異種克隆牦牛-羚牛及相關(guān)機(jī)理的研究

異種克隆牦牛，羚牛及相關(guān)機(jī)理的研究在保護(hù)瀕危動物和進(jìn)行核質(zhì)互作分析方面，異種克隆技術(shù)是非常有效的方法。本研究利用牛卵母細(xì)胞作為受體，通過顯微操作與牦?；蛄缗ｓw細(xì)胞構(gòu)建異種重構(gòu)胚，將牦牛的異種重構(gòu)胚移植到代孕牛中，獲得了妊娠，并有望于2004年6—7月間出生。此外本研究還對異種克隆技術(shù)和異種體細(xì)胞核重編程進(jìn)行了初步探討。1供體細(xì)胞的培養(yǎng)：本實(shí)驗(yàn)從北京動物園、青?；ブh、秦皇島野生動物園分別采集了羚牛和牦牛組織樣，建立了21個細(xì)胞系。細(xì)胞系種類包括耳成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮、顆粒細(xì)胞系三種。實(shí)驗(yàn)證明樣品采用0℃保存48小時，對細(xì)胞系的建立無負(fù)面影響。這為野外收集珍稀動物組織，建立細(xì)胞系提供了切實(shí)可行的方法。2體細(xì)胞克隆技術(shù)基礎(chǔ)平臺的建立：首先，在去核方法上，本實(shí)驗(yàn)比較了H33342染色法，盲吸法和高滲法并結(jié)合這三種方法作了優(yōu)化，形成本實(shí)驗(yàn)的去核方法：其次，本實(shí)驗(yàn)利用牛卵母細(xì)胞孤雌激活的方法，比較了四種激活方法，發(fā)現(xiàn)利用復(fù)合激活方法比單個化學(xué)試劑激活效率高(83.6、68.7：45、62.5)，而在復(fù)合激活的方法中以A23187+6-DMAP激活效率較高(分裂率，83.6)；最后，通過比較M199培養(yǎng)液和CR1aa培養(yǎng)液對孤雌激活胚胎的培養(yǎng)效率，發(fā)現(xiàn)CR1aa培養(yǎng)液較適合牛胚胎的培養(yǎng)。3異種克隆牦牛囊胚研究：本實(shí)驗(yàn)利用不同個體的牦牛耳成纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞，分別作為供核細(xì)胞移入去核牛卵母細(xì)胞中，均可完成體外牦牛的早期囊胚發(fā)育(囊胚率高達(dá)35％)。通過對不同年齡階段、不同個體、不同細(xì)胞類型、細(xì)胞的饑餓與否、細(xì)胞冷凍與否，以及卵母細(xì)胞成熟率，不同融合到激活時間對克隆效率的比較發(fā)現(xiàn)：卵母細(xì)胞的質(zhì)量是克隆成功的基礎(chǔ)，當(dāng)成熟率在40％以下時，將顯著影響異種克隆牦牛的囊胚發(fā)育(由25％降到3％，P＜0.01)；影響異種克隆牦牛早期囊胚發(fā)育的重要因素為延遲激活時間，當(dāng)延遲激活1.5小時可顯著提高異種克隆囊胚率(由21％提高到35％，P＜0.05)；而不同類型細(xì)胞、不同個體、不同年齡、饑餓與否、冷凍與否對異種克隆牦牛早期囊胚發(fā)育影響不顯著，這為簡化供體細(xì)胞的處理提供了依據(jù)。4通過將羚牛和牦牛的異種克隆發(fā)育情況、囊胚總細(xì)胞數(shù)和克隆牛進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：(1)異種克隆羚牛胚胎在體外可以發(fā)育到囊胚階段，囊胚率為5％左右：(2)利用相同的克隆技術(shù)，同種克隆牛、異種克隆牦牛、異種克隆羚牛之間克隆效率差異顯著(48％；28％；5％，P＜0.01)(3)三種克隆囊胚的細(xì)胞數(shù)無差異。這些結(jié)果說明牛卵母細(xì)胞可以支持羚牛、牦牛、牛成纖維細(xì)胞核進(jìn)行重編程，但是囊胚發(fā)育率種內(nèi)較異種克隆高(牛高于牦牛、羚牛)，物種間距離越近克隆效率越高(牦牛高于羚牛)。5由于異種克隆所用的卵母細(xì)胞不是同一物種，有必要對克隆后囊胚的核，線粒體遺傳物質(zhì)進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)對異種克隆牦牛和羚牛囊胚鑒定結(jié)果表明：囊胚核基因組來自牦牛和羚牛供核中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要細(xì)胞，說明本實(shí)驗(yàn)獲得的囊胚是真正異種體細(xì)胞克隆的結(jié)果;囊胚線粒體以牛卵母細(xì)胞線粒體為主，耗牛或羚牛供體細(xì)胞線粒體含量甚微。6異種克隆耗牛胚胎進(jìn)行移植:共移植耗牛胚胎185枚，用受體牛60頭，其中有近33頭的受體牛返情期延長，移植后第60天直腸檢查確認(rèn)有3頭懷孕。7個月后，1頭牛妊娠仍然正常，為通過異種克隆的方法保護(hù)珍稀動物提供了依據(jù)。7目前在較近的物種之間進(jìn)行異種體細(xì)胞克隆雖然已有成功的報(bào)道，但是多數(shù)報(bào)道的異種體細(xì)胞克隆都發(fā)育到囊胚階段，最多妊娠幾個月。本實(shí)驗(yàn)在異種克隆耗牛實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了這一問題。為了較全面的探索其基因方面的原因，則需要對大量的候選基因進(jìn)行分析。而利用傳統(tǒng)的RT一PCR方法從單個卵母細(xì)胞或胚胎中獲得的RNA量不足以分析大量的基因。本研究利用并優(yōu)化了一套全新的擴(kuò)增細(xì)胞中整體cDNA的方法，使微量材料進(jìn)行大量的基因表達(dá)分析成為現(xiàn)實(shí)。通過該方法，本實(shí)驗(yàn)檢測了6個重要基因在耗牛體細(xì)胞和牛卵母細(xì)胞和耗牛異種體細(xì)胞克隆胚胎的表達(dá)情況;同時對耗牛異種體細(xì)胞克隆囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)/總細(xì)胞的比例進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明耗牛體細(xì)胞功能基因波形蛋白基因和膠原蛋白基因只在耗牛細(xì)胞中檢測到，說明耗牛體細(xì)胞的基因表達(dá)得到了重編程。發(fā)現(xiàn)cx43和乃油乙夕這兩個對細(xì)胞和胚胎重要的基因在耗牛細(xì)胞和胚胎中均表達(dá);兩個對胚胎發(fā)育重要的基因人吸”hZ和116不在供體細(xì)胞中表達(dá)，在胚胎中有表達(dá)，但其起始表達(dá)的時期異常。耗牛異種體細(xì)胞克隆囊胚的內(nèi)細(xì)胞比例顯著高于牛人工受精囊胚。由此可推測，滋養(yǎng)層細(xì)胞比例過少和胚胎發(fā)育重要的基因表達(dá)起始時期異?？赡芘c異種體細(xì)胞克隆胚胎妊娠困難和流產(chǎn)率高有關(guān)。8在此次研究中發(fā)現(xiàn)，作為干細(xì)胞標(biāo)志的Ocl4基因在牛和耗牛體外培養(yǎng)的細(xì)胞系中也有大量表達(dá)。利用原