(qū)域發(fā)生突變都會(huì)導(dǎo)致核黃素的過量合成。其中，ribC和ribR分別編碼一種雙功能黃素激酶/FAD合成酶和單功能黃素激酶，這兩種酶可將核黃素順序轉(zhuǎn)化為FMN和FAD。RibO是位于ribP1啟動(dòng)子和ribG基因之間的一個(gè)非編碼區(qū)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以折疊形成一個(gè)保守的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，稱為黃素單核苷酸核糖開關(guān)（FMNriboswitch）。黃素與FMN核糖開關(guān)的相互作用在rib操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。在解離狀態(tài)下，F(xiàn)MN因濃度過低而不足以與FMN核糖開關(guān)結(jié)合形成抗-反終止子結(jié)構(gòu)，從而形成反終止子，以確保后續(xù)基因序列的轉(zhuǎn)錄；然而，在抑制狀態(tài)下，F(xiàn)MN與FMN核糖開關(guān)結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄終止子從而使轉(zhuǎn)錄終止。此外，如圖4所示，rib操縱子還含有三個(gè)啟動(dòng)子，包括一個(gè)一級(jí)啟動(dòng)子P1（ribP1）和兩個(gè)二級(jí)啟動(dòng)子P2和P3（ribP2和ribP3）。ribP1啟動(dòng)子位于第一結(jié)構(gòu)基因ribG的上游，ribP2啟動(dòng)子位于ribB的編碼區(qū)內(nèi)，而ribP3啟動(dòng)子位于ribH和ribT兩個(gè)基因之間。四個(gè)rib基因（ribGBAH）的轉(zhuǎn)錄主要由ribP1和位于rib操縱子5'端的調(diào)控區(qū)控制，最后兩個(gè)基因ribA和ribH則由ribP2啟動(dòng)子和RFN調(diào)控區(qū)控制轉(zhuǎn)錄。1.丙酮丁醇梭菌丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum,

C.acetobutylicum）是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽性菌，一個(gè)多世紀(jì)以來被廣泛用于生物丁醇的發(fā)酵生產(chǎn)。這種細(xì)菌通常以6∶3∶1的平均質(zhì)量比合成丁醇、丙酮和乙醇。自20世紀(jì)40年代起，除了丁醇高產(chǎn)菌株角色之外，該細(xì)菌作為天然核黃素生產(chǎn)菌種的角色也被認(rèn)可，因?yàn)樵谄涠〈?丙酮-乙醇（butanol-acetone-ethanol,ABE）發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)了核黃素的存在。從經(jīng)濟(jì)角度來看，如果核黃素作為第二產(chǎn)物或高附加值副產(chǎn)物的工業(yè)產(chǎn)量能夠達(dá)到0.5~1.0g·L-1，ABE發(fā)酵工藝的經(jīng)濟(jì)價(jià)值則將顯著提高。然而，經(jīng)過幾十年的研究，丙酮丁醇梭菌ABE發(fā)酵過程中的核黃素產(chǎn)量仍提高不足。最近，研究發(fā)現(xiàn)，在以木糖作為碳源的細(xì)菌生長培養(yǎng)基中外源添加乙酸鈉（NaAc），對(duì)C.acetobutylicum

ATCC824菌株ABE發(fā)酵過程中的核黃素合成具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。在添加60mol·L-1

NaAc后，核黃素的生物合成率（ribA通量率）幾乎是對(duì)照組的10倍，而核黃素的最終濃度也從最初的無法檢測增加到0.2g·L-1（0.53mmol·L-1）。該研究為基于丙酮丁醇梭菌的生物丁醇和核黃素發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)提供了一種新的策略，該策略的實(shí)現(xiàn)將提高ABE發(fā)酵工藝的商業(yè)價(jià)值。2.大腸桿菌作為基礎(chǔ)生物學(xué)研究常用的工具菌株，革蘭氏陰性菌大腸桿菌（Escherichiacoli,

E.coli）的基因組已得到很好的表征，且多種適合其基因編輯的成熟的分子工具也已構(gòu)建。此外，大腸桿菌因其諸多優(yōu)勢，長期以來一直被用作各種物質(zhì)高效合成的常用宿主，如氨基酸、生物燃料以及散裝化學(xué)品。例如，大腸桿菌在最佳培養(yǎng)條件下的生長迅速，倍增時(shí)間僅為20min，且其在由廉價(jià)原料構(gòu)成的培養(yǎng)基中也很容易生長?；谶@些極具吸引力的優(yōu)勢，大腸桿菌也被認(rèn)為是生產(chǎn)核黃素的潛在高效宿主，然而野生型大腸桿菌在自然條件下無法積累核黃素。因此，一系列針對(duì)產(chǎn)核黃素大腸桿菌菌種構(gòu)建的研究相繼展開，并進(jìn)行了大量的代謝工程策略的探索工作。目前，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)室大腸桿菌菌株均源自于非致病性的K-12或B菌株。盡管這兩種菌株之間在細(xì)胞代謝和生理上存在許多差異，但比較基因組分析結(jié)果顯示，它們是非常相似且密切相關(guān)的。相比于K-12菌株，B菌株在基本培養(yǎng)基中的生長速度更快，重組蛋白的表達(dá)水平更高，且乙酸的產(chǎn)量更低。E.coli

BL21(DE3)是一種特殊的工程B菌株，在科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用最為廣泛。闡明K-12和B菌株在調(diào)節(jié)機(jī)制和代謝方面的差異，將有助于提高它們?cè)诖x工程中的利用率。首次證明了E.coli

BL21(DE3)在正常培養(yǎng)條件下可以積累核黃素。核黃素生物合成相關(guān)酶的序列分析發(fā)現(xiàn)，與K-12MG1655菌株相比，BL21(DE3)菌株在ribF基因的第115位氨基酸殘基上發(fā)生了單一點(diǎn)突變，這個(gè)His115Leu突變引起了ribF基因編碼的雙功能核黃素激酶/FMN腺苷酸轉(zhuǎn)移酶的活性不足，可能是導(dǎo)致核黃素在該菌株中積累的原因。然而，進(jìn)一步的定量PCR分析顯示，所有核黃素生物合成基因均上調(diào)，表明過量的核黃素積累也可能是由某個(gè)能上調(diào)所有核黃素合成基因的調(diào)控機(jī)制引起的，而且這個(gè)原因似乎更為合理。該研究認(rèn)為E.coli

BL21(DE3)或許也可應(yīng)用于核黃素的生產(chǎn)。已有研究表明，枯草芽孢桿菌嘌呤生物合成途徑中的一些關(guān)鍵基因的修飾可以增加核黃素前體物質(zhì)的供應(yīng)，從而促進(jìn)核黃素的生物合成。近年來，類似的研究工作也同樣在大腸桿菌中展開。首先以野生型E.coli

MG1655為出發(fā)菌種，構(gòu)建了一株產(chǎn)核黃素的菌株E.coli

RF01S，并隨后對(duì)該重組菌種的ribB基因和嘌呤途徑的5個(gè)關(guān)鍵基因（包括ndk、gmk、purA、purF和prs）分別進(jìn)行了修飾，最終得到了能夠同時(shí)過表達(dá)所有6個(gè)基因的菌株RF18S。該菌株在搖瓶發(fā)酵中的核黃素產(chǎn)量為387.6mg·L-1，核黃素轉(zhuǎn)化率為44.8mg·g-1葡萄糖。與RF01S相比，RF18S的核黃素產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高了72.2%和55.6%。此研究證明，利用合理的代謝工程技術(shù)同時(shí)對(duì)DHBP合成酶和GTP生物合成途徑進(jìn)行修飾，是顯著提高大腸桿菌核黃素產(chǎn)量的有效策略。利用代謝工程技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)攜帶有核黃素操縱子（由誘導(dǎo)型trc啟動(dòng)子調(diào)控）的質(zhì)粒p20C-EC10，并將其轉(zhuǎn)化入野生型E.coli

MG1655中，得到的重組菌株RF01S可積累229.1mg?L-1的核黃素。隨后，將RF01S菌株的pgi（編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶）、edd（編碼磷酸葡萄糖酸脫水酶）和eda（編碼多功能2-酮-3-脫氧葡萄糖酸-6-磷酸醛縮酶/2-酮-4-羥基戊二酸醛縮酶/草酰乙酸脫羧酶）基因逐步刪除，并在其acs基因（編碼乙酰輔酶a合成酶）的上游插入trc啟動(dòng)子，得到重組菌株RF05S，其核黃素產(chǎn)量可達(dá)585mg?L-1。最后，通過調(diào)節(jié)RF05S菌株中ribF基因（編碼一種雙功能核黃素激酶/FMN腺苷酸轉(zhuǎn)移酶）的表達(dá)，以減少核黃素向FMN的轉(zhuǎn)化，由此構(gòu)建的菌株RF05S-M40在37℃條件下于LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基中可產(chǎn)生1036mg?L-1的核黃素。優(yōu)化發(fā)酵條件后，RF05S-M40菌株在最佳條件下通過搖瓶發(fā)酵的核黃素產(chǎn)量達(dá)到了2703mg?L-1，比RF01S菌株的核黃素產(chǎn)量高了近12倍，核黃素轉(zhuǎn)化率為136mg?g-1葡萄糖。在搖瓶發(fā)酵情況下，E.coli

RF05S-M40的核黃素產(chǎn)量是所有已報(bào)道的產(chǎn)核黃素菌株中最高的。隨后，Lin等所在的實(shí)驗(yàn)室同樣以野生型E.coli

MG1655為出發(fā)菌種，通過pfka（編碼6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯酶I）、edd和eda基因敲除的方式提高磷酸戊糖（pentosephosphate,PP）途徑的碳代謝通量，由此成功構(gòu)建了另一種新型產(chǎn)核黃素大腸桿菌菌株LS02T。該菌株所攜帶的核黃素操縱子表達(dá)質(zhì)粒pLS01也是在該研究過程中新構(gòu)建的，其具有比上述研究中所構(gòu)建的質(zhì)粒p20C-EC10更好的穩(wěn)定性。通過搖瓶發(fā)酵，該菌株在含有10g?L-1葡萄糖的MSY培養(yǎng)基中可產(chǎn)核黃素667mg?L-1；而在補(bǔ)料分批發(fā)酵中，該菌株的核黃素產(chǎn)量達(dá)10.4g?L-1，轉(zhuǎn)化率為56.8mg?g-1葡萄糖。該研究首次報(bào)道了一種在補(bǔ)料分批發(fā)酵中核黃素產(chǎn)量超過10g?L-1的大腸桿菌工程菌株。上述兩項(xiàng)研究結(jié)果表明，大腸桿菌確實(shí)是一種潛在的、高效的核黃素生產(chǎn)菌種。3.枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis,

B.subtilis）是一種自然普遍存在的細(xì)菌，是所有革蘭氏陽性菌中研究最為清楚的菌種之一。它已被歐洲食品安全局（EuropeanFoodSafetyAuthority,EFSA）授予了安全資格認(rèn)定（qualifiedpresumptionofsafety,QPS），可用于生產(chǎn)動(dòng)物飼料和人類食品及補(bǔ)充劑，如維生素K2，是安全且穩(wěn)定的生產(chǎn)菌種。此外，基于核黃素生物合成相關(guān)酶在生化、生理和遺傳水平上的詳細(xì)研究，枯草芽孢桿菌也被成功改造為核黃素生產(chǎn)的細(xì)胞工廠。因此，枯草芽孢桿菌成為利用細(xì)菌進(jìn)行核黃素商業(yè)化生產(chǎn)的首選菌種，也是目前最重要的菌種。在過去的20年中，科研人員借助于代謝工程技術(shù)進(jìn)行了大量的枯草芽孢桿菌核黃素產(chǎn)量提高的研究。這些研究大多集中在前體物質(zhì)的供應(yīng)和關(guān)鍵酶的表達(dá)調(diào)控上，這兩點(diǎn)也被認(rèn)為是核黃素合成的主要限制因素。5-磷酸核酮糖（ribulose-5-phosphate,Ru5P）是核黃素的初始前體物質(zhì)，合成于磷酸戊糖途徑的氧化分支，其合成反應(yīng)由兩個(gè)連續(xù)的NADP+-依賴型蛋白酶所催化，即葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase,G6PD）和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-phosphogluconatedehydrogenase,6GPD）。然而，這兩種酶的活性會(huì)被Ru5P以及其他幾種細(xì)胞內(nèi)代謝物如NADPH和1,6-二磷酸果糖（fructose-1,6-biphosphate,FBP）所抑制。細(xì)胞內(nèi)代謝物的這種變構(gòu)抑制可導(dǎo)致核黃素合成所需的前體物質(zhì)供應(yīng)不足。Wang等克隆了谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum

ATCC13032的zwf（編碼G6PD）和gnd（編碼6GPD）基因，并利用定點(diǎn)突變成功消除了這兩個(gè)基因的反饋抑制，以期通過基因改造提高Ru5P的利用率。隨后，這兩個(gè)突變基被導(dǎo)入到B.subtilis

RH33菌株進(jìn)行單獨(dú)表達(dá)或共同表達(dá)，以量化它們的表達(dá)對(duì)核黃素合成的影響。結(jié)果表明，與親本菌株RH33相比，工程菌株中核黃素生物合成途徑中的代謝產(chǎn)物含量顯著增加，如Ru5P（增加46%）、DMRL、氨基咪唑以及胞內(nèi)核黃素。在搖瓶發(fā)酵中，工程菌株B.subtilis

SVZ（zwf基因單獨(dú)表達(dá)）、工程菌株B.subtilis

SVG（gnd基因單獨(dú)表達(dá)）和工程菌株B.subtilis

VGZ（zwf和gnd基因共同表達(dá)）的核黃素產(chǎn)量分別增加18%、22%和31%。在進(jìn)一步的補(bǔ)料分批發(fā)酵中，B.subtilis

VGZ的核黃素產(chǎn)量平均提高了39%。該研究證明，前體物質(zhì)供應(yīng)是枯草芽孢桿菌核黃素合成的主要限制因素，而利用代謝工程技術(shù)將碳代謝通量重定向至磷酸戊糖途徑是提高核黃素產(chǎn)量的有效策略。為了增加核黃素生物合成途徑的碳代謝通量水平，Shi等對(duì)產(chǎn)核黃素B.subtilis

BS77菌株的rib操縱子進(jìn)行了基因改造，包括ribA基因的過表達(dá)，原有啟動(dòng)子ribP1的取代（替換為來自于B.subtilis

168菌株的強(qiáng)啟動(dòng)子P43），以及RFN調(diào)控區(qū)ribO基因的敲除。其中，ribA基因過表達(dá)的菌株BS89具有最高的核黃素產(chǎn)量（506mg?L-1），是菌株BS77（210mg?L-1）的1.4倍。在此基礎(chǔ)上，一個(gè)連續(xù)優(yōu)化方案隨后開展，以解除BS89菌株rib操縱子嘌呤生物合成途徑的反饋調(diào)控，包括：①敲除嘌呤操縱子（pur

operon）的阻遏蛋白（即PurR，由purR基因編碼）基因及包含有鳥嘌呤感應(yīng)核糖開關(guān)的5'端非翻譯區(qū)（5'-untranslatedregion,5'-UTR），以消除反饋抑制；②通過定點(diǎn)突變消除PRPP轉(zhuǎn)氨酶（由purF基因編碼）的產(chǎn)物反饋抑制。這些基因改造成功實(shí)現(xiàn)了嘌呤生物合成途徑代謝通量的增加，從而使構(gòu)建的基因工程菌BS110（發(fā)生purF-VQW突變）在搖瓶發(fā)酵條件下，獲得最高的核黃素產(chǎn)量（827mg?L-1）。該研究表明，通過合理地解除嘌呤生物合成途徑的反饋調(diào)控，消除轉(zhuǎn)錄抑制和產(chǎn)物反饋抑制，是提高枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的一個(gè)可行策略。對(duì)于合理的、以目標(biāo)代謝物產(chǎn)量的提高為目的的代謝工程策略的制定來說，對(duì)中心碳代謝途徑的深入認(rèn)識(shí)是至關(guān)重要的。糖異生（gluconeogenesis,GNG）是指將非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖的生物過程，為中心碳代謝最重要的途徑之一。糖異生途徑的調(diào)節(jié)已成功地應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌碳代謝通量向磷酸戊糖（PP）途徑的重定向。此外，前人研究表明，糖異生途徑中關(guān)鍵酶反饋調(diào)控的解除，也是進(jìn)一步提高核黃素產(chǎn)量的一種可行策略。因此，以B.subtilis

RH33為出發(fā)菌株，通過過表達(dá)該菌株中三個(gè)關(guān)鍵的糖異生基因，包括gapB（編碼NADPH依賴型的3-磷酸甘油醛脫氫酶）、pckA（編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶）和fbp（編碼果糖-1,6-二磷酸酶）基因，系統(tǒng)研究了糖異生反饋調(diào)控的解除對(duì)核黃素產(chǎn)量提高的影響。結(jié)果表明，與RH33菌株相比，gapB和fbp基因共同過表達(dá)的基因工程菌株在搖瓶發(fā)酵中的核黃素產(chǎn)量顯著提高，達(dá)到了最高的4.89g?L-1，核黃素產(chǎn)量提高了21.9%，而其在補(bǔ)料分批發(fā)酵中的核黃素產(chǎn)量則提高了27.8%。這項(xiàng)研究說明，解除糖異生途徑的反饋調(diào)控是進(jìn)一步提高枯草芽孢桿菌核黃素產(chǎn)量的有效策略，且該策略也同樣適用于枯草芽孢桿菌中其他直接合成自PP途徑的代謝物，以及合成需要NADPH且以葡萄糖為碳源的物質(zhì)。研究了ribA和ribH基因修飾對(duì)枯草芽孢桿菌核黃素產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，相比于出發(fā)菌株LXZ-1，工程菌LXZ-2由于ribA基因的單獨(dú)過表達(dá)，核黃素產(chǎn)量提高了99%，搖瓶發(fā)酵60h的核黃素產(chǎn)量為0.47g?L-1。然而，該工程菌的生物量減少了30%，且由于5-氨基-6-(1-D-核糖醇氨基)尿嘧啶的積累出現(xiàn)了細(xì)胞自溶現(xiàn)象。與菌株LXZ-1和LXZ-2相比，基因ribA和ribH在工程菌LXZ-3中共同過表達(dá)，使其核黃素產(chǎn)量分別提高了280%和91%，并且未出現(xiàn)生物量下降和細(xì)胞自溶的現(xiàn)象。隨后，又將一個(gè)攜帶有完整rib操縱子的低拷貝數(shù)質(zhì)粒（pMX45）轉(zhuǎn)化到菌株LXZ-3中，得到菌株LXZ-3/pMX45，并將其用于不同碳源（包括葡萄糖、蔗糖、木糖以及不同比例的木糖和蔗糖混合物）對(duì)核黃素合成影響的研究。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用比例為1.5∶6.5的蔗糖和木糖混合物（總糖添加量為8%，w/V）作為碳源時(shí)，菌株LXZ-3/pMX45在搖瓶發(fā)酵60h后的核黃素產(chǎn)量最高（1.6g?L-1）,而在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵70h后的核黃素產(chǎn)量最高，為3.6g?L-1。這項(xiàng)研究表明，蔗糖和木糖的共代謝能夠增加核黃素生物合成前體物質(zhì)的供應(yīng)，從而提高核黃素的產(chǎn)量。諾瓦絲菌素（norseothricin,NTC）是一種能抑制蛋白質(zhì)生物合成的鏈絲菌素類抗生素，廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、酵母和植物細(xì)胞的抗性篩選。首先利用基因工程技術(shù)將sat基因（編碼鏈絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶）插入到表達(dá)質(zhì)粒pMA5中，構(gòu)建了一種新型的、具有NTC抗性的重組質(zhì)粒pMA5-sat，并隨后將zwf基因（編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，G6PD，核黃素生物合成關(guān)鍵酶之一）整合至該重組抗性質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pMA5-sat-zwf。最終，該重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到產(chǎn)核黃素菌株B.subtilis

RF1中，用以研究zwf基因過表達(dá)對(duì)核黃素合成的影響。結(jié)果表明，與原始菌株B.subtilis

RF1相比，重組菌株B.subtilis

RF1-pMA5-sat-zwf的G6DP活性提高了50倍，說明G6PD成功過表達(dá)。該重組菌株在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵的最終核黃素產(chǎn)量達(dá)到12.01g?L-1，比RF1菌株提高了30.3%。這些結(jié)果說明，新構(gòu)建的NTC抗性質(zhì)粒pMA5-sat在產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌的基因改造中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。此外，根據(jù)報(bào)道，來源于達(dá)窩鏈霉菌（Streptomycesdavawensis）的RibM在枯草芽孢桿菌中是一種非能量依賴的功能性核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要促進(jìn)核黃素的外排。將達(dá)窩鏈霉菌的ribM基因轉(zhuǎn)化至一株能夠高效生產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌中，獲得的RibM高表達(dá)重組菌株的核黃素產(chǎn)量提高，且提高的程度主要取決于誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG）的用量。這是基于核黃素外排的枯草芽孢桿菌核黃素產(chǎn)量優(yōu)化的首個(gè)成功案例，說明了增加核黃素的外排量也是提高枯草芽孢桿菌核黃素產(chǎn)量的有效策略之一。除了代謝工程方法之外，發(fā)酵條件的優(yōu)化也是一種提高枯草芽孢桿菌核黃素產(chǎn)量的可行方法。培養(yǎng)基的溶解氧是發(fā)酵過程中最重要的參數(shù)之一，與細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的合成密切相關(guān)。因此，溶解氧的濃度是枯草芽孢桿菌中核黃素合成的一個(gè)關(guān)鍵因素，其提高可以通過攪拌速度的改變輕易實(shí)現(xiàn)。Man等研究了補(bǔ)料分批發(fā)酵中攪拌速度對(duì)重組工程菌B.subtilis

RF1核黃素產(chǎn)量的影響。動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果顯示，發(fā)酵初期較低的攪拌速度（600r·min-1）可以促進(jìn)細(xì)胞的生長和核黃素的合成，而發(fā)酵后期則需要更高的攪拌速度（900r·min-1）。在此基礎(chǔ)上，Man等制定了一種二段控制策略，即在發(fā)酵的前26h將攪拌速度設(shè)置為600r·min-1，隨后調(diào)至900r·min-1直到發(fā)酵結(jié)束，以期在整個(gè)發(fā)酵過程中維持較高的細(xì)胞生長速度和核黃素產(chǎn)量。然而，二段控制策略中攪拌速度的突然切換，會(huì)在短時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞的生長和核黃素的合成造成負(fù)面影響。因此，Man等隨后建立了一個(gè)攪拌速度從600r·min-1逐漸增加到900r·min-1的新策略。在該策略下，發(fā)酵48h的核黃素產(chǎn)量達(dá)到最高的9.4g?L-1，轉(zhuǎn)化率為0.051g?g-1葡萄糖。與單一攪拌速度（600r·min-1）下的補(bǔ)料分批發(fā)酵的最好結(jié)果相比，核黃素的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高了20.5%和21.4%。以尋找合適的核黃素合成促進(jìn)劑為目的，Wan等以細(xì)菌密度（OD600）和核黃素產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究了7種添加劑的單獨(dú)添加對(duì)枯草芽孢桿菌在搖瓶發(fā)酵中的核黃素產(chǎn)量的影響，包括葡萄糖酸鈣、檸檬酸、檸檬酸鈉、氯化鈣、丙氨酸、蘋果酸和1,6-二磷酸果糖（FDP）。研究結(jié)果表明，葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈉和丙氨酸的添加對(duì)核黃素產(chǎn)量的提升效果最為顯著。因此，這三種添加劑被篩選用于進(jìn)一步的正交試驗(yàn)，以研究它們對(duì)核黃素合成的綜合影響。結(jié)果顯示，當(dāng)葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈉和丙氨酸的最佳濃度比例為7.5g?L-1、5g?L-1、1.5g?L-1時(shí)，核黃素產(chǎn)量達(dá)到最高的6.46g?L-1，比無添加劑時(shí)提高了大約40%。在最近的一項(xiàng)研究中，評(píng)價(jià)了13種不同礦物質(zhì)[CaCl2、CuCl2、FeCl3、FeSO4、AlCl3、Na3MoO4、Co(NO3)2、NaCl、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、ZnSO4和MnSO4]對(duì)野生型B.subtilis

ATCC6051菌株在搖瓶發(fā)酵中核黃素產(chǎn)量的影響，旨在開發(fā)合適的發(fā)酵培養(yǎng)基以提高核黃素產(chǎn)量。該研究首次采用Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)法篩選對(duì)核黃素合成有顯著影響的礦物質(zhì)。結(jié)果顯示，MgSO4、K2HPO4和FeSO4三種礦物質(zhì)的濃度對(duì)核黃素合成的影響最大。隨后，采用響應(yīng)面法（responsesurfacemethodology,RSM）進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，以確定所篩選出的五種培養(yǎng)基組分的最佳濃度（g?L-1），包括所有試驗(yàn)中均有使用的兩種碳源（果糖和酵母提取物），以及三種礦物質(zhì)（MgSO4、K2HPO4和FeSO4）。當(dāng)這5種組分的濃度分別為38.10g?L-1、4.37g?L-1、0.85g?L-1、2.27g?L-1和0.02g?L-1時(shí)，搖瓶發(fā)酵72h后的核黃素產(chǎn)量最高（11.73g?L-1）。4.乳酸菌乳酸菌（lacticacidbacteria,LAB）是一類不形成孢子的、不呼吸的、通常無運(yùn)動(dòng)性的革蘭氏陽性桿菌或球菌，乳酸是其糖類發(fā)酵的主要或唯一終產(chǎn)物。該菌種與人類生活密切相關(guān)，乳酸菌創(chuàng)造的酸性環(huán)境及其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)如細(xì)菌素，能夠抑制發(fā)酵食品中許多腐敗菌和致病菌的生長。從古代起，乳酸菌就被經(jīng)驗(yàn)性地用作發(fā)酵劑，用于加強(qiáng)食品的生物保鮮。如今，乳酸菌在世界范圍內(nèi)被合理地用作食品工業(yè)中的乳酸發(fā)酵劑，主要用于各種發(fā)酵乳制品（比如酸奶和奶酪）、發(fā)酵香腸以及泡菜（發(fā)酵蔬菜）的生產(chǎn)。雖然乳酸菌通常為多種維生素營養(yǎng)缺陷型菌株，但目前眾所周知，某些乳酸菌菌種能夠合成一些B族維生素，如葉酸（或維生素B9）、核黃素（或維生素B2）和鈷胺素（維生素B12）。乳酸菌的維生素合成能力在不同的菌株之間的差異相當(dāng)大，即具有菌種或菌株特異性，這通常與維生素生物合成遺傳信息的（部分或全部）缺失有關(guān)。例如，利用基于PCR技術(shù)的方法對(duì)60個(gè)乳桿菌中存在核黃素生物合成基因的菌株進(jìn)行了篩選，并在此基礎(chǔ)上利用微生物實(shí)驗(yàn)從中篩選具有核黃素合成能力的菌株。最終發(fā)現(xiàn)，只有14個(gè)菌株可以在無核黃素的商業(yè)培養(yǎng)基中生長?；谏鲜鼋Y(jié)果的進(jìn)一步綜合分析顯示，在不同種類的乳桿菌中，rib操縱子的存在均具有菌株特異性，而缺失的或不完整的乳酸菌rib操縱子通常與核黃素生產(chǎn)能力的喪失聯(lián)系在一起。根據(jù)先前的報(bào)道，植物乳桿菌Lactobacillusplantarum

WCFS1菌株攜帶有一個(gè)不完整的rib操縱子，其中全部的ribG基因和部分的ribB基因缺失，如預(yù)期一樣，該菌株在沒有核黃素的情況下無法生長。然而也有報(bào)道稱，植物乳桿菌的一些野生型菌株含有完整的rib操縱子并能產(chǎn)生核黃素，例如，從中國傳統(tǒng)醬菜汁中分離的L.plantarum

RYG-GYY-9049菌株，從泡菜中分離的L.plantarum

NCDO1752，以及從天然酸面團(tuán)中分離的L.plantarum

UNIFG1和UNIFG2?？偟膩碚f，乳酸菌rib操縱子的完整性對(duì)核黃素的合成至關(guān)重要。鑒于其對(duì)人類健康的重要性及缺乏癥的普遍性，核黃素成為由乳酸菌生產(chǎn)且被研究得最多的維生素之一。雖然核黃素通常存在于各種各樣的食物中，但由于飲食不均衡，核黃素缺乏癥在世界范圍內(nèi)的發(fā)生率仍然很高。在這樣的背景下，核黃素生物強(qiáng)化食品受到了人們的廣泛關(guān)注，因?yàn)樗鼈兇砹艘环N更天然、更適合消費(fèi)者、價(jià)格更低的化學(xué)合成核黃素的替代品，可以滿足消費(fèi)者對(duì)天然食品日益增長的需求。乳酸菌對(duì)食品工業(yè)發(fā)酵的適應(yīng)性及其核黃素生產(chǎn)能力，使它們成為生產(chǎn)食品級(jí)核黃素的理想候選菌種，為富含核黃素的新型功能食品的開發(fā)提供了新的機(jī)遇。因此，從各種食物源中篩選野生型產(chǎn)核黃素乳酸菌已引起眾多研究者的興趣。此前有報(bào)道稱，其從各種食品中分離得到了179株乳酸菌，然而僅42株菌株能夠在無核黃素的商業(yè)培養(yǎng)基中生長。在這些菌株所產(chǎn)的核黃素濃度（高效液相色譜法測定）基礎(chǔ)上，5株具有較高核黃素生產(chǎn)能力的菌株（胞外核黃素濃度為190~260ng?mL-1）最終被篩選出并應(yīng)用于豆奶發(fā)酵中，以評(píng)估它們?cè)谶@種食物基質(zhì)中的生長情況和核黃素合成能力。結(jié)果顯示，在37℃下發(fā)酵12h后，僅L.plantarum

CRL725菌株產(chǎn)生的核黃素濃度從最初的309ng?mL-1顯著增加到700ng?mL-1。在另一項(xiàng)從生羊乳和奶酪中篩選野生型產(chǎn)核黃素乳酸菌的研究中，共179株野生型乳酸菌被分離出，其中僅8株菌株能夠在無核黃素的培養(yǎng)基中生長，產(chǎn)生的核黃素濃度為173~532ng?mL-1。然而，在使用從食物或其他來源篩選得到的野生型乳酸菌菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，核黃素的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都相對(duì)較低，這是因?yàn)槟承┨囟ㄉ锘钚晕镔|(zhì)（如核黃素）的最大產(chǎn)率并非它們的自然優(yōu)化目標(biāo)。因此，提高這些菌株的核黃素生產(chǎn)能力以實(shí)現(xiàn)核黃素的高產(chǎn)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。為了達(dá)到這一目標(biāo)，通常采用的策略有兩種，即具有玫瑰黃色素抗性菌株的篩選以及基于代謝工程的重組菌株的構(gòu)建。玫瑰黃色素（roseoflavin）是FMN和核黃素的天然毒性類似物，可直接與FMN核糖開關(guān)結(jié)合，繼而抑制rib操縱子的轉(zhuǎn)錄。暴露于這種抗菌物質(zhì)之中可引起產(chǎn)核黃素乳酸菌的自發(fā)突變，從而產(chǎn)生核黃素高產(chǎn)菌株。該策略已成功應(yīng)用于枯草芽孢桿菌、乳酸乳球菌、植物乳桿菌、腸膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）和費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacteriumfreudenreichii）等食品級(jí)菌株的天然核黃素高產(chǎn)突變體的篩選中，并被證明是切實(shí)可行的。P.freudenreichii

NIZOB2336是一株篩選自野生型P.freudenreichii

NIZOB374菌株的自發(fā)抗玫瑰黃色素突變體，其核黃素產(chǎn)量高于原始菌株。當(dāng)這兩個(gè)菌株被用作附屬發(fā)酵劑（添加時(shí)間為酸奶發(fā)酵劑CampinaMUH306添加前的24h）進(jìn)行酸奶發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，以P.freudenreichii

NIZOB2336菌株為附屬發(fā)酵劑生產(chǎn)的酸奶中核黃素的最終含量為19.7μg?g-1，高于未添加附屬發(fā)酵劑的酸奶（12.9μg?g-1）以及添加了附屬發(fā)酵劑P.freudenreichii

NIZOB374的酸奶（10.5μg?g-1）。這項(xiàng)研究證實(shí)了P.freudenreichii

NIZOB2336菌株可用于富含核黃素的新型發(fā)酵乳產(chǎn)品的開發(fā)，而新產(chǎn)品則可能會(huì)帶來更多的健康效益。如上文中所提到的，篩選了一株具有較高核黃素生產(chǎn)能力的L.plantarum

CRL725菌株，用其發(fā)酵豆奶可使核黃素的濃度提高至初始濃度的兩倍。在該菌株的抗玫瑰黃色素突變體的進(jìn)一步篩選中發(fā)現(xiàn)，其中一株突變體（命名為CRL2130）可使發(fā)酵豆奶中核黃素的濃度增至初始濃度的6倍（從309ng?mL-1到1860ng?mL-1）。這一研究表明，具有玫瑰黃色素抗性的菌株能夠被用于營養(yǎng)價(jià)值更高、富含核黃素的新型大豆制品的開發(fā)。此外，從酸面團(tuán)中分離出一株野生型的產(chǎn)核黃素發(fā)酵乳桿菌（命名為Lactobacillusfermentum

PBCC11），并隨后對(duì)其抗玫瑰黃色素突變體進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，在所獲得的15株突變體中，7株突變體的核黃素產(chǎn)量超過了1mg?L-1。其中，核黃素產(chǎn)量最高（1.203mg·L-1）的一株突變體（命名