致突變?cè)囼?yàn)技術(shù)規(guī)范

致突變?cè)囼?yàn)技術(shù)規(guī)范1L5178Y細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)1.1目的檢測(cè)消毒劑對(duì)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因突變作用，以作為評(píng)價(jià)消毒劑致突變性的依據(jù)。1.2試劑g/ml，青霉素100IU/ml和鏈霉素100μg/ml配制而成(pH為7.2～7.4)。于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩U/ml和鏈霉素100μg/ml等配制而成(pH為7.2～7.4)。于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?)馬血清:將過濾除菌后的馬血清，經(jīng)56℃作用30min滅活補(bǔ)體。分裝后，于-20℃保存?zhèn)溆?。配制而成。?）無鈣鎂磷酸鹽緩沖液(無鈣鎂PBS，pH為7.2～7.4):磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.20g磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O)2.89g氯化鉀(KCl)0.20g氯化鈉(NaCl)8.00g雙蒸水(壓力蒸汽滅菌)1000ml（6)受試物:最好能直接溶于F10P與F0P培養(yǎng)液中。否則需先溶于二甲基亞砜(DMSO)，而后再加于上述培養(yǎng)液內(nèi)。所加DMSO的量應(yīng)低于1%(V/V)。（7)陽性對(duì)照物:選用甲基磺酸乙酯(EMS)，絲裂霉素C(MMC)，甲基硝基亞硝基胍(MNNG)，苯并(a)芘(BaP)等。（8）三氟胸苷(TFT):用生理鹽水配成100μg/ml溶液，可凍存3個(gè)月。（9）肝微粒體酶混合液(S9混合液):取健康的雄性成年SD或Wistar大鼠，體重150g左右，約5周齡～6周齡。將多氯聯(lián)苯(Aroclor1254)，溶于玉米油中，濃度200mg/ml，按500mg/kg體重一次腹腔注射。5d后，斷頭處死動(dòng)物，取出肝臟稱重后，用預(yù)冷的0.15mol/L氯化鉀溶液沖洗肝臟數(shù)次。每克肝(濕重)加0.15mol/L氯化鉀溶液3ml。剪碎肝臟，在冰浴中用玻璃勻漿器制成肝勻漿。以上操作需注意無菌和局部冷環(huán)境。于無菌冷凍安瓿中。S9制成后，需進(jìn)行無菌檢查，以及用間接致癌物鑒定其活性。合格者置-80℃或液氮中儲(chǔ)存?zhèn)溆?，?chǔ)存期不超過1年。S9混合液應(yīng)以上述S9液在臨用時(shí)按無菌要求配制。一般配成含10%S9的混合液。其配方如下：S90.10ml1.65mo1/L氯化鉀+0.4mol/L氯化鎂0.04ml葡萄糖-6-磷酸.2Na1.8mg氧化型輔酶II(NADP)3.1mg用F0P培養(yǎng)液補(bǔ)足至1.0ml1.3細(xì)胞試驗(yàn)以小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞[胸苷激酶(TK)座位為雜合子(tk+/tk-)]檢測(cè)TK基因的突變。為減少細(xì)胞的自發(fā)突變率，在制備該細(xì)胞試驗(yàn)用懸液時(shí)，先將其在加有THMG的F10P培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，殺滅培養(yǎng)液中所存在的自發(fā)突變細(xì)胞(tk-/tk-)，然后將細(xì)胞懸浮于THG培養(yǎng)液(不含氨甲喋呤的THMG培養(yǎng)液)中培養(yǎng)1d～3d。[THMG含下列4種成分，各成分的終末濃度如下:胸苷5×10-6mol/L次黃嘌呤5×10-5mol/L氨甲喋呤4×10-7mol/L甘氨酸1×10-4mol/L]1.4試驗(yàn)分組一般設(shè)4個(gè)劑量組。對(duì)有細(xì)胞毒性的受試物，最高劑量組的細(xì)胞存活率為10%～20%，無細(xì)胞毒性受試物最高劑量不超過10mmol/L或5mg/ml。同時(shí)應(yīng)有陰性（溶劑）對(duì)照組、未處理對(duì)照組和陽性對(duì)照組。除未處理對(duì)照組外，試驗(yàn)組和其它對(duì)照組，還均應(yīng)包括有加S9混合液和不加S9混合液兩大部分。1.5操作程序（1）細(xì)胞準(zhǔn)備:將新清除了自發(fā)突變體的細(xì)胞群體，用F10P培養(yǎng)液制成懸液。以無菌燒瓶加入細(xì)胞懸液和F10P培養(yǎng)液至100ml，細(xì)胞終末密度為7×103個(gè)/ml～8×103個(gè)/ml。培養(yǎng)物以含5%二氧化碳的空氣充氣后，加蓋密閉，于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。L5178Y細(xì)胞的細(xì)胞殖周期約為10h～11h，在常規(guī)培養(yǎng)24h后，細(xì)胞數(shù)將增加約5倍。用稀釋法維持生長(zhǎng)，每天將細(xì)胞培養(yǎng)物用F10P培養(yǎng)液作4倍稀釋(或隔天用F10P培養(yǎng)液作24倍稀釋)，繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前一天用F10P培養(yǎng)液和F0P培養(yǎng)液各50%的對(duì)半混合液(馬血清終末濃度為5%)稀釋。（2)受試物處理:用上述F10P和F0P的對(duì)半混合液將細(xì)胞培養(yǎng)物稀釋至1×106個(gè)/ml，并分種于50ml有蓋試管中，每管6ml，再加S9混合液4ml(總量共10ml)。不加S9混合液管，代之以F0P培養(yǎng)液。在上述試管內(nèi)加入一定濃度的受試物，并以含5%二氧化碳的空氣充氣后加蓋密閉，于37℃培養(yǎng)4h。處理結(jié)束后，以200g離心10min，除去含受試物的上清液，收集細(xì)胞。細(xì)胞用Hanks液洗滌，再加入20mlF10P培養(yǎng)液充分混懸(細(xì)胞濃度為0.3×l06個(gè)/ml)，以含5%二氧化碳的空氣充氣后，加蓋密閉，于37℃振蕩培養(yǎng)，開始表達(dá)。3×105個(gè)/ml。（4）選擇和集落化:表達(dá)結(jié)束后，取10ml培養(yǎng)物經(jīng)離心后除去大部分上清液。并將細(xì)胞在留下的約1mlF10P培養(yǎng)基中混懸。將細(xì)胞懸液移入含100ml集落培養(yǎng)基的燒瓶中。此時(shí)細(xì)胞密度為3×l04個(gè)/ml。在37℃振蕩培養(yǎng)30min。取出0.5ml后，向余下的細(xì)胞懸液中加入1.0mlTFT貯存液，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)15min。將樣本取出，倒于3個(gè)10cm平皿中，每平皿33ml，含1×l06個(gè)細(xì)胞(稱為TFT平板)，作突變體的選擇。將先前取出的0.5ml細(xì)胞懸液用集落培養(yǎng)基先作1:100稀釋，細(xì)胞懸液濃度為3×l02個(gè)/ml。振蕩培養(yǎng)15min后，取出2.0ml再用集落培養(yǎng)基作1:50稀釋(此時(shí)細(xì)胞懸液濃度為6個(gè)/ml)后振蕩培養(yǎng)。經(jīng)15min培養(yǎng)后，倒入3個(gè)直徑為100mm的平中靜置培養(yǎng)10d。計(jì)數(shù)各個(gè)平皿中出現(xiàn)的集落數(shù)，計(jì)算集落形成效率(CFE)。（5)陽性與陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組，僅陽性對(duì)照組用陽性對(duì)照物代替受試物，陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑代替受試物。另設(shè)一未處理對(duì)照組。（6)按下列公式計(jì)算有關(guān)指標(biāo):絕對(duì)CFE=(形成集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))相對(duì)CFE=(試驗(yàn)組絕對(duì)CFE/溶劑對(duì)照組絕對(duì)CFE)×100%突變頻率(MF)=(TFT平皿集落數(shù)/VC平皿集落數(shù))×稀釋系數(shù)（在此，稀釋系數(shù)為2×l0-4）。1.6評(píng)價(jià)規(guī)定（1）對(duì)L5178Y細(xì)胞，推薦可接受的自發(fā)突變頻率范圍為20/106～100/106個(gè)存活細(xì)胞。（2）用適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，當(dāng)各劑量組MF與陰性(溶劑)對(duì)照組者相比突變率，有顯著性意義的增加，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)，或僅一個(gè)劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)者，均可判為陽性結(jié)果，即受試物對(duì)L5178Y細(xì)胞TK系統(tǒng)有致突變性。2V79細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)2.1目的檢測(cè)消毒劑對(duì)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可否引起基因突變，以對(duì)消毒劑的致突變性做出評(píng)價(jià)。2.2試劑（1）完全培養(yǎng)液：以Eagle最低必需培養(yǎng)液(EMEM)或培養(yǎng)液加10%小牛血清、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100μg/ml)配制而成。（2)小牛血清:將過濾除菌后的小牛血清放入56℃水浴中，保溫30min以滅活補(bǔ)體，而后分裝，保存于-20℃?zhèn)溆?。?）無鈣鎂磷酸鹽緩沖液(無鈣鎂PBS):見1.2（5）。（4)胰蛋白酶-EDTA溶液:分別用無鈣鎂PBS配制胰蛋白酶與EDTA溶液，胰蛋白酶溶液濃度為0.05%，EDTA溶液濃度為0.02%。兩溶液按1:1混合。存放于-20℃?zhèn)溆?。?)受試物:最好能直接溶于無血清培養(yǎng)液內(nèi)。否則，需先溶于二甲基亞砜(DMSO)，而后加于無血清培養(yǎng)液內(nèi)。所加DMSO溶液量為0.5%(V/V)。（6)陽性對(duì)照物:可根據(jù)受試物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選用不同的陽性對(duì)照物，例如甲基磺酸乙酯(EMS)，絲裂霉素C(MMC)，甲基硝基亞硝基胍(MNNG)，苯并(α)芘(BaP)等。（7)6-硫代鳥嘌呤(6-TG):用0.5%碳酸氫鈉溶液配制為1.0mg/mL溶液，保存于4℃?zhèn)溆?。?）肝微粒體酶混合液(S9混合液):見1.2（9）。（9）姬姆薩染液:取姬姆薩染料3.8g，置瑪瑙乳缽中，加少量甲醇研磨。逐漸加甲醇至分溶解。取出過濾，2周后使用，作為姬姆薩染液原液。使用時(shí)，取1份姬姆薩染液原液，與9份1/15mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)混合，配成其應(yīng)用液。磷酸鹽緩沖液(1/15mol/L，pH6.8)配制方法如下:第一液:取磷酸氫二鈉9.47g溶于蒸餾水1000ml中，配成1/15mol/L溶液。第二液:取磷酸二氫鉀49.07g溶于蒸餾水1000ml中，配成1/15mol/L溶液。取第一液49.5ml加于第二液50.5ml中混勻，即為pH6.8的1/15mol/LPBS。2.3細(xì)胞以中國倉鼠肺(V79)細(xì)胞株進(jìn)行試驗(yàn)。為減少其自發(fā)突變，正式試驗(yàn)前將野生型細(xì)胞接種于含THMG(見1.3)的MEM培養(yǎng)液內(nèi)并在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周，以殺滅自發(fā)HGPRT位點(diǎn)突變體。遂后重新接種于MEM培養(yǎng)液中。2.4試驗(yàn)分組一般設(shè)4個(gè)試驗(yàn)劑量組。對(duì)有細(xì)胞毒性的受試物，最高劑量組的細(xì)胞存活率為10%～20%，無細(xì)胞毒性受試物最高劑量不超過10mmol/L(或5mg/ml)。同時(shí)，應(yīng)設(shè)陰性（溶劑）對(duì)照組、未處理對(duì)照組和陽性對(duì)照組。除未處理對(duì)照組外，各組均應(yīng)包括加S9混合液和不加該液的樣本。2.5操作程序（1）細(xì)胞準(zhǔn)備:將5×105個(gè)細(xì)胞接種于含完全培養(yǎng)液的直徑為100mm的平皿中，除未處理對(duì)照組外，每組2皿共13皿。于二氧化碳培養(yǎng)箱中(37℃)培養(yǎng)24h。(2)接觸受試物：吸去上述供試培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用無鈣鎂PBS洗2次。將含有細(xì)胞的培養(yǎng)皿分為二大組，一組加S9混合液，另一組不加S9混合液。加S9混合液組，在培養(yǎng)皿中加入2mlS9混合液，對(duì)不加S9混合液組，則用2ml無血清培養(yǎng)液代替，再加一定量不同濃度受試物的供試液，最后用不含血清的培養(yǎng)液補(bǔ)足至10ml。并將培養(yǎng)皿置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h，處理結(jié)束后，吸去培養(yǎng)皿中液體部分，用無鈣鎂PBS洗滌細(xì)胞2次，再加入完全培養(yǎng)液10ml，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)19h~22h。陽性和陰性(溶劑)對(duì)照組也分加與不加S9混合液兩大組，操作方法同上。(3)表達(dá)：將培養(yǎng)物用胰蛋白酶-EDTA消化。待細(xì)胞脫落后，加入完全培養(yǎng)液，終止消化。混勻、計(jì)數(shù)并進(jìn)行表達(dá)和細(xì)胞毒性測(cè)定[見2.5（4)]。表達(dá)時(shí)，以5×105個(gè)細(xì)胞接種于直徑為100mm的平皿中。培養(yǎng)3天后，分傳一次，仍接種5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)3天后再進(jìn)行突變體的選擇及集落形成效率(CFE)的測(cè)定。(4)細(xì)胞毒性測(cè)定:將上述消化計(jì)數(shù)后的細(xì)胞，每平皿接種200個(gè)，每組5個(gè)平皿，于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃)培養(yǎng)7d。取出樣本，固定并進(jìn)行姬姆薩染色后，計(jì)數(shù)各平皿的細(xì)胞集落數(shù)。以相對(duì)CFE值表示細(xì)胞的毒性。(5)突變體的選擇及集落形成率的測(cè)定:表達(dá)結(jié)束后，消化細(xì)胞，分別接種，每組5個(gè)平皿，每平皿種2×105個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后加入6-TG，終末濃度為5μg/ml。放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d～10d。固定后進(jìn)行姬姆薩染色，計(jì)數(shù)平皿內(nèi)集落數(shù)，并計(jì)算其突變頻率(MF)。(6)陽性與陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組，僅陽性對(duì)照組用陽性對(duì)照物代替受試物，陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑代替受試物。另設(shè)一陰性(未處理)對(duì)照組。(7)按下列公式計(jì)算有關(guān)指標(biāo):絕對(duì)CFE=(形成集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))相對(duì)CFE=(試驗(yàn)組絕對(duì)CFE/溶劑對(duì)照組絕對(duì)CFE)×100%突變頻率(MF)=(突變集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×（1/絕對(duì)CFE）2.6評(píng)價(jià)規(guī)定(1)對(duì)V79細(xì)胞，推薦可接受的自發(fā)突變頻率范圍為10/106～100/106個(gè)存活細(xì)胞。(2)用適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，當(dāng)各劑量組MF與陰性(溶劑)對(duì)照組者相比，突變率有顯著性意義的增加，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)，或僅一個(gè)劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)者，均可判為陽性結(jié)果，即受試物對(duì)V79細(xì)胞HGPRT系統(tǒng)有致突變性。3體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)3.1目的用細(xì)胞遺傳學(xué)方法檢測(cè)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變，評(píng)價(jià)消毒劑的致突變性。3.2試劑(1)完全培養(yǎng)液:采用Eagle最低必需培養(yǎng)液(EMEM)或Dulbecco最低必需培養(yǎng)液(DMEM)等，并加入10%小牛血清以及青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100μg/ml)。(2)小牛血清:將過濾除菌后的小牛血清，放人56℃恒溫水浴中，保溫30min滅活補(bǔ)體。處理后分裝，保存于-20℃?zhèn)溆谩?3)無鈣鎂磷酸緩沖液[無鈣鎂PBS，pH為7.2～7.4。見1.2（5)]。(4)胰蛋白酶-EDTA:見2.2（4）。(5)受試物:最好能直接溶于無血清完全培養(yǎng)液內(nèi)。否則，需先溶于二甲基亞砜(DMSO)，而后加于完全培養(yǎng)液內(nèi)。所加DMSO溶液量應(yīng)低于1.0%(V/V)。(6)陽性對(duì)照物：加S9時(shí)選用環(huán)磷酰胺等，不加S9時(shí)選用絲裂霉素C等。(7)肝微粒體酶混合液(S9混合液):見1.2（9)。(8)秋水仙素溶液(0.04%)：取40mg秋水仙素溶解于100ml無菌0.85%氯化鈉溶液中，過濾除菌。(9)氯化鉀溶液(0.075mol/L)。(10)甲醇/冰醋酸(3:1，V/V)固定液:臨用現(xiàn)配。(11)姬姆薩染液:見2.2（9)。3.3細(xì)胞可選用中國倉鼠肺（CHL）細(xì)胞、中國倉鼠肺（V79）細(xì)胞、中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞，或人外周血淋巴細(xì)胞等進(jìn)行試驗(yàn)。在一般情況下，本試驗(yàn)推薦使用CHL細(xì)胞。使用CHL細(xì)胞時(shí)，在試驗(yàn)前一天，將其1×l06個(gè)細(xì)胞接種于直徑為100mm平皿中，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)待用。3.4試驗(yàn)分組所設(shè)試驗(yàn)劑量組應(yīng)不少于4個(gè)。最高劑量組的細(xì)胞存活率應(yīng)為10%～20%，無毒性受試物最高劑量組不超過10mmol/L(或5mg/ml)。同時(shí)，應(yīng)設(shè)陰性(溶劑)對(duì)照組、未處理對(duì)照組和陽性對(duì)照組。除未處理對(duì)照組外，各組均應(yīng)包括加S9混合液和不加該液的樣本。3.5操作程序(1)試驗(yàn)時(shí)，吸出細(xì)胞培養(yǎng)平皿中的培養(yǎng)液，加入試驗(yàn)所規(guī)定濃度的受試物和S9混合物(10%)以及不含小牛血清的完全培養(yǎng)液，放二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)作用2h。結(jié)束后，吸去完全培養(yǎng)液，用Hanks液洗細(xì)胞3次。加完全培養(yǎng)液，再置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24h收獲細(xì)胞。收獲細(xì)胞之前2h～4h，加入秋水仙素溶液(終末濃度為1μg/ml)，阻斷細(xì)胞于有絲分裂中期相。(2)收獲細(xì)胞時(shí)，用胰蛋白酶-EDTA溶液消化細(xì)胞，待細(xì)胞脫落，加入培養(yǎng)液并混勻化姆薩應(yīng)用液染色15min左右。(3)陽性與陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組，只是陽性對(duì)照組用已知染色體斷裂劑替代受試物。陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物的溶劑。另設(shè)一未處理對(duì)照組。(4)觀察：每組各選100個(gè)染色體分散良好的中期分裂相細(xì)胞，進(jìn)行染色體畸變分析，觀察和記錄染色體結(jié)構(gòu)的異常及數(shù)量異常。隙，非特定性型變化(粉碎化等)。染色體數(shù)量異?？捎?非整倍體，多倍體，內(nèi)復(fù)制。3.6評(píng)價(jià)規(guī)定用χ2檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法，對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與陰性(溶劑)對(duì)照組相比，畸變細(xì)胞率的增加有顯著性意義，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)；或僅一個(gè)劑量組有顯著性意義的增加，并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)時(shí)，可判為該受試物在本試驗(yàn)中具有致突變性。4小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)4.1目的檢測(cè)消毒劑對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成的影響，評(píng)價(jià)消毒劑的染色體損傷毒性。4.2試劑(1)受試物:用水、植物油或用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成溶液或混懸液。(2)陽性對(duì)照物:常用環(huán)磷酰胺或絲裂霉素C。(3)小牛血清:見3.2（2）。(4)姬姆薩染液:見2.2（9）。4.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用體重為25g～30g的小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分組。4.4試驗(yàn)分組受試物至少設(shè)3個(gè)劑量組，每個(gè)劑量組用10只動(dòng)物，雌雄各半。另設(shè)陰性(溶劑)和陽性對(duì)照組。劑量組一般取受試物的1/2LD50、1/5LD50、1/20LD50等劑量，以得到劑量-反應(yīng)關(guān)系。高劑量組應(yīng)不引起動(dòng)物死亡，不引起明顯骨髓抑制。若采用一次最大限度試驗(yàn)測(cè)得LD50大于5000mg/kg體重，即以5000mg/kg體重為高劑量。4.5操作程序(1)動(dòng)物染毒采用經(jīng)口灌胃30h染毒法，即兩次染毒間隔24h，第二次染毒后6h取材。(2)用頸椎脫臼法處死動(dòng)物，取股骨或胸骨。剝除肌肉，擦凈血污。切斷股骨或胸骨兩端，暴露骨髓腔。(3)用注射器吸取0.1ml小牛血清，沖洗骨髓腔。用沖洗液常規(guī)涂片，晾干或熱風(fēng)吹干。(4)將已干的涂片，在甲醇中固定5min～10min。用姬姆薩應(yīng)用液染色10min～15min，然后用pH6.8PBS液沖洗，晾干。(5)陽性與陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組。陽性組選用環(huán)磷酰胺(40mg/kg體重)或絲裂霉素(1mg/kg～1.5mg/kg體重)。陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑。(6)選擇細(xì)胞分布均勻、完整、著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域。在油鏡下計(jì)數(shù)含微核的嗜多染紅細(xì)胞色性與有核細(xì)胞核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色。直徑通常為紅細(xì)胞的1/20～1/5。(7)每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)PCE。微核細(xì)胞率指含有微核的PCE數(shù)，以千分率表示。1個(gè)PCE中出現(xiàn)有2個(gè)或多個(gè)微核，仍按1個(gè)計(jì)數(shù)。此外，還應(yīng)觀察PCE/NCE比例，作為對(duì)細(xì)胞毒性的指標(biāo)。一般計(jì)數(shù)200個(gè)PCE，同時(shí)記數(shù)所見到的NCE。當(dāng)PCE/NCE小于0.1時(shí)，提示對(duì)骨髓具有明顯抑制作用，應(yīng)降低受試物劑量，重新進(jìn)行試驗(yàn)。4.6評(píng)價(jià)規(guī)定陰性對(duì)照組小鼠，微核細(xì)胞率一般不超過0.3%。用波松分布u檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性試驗(yàn)方法，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與溶劑對(duì)照組相比，微核細(xì)胞率的增加有顯著性意義，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系，或僅一個(gè)劑量組微核細(xì)胞率增加有顯著性意義，并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)時(shí)，均可判為受試物具有體內(nèi)染色體損傷作用。5哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)5.1目的用細(xì)胞遺傳學(xué)方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變率，以評(píng)價(jià)消毒劑的致突變性。5.2試劑(1)陽性對(duì)照物:常用環(huán)磷酰胺，絲裂霉素C等。(2)秋水仙素(0.04%):取40mg秋水仙素溶解于100ml無菌的0.85%氯化鈉溶液中，過濾除菌。(3)氯化鉀溶液(0.075mol/L)。(4)甲醇/冰醋酸(3:1，V/V)固定液:臨用現(xiàn)配。(5)姬姆薩染液[見2.2（9)]。(6)磷酸鹽緩沖液(PBS，1/15mol/L，pH7.4)。5.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年小鼠(體重25g～30g)，或大鼠(體重180g～220g)。動(dòng)物總數(shù)不少于30只，雌雄各半。5.4試驗(yàn)分組隨機(jī)分為5組。至少3個(gè)受試物劑量組，為1/2LD50、1/5LD50、1/20LD50。若采用一次最大限度試驗(yàn)，測(cè)得LD50大于5000mg/kg體重，即以5000mg/kg體重為高劑量。另設(shè)陽性對(duì)照組和陰性(溶劑)對(duì)照組，每組6只動(dòng)物，雌雄各半。陽性對(duì)照組可用環(huán)磷酰胺(40mg/kg體重)或絲裂霉素C(1.5mg/kg～2mg/kg體重)。陰性(溶劑)對(duì)照組采用受試物溶劑。5.5操作程序(1)用經(jīng)口灌胃方式，共染毒兩次，間隔24h。于第二次染毒后6h處死動(dòng)物。處死動(dòng)物前2h～4h腹腔注射0.04%秋水仙素溶液，劑量為4mg/kg體重。(2)用頸椎脫臼法處死動(dòng)物，取出股骨，剔除肌肉等組織。(3)剪去股骨兩端，用注射器吸取5ml生理鹽水，從股骨一端注入，用10ml離心管從股骨另一端接取流出的骨髓細(xì)胞懸液。(4)將骨髓細(xì)胞懸液離心(1000r/min，5min～7min)，除上清液。加0.075mol/L氯化鉀溶液7m1，用滴管將細(xì)胞輕輕混勻，置37℃水浴中低滲處理7min。(5)加入2ml甲醇/冰醋酸固定液，混勻。離心(1000r/min，5min～7min)，棄上清液。再加入7ml固定液，混勻，固定7min。離心(1000r/min，7min)，棄去上清液。(6)用同法再固定1次～2次，棄上清液，加入數(shù)滴新鮮固定液，混勻。(7)用懸液滴片，晾干，以姬姆薩應(yīng)用液染色。(8)每組各選100個(gè)染色體分散良好的中期分裂相細(xì)胞，進(jìn)行染色體畸變分析，觀察和記錄染色體結(jié)構(gòu)的異常和數(shù)量的異常。染色體結(jié)構(gòu)異?？捎?斷裂、微小體、有著絲點(diǎn)環(huán)、單體互換、雙微小體、裂隙、粉碎化等。染色體數(shù)量的異?？捎?非整倍體、多倍體、內(nèi)復(fù)制等。(9)計(jì)算畸變細(xì)胞率。畸變細(xì)胞率為100個(gè)中期分裂相細(xì)胞中有染色體畸變的細(xì)胞數(shù)。一個(gè)中期分裂相細(xì)胞出現(xiàn)兩種或多種畸變，仍按一個(gè)有染色體畸變細(xì)胞計(jì)。(10)陽性與陰性(溶液)對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組。只是陽性組選用環(huán)磷酰胺(40mg/kg體重)或絲裂霉素(1.5mg/kg～2.0mg/kg體重)作為受試物的替代物。陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑作為受試物的替代物。5.6評(píng)價(jià)規(guī)定用χ2檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與陰性(溶劑)對(duì)照組相比，畸變細(xì)胞率的增加有顯著性意義，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)；或僅一個(gè)劑量組畸變細(xì)胞率增加有顯著性意義，并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)時(shí)，可判為該受試物在本試驗(yàn)中具有致突變性。6程序外DNA修復(fù)合成試驗(yàn)6.1目的檢測(cè)受試物是否可引起體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原發(fā)DNA損傷。推薦用放射自顯影法進(jìn)行測(cè)定。6.2試劑(1)完全培養(yǎng)液:用Eagle最低要求培養(yǎng)基(EMEM)85份加小牛血清15份，青霉素(終末濃度100IU/ml)與鏈霉素(終末濃度100μg/mL)，pH為7.2～7.4。過濾除菌后，保存于4℃冰箱備用。(2）同步培養(yǎng)液:用不含精氨酸的EMEM培養(yǎng)基98份，加小牛血清2份，再加青霉素(終末濃度100IU/ml)與鏈霉素(終末濃度為100μg/mL)配制而成。(3）小牛血清:見3.11.2.22)。(4）無鈣鎂磷酸鹽緩沖液(無鈣鎂PBS):見1.2（5）。(5）胰蛋白酶-EDTA溶液:見2.2（4）。(6）甲醇/冰醋酸(3:1，V/V)固定液:臨用現(xiàn)配。(7）羥基脲(HU)貯備液:250mmol/L。(8）1%枸櫞酸鈉溶液。(9）3H-胸腺嘧啶核苷(10）NTB-2核乳膠或國產(chǎn)核-4乳膠。(11）肝微粒體酶混合液(S-9混合液):見1.2（9）。(12)顯影液及定影液:包括柯達(dá)(Kodak)D-196顯影液、停顯液及F-5定影液。6.3細(xì)胞可選用人成纖維細(xì)胞、大鼠原代肝細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞等進(jìn)行試驗(yàn)。本規(guī)范推薦使用人胚肺成纖維細(xì)胞(2BS)。6.4試驗(yàn)分組受試物可設(shè)4個(gè)劑量組。最高劑量組應(yīng)使細(xì)胞存活率在10%～20%之間。無毒性受試物最高劑量不超過10mmol/ml。同時(shí)應(yīng)有陰性(未處理、溶劑)對(duì)照組和陽性對(duì)照組。6.5操作程序人胚肺成纖維細(xì)胞(2BS)放射自顯影法操作程序。(1)將細(xì)胞增殖至所需數(shù)量后，用完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，濃度為0.5×105個(gè)/ml～1.0×105個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液接種置有小蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1d～3d，至細(xì)胞50%融合。每一劑量組和各對(duì)照組分別作2個(gè)～3個(gè)平行樣本。(2)換用同步培養(yǎng)液，培養(yǎng)3d。(3)在試驗(yàn)的前一日下午，加入羥基脲(HU)貯備液使HU的終末濃度為10mmol/L。繼續(xù)在37℃下培養(yǎng)16h，然后將上述長(zhǎng)有細(xì)胞之蓋片置于含有不同濃度的受試物、HU(10mmol/L)及3H-胸腺嘧啶核苷(5μCi/ml～10μCi/ml，30Ci/mmol)同步培養(yǎng)液中。在37℃培養(yǎng)5h。(4)陽性及陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組，只是陽性對(duì)照組用陽性對(duì)照物代替受試物，陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑代替受試物。(5)處理結(jié)束后，用Hanks液洗滌3次，再用1%枸掾酸鈉溶液處理10min。將小蓋玻片用甲醇-冰醋酸固定液固定30min，重復(fù)2次。干燥過夜，將有細(xì)胞的蓋玻片用少量中性樹膠，粘固于載玻片上，長(zhǎng)有細(xì)胞的一面朝上。(6)在暗室中，將適量之NTB-2乳膠(或核-4乳膠)移入浸漬用之玻璃器皿中，置40℃水浴中融化，再加入等量40℃蒸餾水，繼續(xù)在水浴中加溫，用玻璃棒輕輕攪拌10min～20min，使氣泡逸出。同時(shí)將準(zhǔn)備做自顯影處理的載玻片，置水浴箱平臺(tái)上預(yù)熱。而后，將附有樣本的載玻片垂直浸漬于乳膠液中約5s。提出玻片，拭去其背面乳膠并待其干固。(7)將干固的附有樣本的載玻片置于有變色硅膠干燥劑袋的曝光盒中，盒外包黑色避光紙，于4℃冰箱中曝光10d。曝光后，將玻片在D-19顯影液中顯影4min，在停顯液中漂洗30s，在F-5定影液中定影10min，再用水漂洗數(shù)小時(shí)。(8)細(xì)胞在顯影后用姬姆薩染液染色，脫水透明后，用蓋片封固。在油鏡下，計(jì)數(shù)各樣本細(xì)胞核的顯影銀粒數(shù)，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，同時(shí)計(jì)數(shù)相當(dāng)面積的本底銀粒數(shù)，兩者之差為細(xì)胞核凈銀粒數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組和對(duì)照組"銀粒數(shù)/核"的均值及其標(biāo)準(zhǔn)差。6.6評(píng)價(jià)規(guī)定用t檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各試驗(yàn)劑量組"銀粒數(shù)/核"均值與陰性(溶劑)對(duì)照組者相比，有顯著性意義的增加，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)；或僅一個(gè)劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加，但經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)者，可判為該受試物誘導(dǎo)了DNA修復(fù)合成，具有DNA損傷作用。7小鼠精子畸形試驗(yàn)7.1目的以哺乳動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，檢測(cè)受試物對(duì)雄性生殖細(xì)胞的遺傳毒性(精子形態(tài)異常)。7.2試劑(1)受試物:常用水、植物油，或用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液。(2)陽性對(duì)照物:常用環(huán)磷酰胺或絲裂霉素C。(3)甲醇（優(yōu)級(jí)純）。(4)2.5%伊紅溶液:稱取伊紅2.5g，溶于100ml蒸餾水中備用。7.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年雄性小鼠至少25只，體重25g～35g。7.4試驗(yàn)分組設(shè)3個(gè)試驗(yàn)劑量組，最高劑量可取最大耐受量，或分別取1/2LD50、1/5LD50、1/20LD50。若采用一次最大限量試驗(yàn)，測(cè)得LD50大于5000mg/kg體重，即以5000mg/kg體重為高劑量。另設(shè)陽性對(duì)照組和陰性(溶劑)對(duì)照組。每組5只動(dòng)物。7.5操作程序(1)小鼠灌胃染毒。連續(xù)5d，每天1次。(2)首次染毒后35d，用頸椎脫臼法處死動(dòng)物，剖腹，取出附睪。(3)將附睪放入盛有2ml生理鹽水的平皿中，用眼科剪剪碎。以3層擦鏡紙過濾，取濾液離心(1000r/min，5min)。(4)除上清液。加入少量生理鹽水，以混懸液涂片。自然干燥。甲醇固定5min，用伊紅溶液染色1h。(5)在高倍顯微鏡下，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)精子中的畸形精子數(shù)。精子畸形類型可分為及精子畸形類型的構(gòu)成比。(6)陽性對(duì)照組，腹腔注射環(huán)磷酰胺(每天40mg/kg～60mg/kg體重)，或絲裂霉素C(每天1.0mg/kg～1.5mg/kg體重)。陰性對(duì)照組為受試物溶劑對(duì)照。其他操作程序同試驗(yàn)組。7.6評(píng)價(jià)規(guī)定用χ2檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與陰性(溶劑)對(duì)照組相比，精子畸形率有顯著性意義的增加，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)；或僅一個(gè)劑量組有顯著性意義的增加，并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)時(shí)，可判為該受試物對(duì)雄性生殖細(xì)胞具有遺傳毒性。8睪丸生殖細(xì)胞染色