手性藥物的拆分-高效液相色譜(HPLC)

Dalgliesh

三點(diǎn)相互作用三點(diǎn)相互作用模型排斥作用通常為立體排斥，偶極-偶極排斥鍵合作用包括氫鍵，靜電，偶極-偶極吸引，電荷轉(zhuǎn)移和疏水作用根據(jù)固定相的不同,與對(duì)映體之間存在以下幾

種作用（1）過渡金屬離子的手性配位作用（2）π-π電荷轉(zhuǎn)印相互作用（3）包結(jié)絡(luò)合作用（4）氫鍵相互作用（5）立體契合作用1手性固定相第一類包括低聚糖，多糖及其衍生物，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸酯等a，純有機(jī)聚合物b，聚合物涂覆在無(wú)機(jī)載體上

c，接枝聚合物第二類是把光學(xué)活性分子通過離子鍵或共價(jià)鍵連接到硅膠載體表面，應(yīng)用的光學(xué)活性物質(zhì)有氨基酸衍生物，冠醚，金雞納生物堿，糖類，胺類，酒石酸衍生物，環(huán)糊精和聯(lián)二萘酚等1.1纖維素衍生物手性固定相1.纖維素-三（苯甲酸酯）（CTB）固定相由微晶纖維素和苯甲酰氯反應(yīng)：將得到的纖維素-（三苯甲酸酯）涂敷在氨丙基硅烷化硅膠上，便得到CTB固定相2.纖維素-三（苯基氨基甲酸酯）（CTPC）由微晶纖維素與異氰酸苯酯反應(yīng)，將得到的纖維素-三（苯基氨基甲酸酯）涂敷在氨基鍵合的硅膠上，便得到CTPC手性固定相:3.纖維素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（CDMPC）商品名為手性O(shè)D柱，具有極高的光學(xué)拆分能力，是廣泛使用的手性固定相之一。以微晶纖維素與3，5-二甲基苯基異氰酸酯反應(yīng)，將生成的纖維素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）以15%的量涂敷在氨丙基硅膠上，制得CDMPC-CSP：1.2淀粉類手性固定相最基本的有如下4種。淀粉手性固定相的制備方法與纖維素手性固定相相似，首先用淀粉與相應(yīng)的有機(jī)化合物，如苯甲酰氯，苯基異氰酸酯等反應(yīng)，得到淀粉衍生物，再將這種衍生物涂敷在氨丙基鍵合硅膠上，便可以得到淀粉類手性固定相。1.3環(huán)糊精手性固定相?-CD環(huán)狀構(gòu)型（俯視圖）環(huán)糊精包封藥物的立體結(jié)構(gòu)

環(huán)糊精分子中每個(gè)葡萄糖單元含有5個(gè)手性碳原子，如β-CD含有35個(gè)手性碳原子，同時(shí)與各種有機(jī)分子形成包容配合物，分子整體上具有光學(xué)活性和立體識(shí)別能力，是一種理想的手性選擇劑CD及衍生化CD化學(xué)鍵合手性固定相鍵合方式：1.胺鍵連接氨丙基硅膠鍵合相與環(huán)糊精反應(yīng)：2.酰胺鍵連接羧基化的氨丙基硅膠鍵合相與乙二胺環(huán)糊精反應(yīng)：3.碳氧鍵連接醚基鍵合相與環(huán)糊精反應(yīng)，：這種鍵合方式不含氮鍵，固定相的穩(wěn)定性好。1.4多模式環(huán)糊精固定相環(huán)糊精衍生化固定相既可以用于反相分離又可以用于正相分離，因而稱為多模式手性固定相。手性識(shí)別作用既有包容絡(luò)合，又有π-π電荷轉(zhuǎn)移，氫鍵和立體排斥相互作用等多種作用，應(yīng)用范圍廣泛。制備過程有四個(gè)步驟：（1）硅膠上鍵合N-（2-氨乙基-3-氨丙基）基團(tuán)（2）用對(duì)甲苯磺酰氯專一性的磺化環(huán)糊精的羥基（3）2-氨乙基-3-氨丙基鍵合硅膠與甲苯磺酰氯-β-環(huán)糊精反應(yīng)；通過N-（2-氨乙基-3-氨丙基）鍵合硅膠上的氨基與環(huán)糊精上的甲苯磺?；g發(fā)生反應(yīng)，把環(huán)糊精鏈接到硅膠上（4）環(huán)糊精上未反應(yīng)的甲苯磺?；c各種改性劑進(jìn)一步反應(yīng)，得到改性的環(huán)糊精鍵合固定相β-CD固定相改性過程1.5刷型手性固定相刷型手性固定相（CSP）是通過鏈烴基將手性有機(jī)小分子鏈接到硅膠載體上制得，又叫Pirkle型手性固定相。刷型手性固定相的合成主要有兩種途徑，即含端羧基或異氰酸酯基的手性基團(tuán)的化合物與氨基鍵合硅膠進(jìn)行縮合反應(yīng)，分別形成含酰胺型或脲型結(jié)構(gòu)的手性固定相：連接到硅膠表面的手性有機(jī)物在手性中心附近至少含有一種下列的功能團(tuán)：（1）酸性或堿性的芳香基團(tuán)，在手性識(shí)別過程中能發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移 相互作用；（2）能形成氫鍵的原子或基團(tuán)；（3）能發(fā)生偶極-偶極疊合相互作用的極性鍵或基團(tuán)；（4）能提供立體排斥，范德華相互作用構(gòu)型控制的非極性基團(tuán)。交互作用原理是對(duì)“刷型”手性固定相設(shè)計(jì)有重要指導(dǎo)意義的原則，即如果一個(gè)固定性的化合物A的對(duì)映體之一能對(duì)另一化合物B的對(duì)映體進(jìn)行拆分的話，那么反之亦然。刷型手性固定相有較好的色譜效能和對(duì)映體的識(shí)別能力，在高壓下穩(wěn)定性好，但是這類固定相一般只能在正相條件下使用，限制了它的應(yīng)用范圍。1.6蛋白質(zhì)型CSPs

這類CSPs是利用蛋白質(zhì)中的氨基或羧基將蛋白質(zhì)鍵合到經(jīng)修飾的硅膠上，修飾硅膠的官能團(tuán)可以是環(huán)氧基、氨基或醛基等。蛋白質(zhì)型CSPs主要用于生物醫(yī)學(xué)分析，表現(xiàn)出的對(duì)映體選擇性較強(qiáng)，但對(duì)pH值、有機(jī)調(diào)節(jié)劑的含量變化十分敏感。此類CSPs還有幾個(gè)顯著的缺點(diǎn)：負(fù)載量低，進(jìn)樣量大于lμg就可觀察到過載現(xiàn)象；對(duì)周圍環(huán)境過于敏感，0.1單位的pH值變化就可能導(dǎo)致容量因子20％的變化；穩(wěn)定性差，必須使用預(yù)柱提高壽命；結(jié)構(gòu)選擇性差，很容易受干擾。1.7其它類CSPs

1.配體交換類CSPs當(dāng)配體給出的電子能夠進(jìn)入過渡金屬空的d軌道，就能形成金屬配位絡(luò)合物。這種配位絡(luò)合物具有非常明確的幾何形狀，配體在空間只能占據(jù)某種給定的位置，配體交換手性色譜分離的機(jī)理就是基于此。它一般是將氨基酸固定在載體上，在流動(dòng)相中使用二價(jià)金屬陽(yáng)離子，當(dāng)樣品進(jìn)入時(shí)，在鍵合氨基酸、二價(jià)金屬陽(yáng)離子和被拆分的對(duì)映體之間形成三元絡(luò)合物，利用它們之間的熱力學(xué)穩(wěn)定性的不同進(jìn)行拆分。2.冠醚類CSPs手性識(shí)別主要基于固定相“空穴”的主－客體絡(luò)合和氫鍵作用。冠醚主體一般是取代聯(lián)萘衍生物，聯(lián)萘基團(tuán)是手性選擇體，能夠通過與芳香胺以氫鍵或π-π作用形成絡(luò)合物。含有較大取代基的冠醚有較好的手性識(shí)別能力。主要用于分離胺、氨基酸及其衍生物的對(duì)映體3.分子烙印聚合物類CSPs分子烙印聚合物的制備，常用的方法是烙印分子與具有某種官能團(tuán)的單體混合，單體在交聯(lián)劑的作用下共聚,產(chǎn)生高度交聯(lián)、剛性的共聚物。把烙印分子從聚合物中移去，在聚合物上留下與烙印分子在形狀和官能團(tuán)位置有互補(bǔ)性的識(shí)別點(diǎn)。4.合成高分子化合物類CSPs合成的旋光性高分子分為主鏈旋光和側(cè)鏈旋光兩種類型。旋光性高分子的合成方法一般有：（1）旋光性單體的聚合，或用不同的單體共聚；（2）將不對(duì)稱中心引入到非旋光性聚合物的側(cè)鏈上；（3）非手性單體在專一的手性引發(fā)劑作用下聚合。這類CSPs一般是將低分子量的聚合物涂敷在大孔硅膠上，手性僅僅來(lái)自于它的穩(wěn)定的單向螺旋結(jié)構(gòu)，而這種螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生于大體積酯基的立體排斥作用。其它類型的旋光性聚合物CSPs還包含旋光性聚酰胺、聚氨酯類、含有軸手性聯(lián)萘基的旋光性聚合物、(+)-聚-N-二苯甲基馬來(lái)酰亞胺等。2.手性拆分實(shí)例2.1高效液相色譜手性固定相法分離酸性化合物對(duì) 映體手性柱涂敷型CDMPC(20nm,300mm×4.0mm)Pirkl(S,S)WhelkO1(12mm,250mm×4.0mm)樣品西替立嗪萘普生托品酸布洛芬酮洛芬 2,2-二苯環(huán)丙烷羧酸各種待分析酸性手性樣品用乙醇配成合適濃 度,經(jīng)0.2mm微孔膜過濾.將醇和正己烷配 成所需比例,經(jīng)0.5mm微孔膜過濾并超聲。涂敷型CDMPC柱上的分離

改變流動(dòng)相正己烷中異丙醇的濃度(含0.1%三氟乙酸)對(duì)這6種酸性化合物進(jìn)行手性分離隨著異丙醇含量的減少,流動(dòng)相的極性減弱,對(duì)映體在CDMPC上的保留逐漸增強(qiáng),分離度逐漸增大;但分離因子基本不變,說明流動(dòng)相極性的改變不影響手性固定相識(shí)別的實(shí)質(zhì)。除托品酸和酮洛芬外,其它溶質(zhì)都獲得了基線分離。CDMPC上手性識(shí)別主要取決于溶質(zhì)的結(jié)構(gòu),包括大小、形狀和環(huán)的數(shù)目。西替立嗪在固定相上的保留最強(qiáng),獲得了最好的分離;而托品酸保留雖強(qiáng),卻只獲得部分分離,說明溶質(zhì)保留的強(qiáng)弱并不是手性識(shí)別的關(guān)鍵因素,可能溶質(zhì)在固定相手性空腔中的包容作用以及溶質(zhì)體積大小和立體結(jié)構(gòu)對(duì)其適應(yīng)性才是關(guān)鍵。(S,S)-Whelk-O1上的分離

改變正己烷中異丙醇的濃度(含0.1%乙酸),對(duì)上述6種酸性化合物進(jìn)行對(duì)映體分離異丙醇濃度變化對(duì)分離的影響趨勢(shì)與CDMPC的基本一致托品酸在該柱上也只獲得了部分分離,主要原因可能是托品酸與萘普生、酮洛芬、布洛芬的結(jié)構(gòu)有明顯差別,尤其是其手性碳上的取代基團(tuán)含有羥基布洛芬、酮洛芬與萘普生結(jié)構(gòu)相似,同屬于2-芳基丙酸,在該柱上分離都優(yōu)于CDMPC,只是酮洛芬的保留比布洛芬大得多,這可能是因?yàn)橥宸业姆蓟隙嗔艘粋€(gè)苯基和羰基,使得其與固定相之間的π-π作用、氫鍵作用增強(qiáng)決定溶質(zhì)保留和發(fā)生手性識(shí)別的關(guān)鍵是溶質(zhì)與固定相之間的吸引作用,主要是氫鍵作用和π-π作用。不同極性的醇類添加劑對(duì)手性分離的影響

乙醇、異丙醇和叔丁醇它們形成氫鍵的能力依次增強(qiáng),分子體積也依次增大。在流動(dòng)相中分別添加這3種醇對(duì)布洛芬和酮洛芬進(jìn)行手性分離異丙醇作添加劑時(shí),溶質(zhì)的保留最強(qiáng),分離最好,很可能是因?yàn)椴煌拇挤肿芋w積大小不同,對(duì)溶質(zhì)與CDMPC之間氫鍵作用的競(jìng)爭(zhēng)能力不同,對(duì)手性空腔的手性環(huán)境改變也不同,其中異丙醇使得溶質(zhì)與之最適應(yīng)對(duì)于布洛芬,叔丁醇作添加劑時(shí)比乙醇保留弱,分離度大,但對(duì)于酮洛芬,情況恰恰相反,說明醇的影響還與溶質(zhì)體積大小和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。Whelk-O1是Pirkle型小分子手性固定相,不存在手性空腔,與溶質(zhì)之間主要是通過吸引作用發(fā)生手性識(shí)別。乙醇作添加劑時(shí)溶質(zhì)保留弱,因?yàn)橐掖紭O性大,洗脫能力強(qiáng),但同時(shí)醇的立體效應(yīng)的變化也起一定的作用,故叔丁醇作添加劑時(shí)溶質(zhì)保留反而比異丙醇強(qiáng)從乙醇、異丙醇到叔丁醇,溶質(zhì)的分離因子和分離度都逐漸增大,叔丁醇作添加劑是達(dá)到最好分離。醇對(duì)溶質(zhì)保留和分離度的影響除了與溶質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān),還與醇本身形成氫鍵能力、極性、體積大小、空間立體結(jié)構(gòu)以及濃度等因素有關(guān)。流動(dòng)相中酸性添加劑對(duì)手性分離的影響

不加酸的流動(dòng)相未能洗脫出對(duì)映體,而酸性添加劑的羧基與固定相以及溶質(zhì)之間有兩種氫鍵作用,還可能會(huì)影響固定相和溶質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),使得它們之間發(fā)生有效的選擇性作用,從而增強(qiáng)了手性識(shí)別能

隨著三氟乙酸濃度增加,流動(dòng)相極性增大,酸與溶質(zhì)對(duì)固定相CDMPC的非手性和手性作用點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)(尤其是氫鍵作用)逐漸加強(qiáng),使得溶質(zhì)保留逐漸減弱;

若換成三氟乙酸,酮洛芬和布洛芬的保留增強(qiáng),對(duì)分離因子都沒有影響,但酮洛芬的分離變差,托品酸未獲得分離。,對(duì)于不同的酸性溶質(zhì)和固定相,要達(dá)到較好分離,所需的酸以及酸的濃度都不同。正電荷型纖維素衍生物手性固定相分離堿性化合物手性柱CSPI是由纖維素一2，3一二(3，5一二甲基苯基氨

基甲酸醋)一6一甲基丙烯酸酷)與帶有二級(jí)胺的硅膠

共聚合而成，因而該固定相表面帶有正電荷。

CSPZ不含氨基，是非電荷型手性固定相.樣品lPrenolol，metoprolol和propranolol，在相同的色譜流動(dòng)相條件下，堿性手性化合物在CSPI上均得到了更好的分離，即具有更小的保留值和更大的選擇性a值對(duì)于非電荷型手性固定相CSPZ，這幾種堿性化合物只有在堿性條件下才能獲得分離:而在中性流動(dòng)相條件下，保留非常強(qiáng)，很難被洗脫，色譜峰嚴(yán)重拖尾，同時(shí)還未能得到分離，堿性化合物上的氨基可以與固定相上殘留的硅輕基發(fā)生靜電相互吸引作用。在堿性條件下，堿性化合物上氨基的解離受到了抑制(或部分抑制)，使得其分子形態(tài)接近于電中性，與固定相之間的靜電吸引作用減弱，同時(shí)手性化合物可以較好地與非電荷型固定相進(jìn)行手性識(shí)別，從而達(dá)到了較好的分離;在中性流動(dòng)相條件下，堿性化合物與固定相之間的靜電吸引作用力較強(qiáng)，因而手性化合物保留增強(qiáng)，