昆蟲RNA病毒復制及昆蟲抗病毒天然免疫機制研究

昆蟲RNA病毒復制及昆蟲抗病毒天然免疫機制研究昆蟲RNA病毒是一類以昆蟲為宿主并在其種群中進行傳播的RNA病毒。這些病毒可以用于害蟲的防治或益蟲的保護工作。此外,由于這些病毒與許多脊椎動物病毒及植物病毒具有親緣性并在形態(tài)學和生物化學上有相當大的相似性,昆蟲RNA病毒正作為病毒學研究的重要實驗模型而活躍在病毒學研究領域。野田村病毒科是一類重要的RNA病毒,它可以分為兩個屬(α野田村病毒屬和p野田村病毒屬),其中α野田村病毒屬的病毒主要感染昆蟲而β野田村病毒屬的病毒主要感染魚類。我們的研究主要圍繞于武漢野田村病毒(Wuhannodavirus,WhNV)和弗洛克豪斯病毒(FlockHousevirus)展開,兩者均隸屬于α野田村病毒屬,WhNV是由本實驗室發(fā)現(xiàn)的中國首個野田村病毒,而FHV是野田村病毒中研究得最為清楚的病毒。野田村病毒的基因組由兩條單鏈正義RNA(RNA1和RNA2)組成,其中RNA1編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRP)ProtA,它是病毒復制復合體中的核心蛋白；RNA2則編碼病毒的衣殼蛋白前體Protα。在病毒復制的過程中還會產(chǎn)生亞基因組RNA3,RNA3編碼一種RNA干擾(RNAi)抑制子B2蛋白,能夠使病毒有效逃逸宿主的RNAi抗病毒免疫。雖然關于野田村病毒科病毒復制機制的研究已經(jīng)相當?shù)纳钊牒途唧w,但是仍有很多問題尚不清楚,例如野田村病毒是如何起始病毒RNA的復制的,ProtA是否具有其他的酶活性等。針對這些問題,我們運用本實驗室分離獲得的武漢野田村病毒(WuhanNodavirus,WhNV)為模型,系統(tǒng)的研究了WhNVRNA的復制起始機制及WhNVProtA的生化性質。我們發(fā)現(xiàn),WhNVProtA能夠在不依賴宿主或病毒其他蛋白的條件下以從頭合成(denovo)機制起始病毒RNA的復制。另外,WhNVProtA還具有末端轉移酶(terminalnucleotidyltransferase,TNTase)活性,這是首次在野田村病毒蛋白中發(fā)現(xiàn)該活性。通過進一步的研究,我們發(fā)現(xiàn)WhNVProtA的TNTase活性可以修復3’末端缺損的病毒RNA,這個機制可以被病毒運用從而確保病毒RNA復制的高效性和準確性。我們還研究了ProtA蛋白的RdRP活性和TNTase活性所需的RNA順式作用元件,發(fā)現(xiàn)這兩個活性所需的RNA順式作用元件具有一定的區(qū)別,這表明這兩種活性識別RNA的機制可能不同。此外我們還發(fā)現(xiàn)野田村病毒的ProtA具有解旋活性,能夠使5’突出的雙鏈RNA解旋,這種活性依賴于NTP和一些二價金屬離子。這些工作對于了解其他野田村病毒或單鏈正義RNA病毒的復制機制有重要的借鑒意義。針對病毒在昆蟲宿主中的復制,宿主能夠采用多種抗病毒機制進行防御。由于昆蟲缺乏適應性免疫,昆蟲的防御機制基本依賴于天然免疫。昆蟲的抗病毒天然免疫機制主要包括RNAi、Toll通路、Imd(immunedeficiency)通路、Jak-STAT通路和自噬等。先前的研究表明,在野田村病毒的復制過程中,能夠激發(fā)宿主的RNAi通路,并且該通路能顯著的抑制野田村病毒的復制。在我們和其他研究者的工作中都觀察到RNAi通路的核心蛋白Dcr-2的敲降對于野田村病毒復制的影響程度顯著高于另一核心蛋白AG02的影響,考慮到Dcr-2是一種RIG-I類似受體(RIG-I-likereceptor,RLR),這一不尋常的結果暗示Dcr-2可能以與RIG-I類似的方式參與到其他的信號通路中。我們運用另一種野田村病毒FlockHousevirus(FHV)和一種負鏈RNA蟲媒病毒水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus,VSV)進行研究,發(fā)現(xiàn)這兩種病毒均能激發(fā)Toll通路,并且Toll通路的激發(fā)顯著的受到Dcr-2的調(diào)控。進一步的研究表明,這種調(diào)控在革蘭氏陽性菌或賴氨酸型肽聚糖激發(fā)的情況下也非常顯著。我們進一步研究了Dcr-2對Toll通路調(diào)控的機制,發(fā)現(xiàn)Dcr-2能夠直接結合于TollmRNA的3’-UTR區(qū)域,并促進TollmRNA的多聚腺苷酸化