進(jìn)展-細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡項(xiàng)榮

shirlesmile@中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院左，正常胸腺細(xì)胞；右，凋亡胸腺細(xì)胞2002年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎獲得者悉尼·布雷諾爾、羅伯特·霍維茨和約翰·蘇爾斯頓器官發(fā)育的遺傳調(diào)控和細(xì)胞程序性死亡細(xì)胞凋亡的研究歷史

1.

凋亡概念的形成和形態(tài)學(xué)的研究(1972）

1972年Kerr等在英國癌癥雜志發(fā)表論文，首次提出細(xì)胞凋亡(apoptosis)的概念。宣告了對細(xì)胞凋亡真正探索的開始。2．DNA的降解和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的參與(1987）3.蛋白質(zhì)水解酶活化的研究(1995)4.細(xì)胞膜的變化(1997)5.線粒體的變化和分子生物學(xué)的研究(1998-)1）相關(guān)基因及調(diào)控

2）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

3）各種分子及其相互作用、相互關(guān)系

4）疾病機(jī)制的闡明，疾病新療法的探索及問世ApoptosisIMPACTFACTOR(2010):3.421Apoptosisisaninternationalpeer-reviewedjournaldevotedtotherapidpublicationofinnovativebasicandclinically-orientedinvestigationsintoprogrammedcelldeath.Itaimstostimulateresearchonthebasisofmechanismsofapoptosisandonitsroleinvarioushumandiseaseprocessesincluding:cancer,autoimmunedisease,viralinfection,AIDS,cardiovasculardisease,neurodegenerativedisorders,osteoporosisandageing.Theeditorsintendtoencouragethedevelopmentofclinicaltherapiesagainstapoptosis-relateddiseases.Apoptosis

Apo從…ptosis

飄零，落下細(xì)胞象秋天的樹葉一樣凋落的死亡方式

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)一、細(xì)胞凋亡的概念及其生物學(xué)意義二、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征三、細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理四、細(xì)胞凋亡與疾病一、細(xì)胞凋亡的概念及其生物學(xué)意義概念：生理或病理情況下，發(fā)生在機(jī)體內(nèi)的，一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程，即“主動性細(xì)胞自殺”過程。所以也常常被稱為細(xì)胞編程死亡（programmedcelldeath，PCD）。凋亡細(xì)胞將被吞噬細(xì)胞吞噬

生物學(xué)意義：細(xì)胞凋亡對于多細(xì)胞生物個體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用

二、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征（一）細(xì)胞凋亡與壞死（二）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征（三）細(xì)胞凋亡的生化特征（四）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子（五）細(xì)胞凋亡的檢測（一）細(xì)胞凋亡與壞死

細(xì)胞壞死(CellNecrosis)：細(xì)胞受到化學(xué)因素（如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有毒物質(zhì)）、物理因素（如熱、輻射）和生物因素（如病原體）等環(huán)境因素的傷害，引起細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。壞死細(xì)胞的形態(tài)改變主要是由酶性消化和蛋白變性的病理過程引起。參與此過程的酶，如來源于死亡細(xì)胞本身的溶酶體，則稱為細(xì)胞自溶（autolysis）；若來源于浸潤壞死組織內(nèi)白細(xì)胞溶酶體，則為異溶（heterolysis）。初期胞質(zhì)內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、崩解，結(jié)構(gòu)脂滴游離、空泡化，蛋白質(zhì)顆粒增多，核發(fā)生固縮或斷裂中期隨著胞質(zhì)內(nèi)蛋白變性、凝固或碎裂，以及嗜堿性核蛋白的降解，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)強(qiáng)嗜酸性，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全消失，末期細(xì)胞膜和細(xì)胞器破裂，DNA降解，細(xì)胞內(nèi)容物流出，引起周圍組織炎癥反應(yīng)壞死細(xì)胞的形態(tài)改變細(xì)胞壞死與凋亡的形態(tài)區(qū)別

細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死病理因素導(dǎo)致的細(xì)胞膜失去完整性的細(xì)胞死亡為壞死。生理或病理?xiàng)l件下基因控制的細(xì)胞膜保持完整的細(xì)胞死亡為凋亡。（二）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征

◆凋亡的起始：細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細(xì)胞間接觸的消失，但細(xì)胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布

◆凋亡小體的形成：核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞質(zhì)膜所包圍。細(xì)胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個的凋亡小體 ◆凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞吞噬并消化凋亡細(xì)胞早期細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)凋亡細(xì)胞中期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化凋亡細(xì)胞晚期細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體

細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：早期的細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；中期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；晚期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體（三）細(xì)胞凋亡的生化特征◆凋亡細(xì)胞組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶tTG

（tissueTransglutaminase）積累并達(dá) 到較高水平◆細(xì)胞凋亡的主要特征形成大小為180～200bp特征性的DNAladders

細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對照7．Marker

？（四）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子

◆物理性因子，包括射線（紫外線，

射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等◆化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，DNA

和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細(xì)胞生長因子，腫瘤壞死因子

（TNF

），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等1.細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測2.磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）3.線粒體膜勢能（

mt）的檢測4.DNA片斷化檢測

5.TUNEL法6.Caspase-3活性的檢測

7.WB檢測8.凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析

（五）細(xì)胞凋亡的檢測

1.細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測

光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜周圍。熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：Hoechst33342;

Hoechst33258;DAPI。電子顯微鏡觀察電鏡觀察凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)。細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。2.磷脂酰絲氨酸（PS）外翻分析（AnnexinV法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，在凋亡早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35

36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、R-PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。AnnexinV-FITCFluorescencePIFluorescence

TimecourseofapoptosisinTF-1cellsculturedinGM-CSF-freemediumApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC-AnnexinV+PI流式細(xì)胞分析DNA根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細(xì)胞儀檢出凋亡的亞二倍體細(xì)胞，同時又能觀察細(xì)胞的周期狀態(tài)。

3.線粒體膜勢能（

mt）的檢測

線粒體熒光染料：Rhodamine123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等對線粒體膜電位非常敏感，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。線粒體跨膜電位的存在使親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。

4.DNA片段化分析

細(xì)胞凋亡時主要生物化學(xué)特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成180

200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNAladder)。熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色。5.TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）6.Caspase-3活性的檢測熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵7.WB8.凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析

三、細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理

●線蟲(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1 1.Caspase家族與凋亡

2.Bcl-2家族、線粒體與細(xì)胞凋亡3.細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路1.Caspase家族與凋亡

◆Caspase家族·Caspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase◆Caspase活化caspase

超家族成員及其相應(yīng)底物Caspase活化

Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點(diǎn)裂解活化或自身活化2.Bcl-2家族、線粒體與細(xì)胞凋亡◆Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細(xì)胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域；Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個保守的Bcl-2同源區(qū)，即BH1，BH2和BH3 ◆Bcl-2、線粒體與細(xì)胞凋亡 ◆哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的Apaf2即是CytC◆當(dāng)Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另一方面使Bid裂解成2個片段，其中含BH3結(jié)構(gòu)域的C-端片段被運(yùn)送到線粒體，與Bcl-2/Bax的BH3結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放。CytC與胞質(zhì)中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor)結(jié)合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起細(xì)胞凋亡BCL-2家族成員3.細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號分子(Fas,TNF等)后，凋亡細(xì)胞表面信號分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptorprotein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部位，Procaspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡·下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNALadder;

裂解參與細(xì)胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落，便于細(xì)胞吞噬；導(dǎo)致膜脂等重排，便于吞噬細(xì)胞識別并吞噬。三條細(xì)胞凋亡信號通路

PathwayofApoptosis死亡受體信號途徑(death-inducingsignalingcomplex)

TNFR1/TNFα、DR4/TRAIL、DR5/TRAIL

DeathReceptor-mediatedPathway線粒體凋亡信號途徑

MitochondrialPathway內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號途徑EndoplasmicReticulumialPathway凋亡信號的網(wǎng)絡(luò)式轉(zhuǎn)導(dǎo)(一)死亡受體通路和線粒體通路的交叉

(ExchangebetweenDeathReceptor-mediatedPathwayandMitochondrialPathway)凋亡信號的網(wǎng)絡(luò)式轉(zhuǎn)導(dǎo)(二)死亡受體通路與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的“相互對話”Cross-talkbetweenDeathReceptor-mediatedPathwayandERpathway線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間凋亡信號的持續(xù)放大凋亡信號的網(wǎng)絡(luò)式轉(zhuǎn)導(dǎo)(三)Cross-talkbetweenMitochondrialPathwayandERPathway過表達(dá)RTN3介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的三條基本信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)特點(diǎn)①多樣性：不同種類的細(xì)胞系統(tǒng)不同②偶聯(lián)性：與增殖分化的信號系統(tǒng)交叉偶聯(lián)③同一性：多因素，共用同一系統(tǒng)觸發(fā)④多途性：同一誘導(dǎo)因素啟動多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑氧化損傷鈣穩(wěn)態(tài)失衡線粒體損傷惡性網(wǎng)絡(luò)假說(deleteriousnetworkhypothesis)

細(xì)胞凋亡Δ

Ψm↓

AIF，ApafPTPopen細(xì)胞凋亡與程序性細(xì)胞死亡（ApoptosisandProgrammedCellDeath）PCD是功能性概念，表示基因調(diào)控細(xì)胞死亡這一功能；而Apoptosis為形態(tài)學(xué)概念，是對一系列凋亡特征性、形態(tài)、生化變化的概括。PCD主要由Apoptosis引起，但還有其它的多種機(jī)制；同樣，Apoptosis既有程序性部分，又有非程序性部分存在。PCD僅存在于發(fā)育細(xì)胞中，而Apoptosis既可發(fā)生于發(fā)育中的細(xì)胞，也可發(fā)生于成體細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞等。

一種新型的細(xì)胞死亡機(jī)制：副細(xì)胞凋亡（Paraptosis）

形態(tài)上，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生Paraptosis時，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞膜完整，電子顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量由線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹形成的胞漿空泡。Paraptosis在生化機(jī)理方面與凋亡不同，它是TUNEL陰性的；Caspase抑制劑和Bcl-XL超表達(dá)不能阻斷它；它可被酶活性缺失的Caspase-9突變體所誘導(dǎo)，并且是Apaf-1非依賴的；絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）、胰島素樣生長因子Ⅰ受體和TNF受體家族成員TAJ/TROY可誘發(fā)它的發(fā)生；而AIP1/Alix作為一種能和細(xì)胞中的鈣結(jié)合死亡相關(guān)蛋白ALG-2相互作用的蛋白，抑制它的發(fā)生。一種新的癌細(xì)胞死亡：oncosis

脹亡的形態(tài)學(xué)特征是細(xì)胞腫脹，體積增大，胞漿空泡化，腫脹波及細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，胞膜起泡，細(xì)胞膜完整性破壞。oncosisapoptosis胞漿腫脹胞漿萎縮核溶解性死亡核固縮膜泡中無亞細(xì)胞器膜泡中常有亞細(xì)胞器脹亡細(xì)胞周圍由于胞內(nèi)容物的外溢而引起炎癥反應(yīng)凋亡細(xì)胞周圍多無炎癥反應(yīng)兩種死亡方式并存，且在一定條件下可轉(zhuǎn)換四、細(xì)胞凋亡與疾?、寮?xì)胞凋亡不足1．腫瘤Bcl-2表達(dá)↑

P53突變或缺失2、自身免疫疾病

——胸腺對T細(xì)胞正負(fù)選擇障礙正選擇：與非已抗原-MHC抗原結(jié)合的TCR的單陽性細(xì)胞保留存活，進(jìn)入外周T細(xì)胞庫負(fù)選擇：與自身抗原-MHC抗原結(jié)合的TCR的雙陽性細(xì)胞被凋亡清除㈡細(xì)胞凋亡過度1．心血管疾?。海?）心肌缺血和心臟缺血再灌注損傷（IRI）：壞死+凋亡心肌缺血和IRI凋亡特點(diǎn)①缺血早期多②梗死灶周邊多③輕度缺血多④IRI比單純?nèi)毖啖萋暂p度缺血多凋亡機(jī)制①氧化應(yīng)激：SOD可減輕②受體Fas上調(diào)：Fasl反應(yīng)③P53激活:卡點(diǎn)作用（2）心力衰竭：心肌肥大的同時心肌數(shù)量減少（凋亡）凋亡指數(shù)：由對照0.2~0.4%→35%2．神經(jīng)元退行性疾病Alzheimerdisease,AD——神經(jīng)元喪失；海馬及基底核的膽堿能神經(jīng)元喪失達(dá)30%~50%，累及大腦皮層老年性癡呆與細(xì)胞凋亡老年性癡呆神經(jīng)病理學(xué)和神經(jīng)生化改變神經(jīng)元細(xì)胞減少神經(jīng)元纖維纏結(jié)神經(jīng)炎癥腦內(nèi)免疫炎癥細(xì)胞凋亡IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、TNFICE白介素-1β轉(zhuǎn)換酶基因AD機(jī)制：致病因素（如氧自由基）作用于神經(jīng)元，Ca2+內(nèi)流↑，激活有關(guān)基因，促使神經(jīng)元內(nèi)β-淀粉樣蛋白含量↑，從而導(dǎo)致凋亡3．病毒感染

HIV引起AIDS：CD4+細(xì)胞被選擇性破壞CD4+淋巴細(xì)胞凋