臨床樣本的采集運輸和保存及核酸提取課件

臨床標本的采集、處理、運送與保存及DNA/RNA提取

研究背景

樣本的采集、處理樣本的保存樣本的運輸

DNA的提取

RNA的提取研究背景一、樣本的采集、處理、保存及運輸臨床標本的正確采集、運送、保存

的重要性臨床檢驗的質量保證關鍵性環(huán)節(jié)解決涉及實驗室檢驗的醫(yī)患糾紛的方法之一（一）、樣本的采集地貧檢測樣品采集：外周血:≥5mL

臍帶血:0.5~1mL

羊水：20～30mL

絨毛：≥15mg

唾液組織標本采集的注意事項所有標本的采集、運送和處理應在無菌操作，防止污染的原則下進行已采集標本都應置于防漏、密封的無菌容器中運送采集足夠量標本每份標本都應標記患者姓名、送檢號碼、標本來源、具體部位、日期、時間及相關臨床信息全血以全血作為待測標本時，必須注意抗凝劑的選擇，一般使用EDTA-Na2或枸椽酸鈉，不可使用肝素全血樣本如用于DNA提取檢測，可4℃下短期保存,如用于RNA檢測，則應在取血后，盡快提取RNA血清（漿）DNA測定，可按照一般的血清標本處理程序，對測定影響不大RNA測定，標本的獲取和保存方式對測定結果，可能有決定性影響。最好是使用EDTA抗凝(嚴禁使用肝素)全血標本，抗凝后6小時內分離血漿，如使用血清標本，則需盡快(2小時內)分離血清，標本的短期（1～2周）保存可在-20℃下，較長期保存應在-70℃下

肝素的作用機理

肝素對MLV逆轉錄酶和TAQDNA聚合酶均很強的抑制作用，如果臨床標本為肝素抗凝，則在核酸純化過程中，標本中的肝素可結合于DNA和RNA上對標本進行煮沸、凝膠過濾、酸堿處理后凝膠過濾、反復乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用每μg核酸標本中加入0.1U的肝素，即可100%的抑制酶活性在標本中加入肝素酶I或Ⅱ1~3U/μg核酸在于5mMTrispH7.5,1mMCaCl2,40URNasin25℃下作用2小時可去除肝素的抑制作用（二）、樣本的運送

樣本一經(jīng)采集，則應盡可能快的送至檢測實驗室樣本中如加入了適當?shù)姆€(wěn)定劑，如用于DNA測定的EDTA抗凝血等，則可在室溫下運送或郵寄建議：將全血標本或DNA樣本用冰袋加泡沫盒快遞運送。如需提取RNA的樣本需預處理后加lmlTrizol在低溫運送（三）、樣本的保存常規(guī)外周血標本，采集后做血常規(guī)，常溫24小時內，4℃可保存1周；做血紅蛋白電泳常溫1周，電泳4℃可保存15天；DNA提取樣本常溫24小時，4℃保存1個星期，－20℃保存3個月，－70℃保存半年～3年；RNA提取樣本常溫6小時，4℃保存12小時，－70℃保存3個月，羊水在12小時內離心可保存同上。研究背景

二、核酸的提取核酸提取的重要性核酸提取是臨床PCR檢驗最為關鍵的部分，亦是手式操作的主要部分核酸提取的成敗關系到臨床PCR檢驗的正確與否臨床PCR檢驗操作中最易出問題的環(huán)節(jié)（一）、提取核酸總的原則

保證核酸一級結構的完整性；其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度；核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；其他核酸分子，如提取DNA中的RNA，也應盡量去除。（二）、核酸提取的基本步驟1、核酸的釋放：

破裂細胞釋放核酸機械法與非機械法（非機械法中溶胞法是應最廣泛的方法）各種組織細胞破碎方法細胞破碎方法

應用

Ⅰ機械法1.勻漿法機體軟組織2.搗碎法動物韌性組織3.研磨法細菌、酵母

Ⅱ物理法1.超聲法細胞混懸液2.反復凍融法培養(yǎng)細胞3.冷熱交替法細菌、病毒4.低滲裂解紅細胞

Ⅲ化學法1.有機溶劑細菌、酵母、血液2.去垢劑組織、培養(yǎng)細胞、血液3.酶解法細菌、酵母、血液2、核酸的分離與純化：

將含有核酸分子復雜復合物中，將核酸與其他物質分離非核酸的大分子污染物（蛋白質、多糖和脂類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質與某些鹽離子加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機溶劑（如乙醇、異丙醇等）少數(shù)鹽類可使用70-75%的乙醇洗滌

4.核酸的鑒定濃度鑒定純度鑒定完整性鑒定濃度鑒定DNA：1）紫外分光光度法：測定DNA在A260nm的光吸收值。如計算DNA濃度

A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液。(A值等于1時，相當于50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA，20μg/ml單鏈寡核苷酸）RNA：紫外吸光光度法:A260×稀釋倍數(shù)×40＝μg/ml(OD260-OD320)×稀釋倍數(shù)×40＝μg/ml

2）熒光光度法熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析（1-5ng）EB與DNA的結合純度鑒定紫外分光光度法：在260nm和280nm處測定DAN溶液的光吸收，純的DNAA260與A280之比應在1.80(1.60~1.80)，低于此值表明制備物中留有蛋白質成份。高于此值表明有RNA的殘留量純的RNAA260與A280之比應在2.0(1.80~2.00),Ratio<1.8:蛋白質污染;Ratio>2.2:RNA可能已經(jīng)水解成單核苷酸A260/A280比值是純度檢測的重要指標！注：測定吸光值，稀釋液應使用ＴＥ完整性鑒定凝膠電泳法：基因組DNA電泳，在電場中泳動慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象；總RNA電泳，觀測各條帶的含量，提示是否存在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNA污染。DNA完整性鑒定：

正常時，28SRNA的熒光強度約為18SRNA的2倍，否則提示RNA的降解RNA完整性鑒定：5、核酸的貯存——DNA保存

1）短期貯存：

4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）緩沖液中。

TE緩沖液的PH與DNA貯存有關，PH為8時，可減少DNA脫氨反應，PH低于7.0時DNA容易變性。2）長期貯存：

TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細菌和核酸的污染。核酸的貯存——RNA保存：三、基因組DNA的分離與純化（一）、DNA樣品準備

常見的標本：血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細胞等生物組織：最好新鮮組織，若不能馬上提取，應貯存－70℃或液氮DNA提取前樣本采集、預處理和保存：全血抗凝劑：

EDTA-Na2

或枸櫞酸鈉作為抗凝劑不宜使用肝素

抗凝劑處理血肝素檸檬酸*EDTA*-80℃保存2個月，第10天收率90%4℃第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室溫提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差（二）、DNA提?。ㄒ唬┓映樘岱ǎ合扔肊DTA、SDS、蛋白酶K破碎細胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或異丙醇進行沉淀。獲DNA大小為100－150kb。酚抽提法提取步驟：DNA酚抽提法示意圖主要試劑的作用：

EDTA：1.二價金屬螯合劑，抑制核酸酶；

2.降低細胞膜的穩(wěn)定性SDS的作用：1.溶解膜蛋白和脂肪，從而使細胞膜破裂2.溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來3.對RNA、DNA酶有抑制作用4.與蛋白質形成R-O-SO3….R蛋白質復合物，使蛋白質變性蛋白酶K：水解蛋白質的作用，消化DNA酶和細胞中的蛋白質蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時仍保持較高活性，可同時使用苯酚：蛋白質強變性劑、抑制DNA酶活性苯酚溶于有機溶劑，微溶于水提取DNA前苯酚用Tris-Hcl飽和，防止吸收過多DNA，降低DNA的損失率氧化苯酚會破壞DNADNA的沉淀：1）無水乙醇沉淀沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負電荷，有助于分子之間的聚集。無水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，無水乙醇使用前冰凍，可以減少DNA沉淀析出過程釋放熱量對DNA的損傷。2）異丙醇沉淀除了使DNA沉淀外，還可以溶解少量的小的RNA分子（三）磁珠法：磁珠在高鹽低pH值下吸附核酸，在低鹽高pH值下與核酸分離，再通過移動磁珠來獲取DNA（四）微柱法：利用DNA在高鹽、低pH的特定溶液環(huán)境下可吸附在固相介質（如硅膠膜）上，洗滌去除雜質后，再改變溶液環(huán)境使DNA溶解到純水或TE中（三）、DNA的濃縮

固體聚乙二醇（PEG）濃縮：用透析袋外敷PEG至合適量丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會。因此重復幾次可顯著減少DNA體積（四）、DNA回收

主要是從電泳中分離回收DNA片段回收原則：盡量提高回收率去除回收DNA樣品中的污染物DNA降解的原因樣本不夠新鮮，采集材料過陳舊樣本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因組DNA鹽濃度過高基因組DNA中乙醇未清除凈基因組DNA中可能存在其他抑制因素提取基因組DNA，有時加入蔗糖的原因加入多糖，保護DNA長度影響DNA質量的因素四、RNA的分離與純化

（一）、樣本來源理論上所有有核真核細胞、細菌、病毒都可以提取RNA樣本選擇取決于試驗目的全血是基因組提取RNA最常見的樣本每個細胞的RNA量約為10-5

μg80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA

其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA…組織材料起始樣品量TotalRNA提取量blood1ml15~20μgleukocytes1×107個約100μgLivertissue1g約5000μgCulturecells1×107個約100μgRenaltissue1g約3000μgSkeletontissue1g約1500μgCerebraltissue1g約1500μg（二）、

RNA提取的獨特性

—關于RNase酶臨床標本及實驗室環(huán)境中,存在大量對RNA具有強烈降解作用的RNase，而RNase較耐高溫,不易失活如何避免RNase對標本的污染及防止RNase對提取的RNA的降解,是保證RNA成功提取的關鍵之所在RNase酶RNA易被RNase水解，RNase除胞內還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中RNase具有水解核糖殘基和磷酸二酯鍵RNase分子結構中的二硫鍵使其生物學活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，RNase的活性又可恢復去除RNase的污染及強有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關鍵必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內RNase的活性1.內源性RNA酶（intrinsicRNase）2.外源性RNA酶(extrinsicRNase)主要來源：

被污染的緩沖液細菌或微生物污染，高壓不能去除RNA酶自動移液裝置3.實驗室采取避免RNA酶污染的措施設置專門RNA移液裝置小份保存緩沖液設置專門的RNA電泳裝置準備溶液或緩沖液時，使用無RNA酶的器皿、

DEPC處理水等分離RNA過程中使用RNA酶抑制劑4.RNA酶的去除DEPC（焦碳酸二乙酯）高度活化的烷基化試劑，破壞RNA酶活性。用來滅活緩沖液或器皿中的RNA酶。

OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O==DEPC水制備：0.1%DEPC在37°C處理1h，并高壓滅菌15min。玻璃制品和塑料制品應浸泡在0.1%的DEPC水溶液中，37°C處理1h或室溫下過夜。DEPC非選擇性的修飾蛋白質和RNA，且與一些緩沖液不相容，故在分離和純化RNA的過程中不使用DEPC5.RNA提取所用器皿的處理經(jīng)高壓滅菌的一次性使用的塑料制品如試管,離心管等基本上無RNase,可以不經(jīng)預處理直接用于制備和貯存RNA實驗室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染,使用前必須于180℃干烤8小時以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯,試管和其它用品DEPC是RNase的強烈抑制劑。灌滿DEPC的器皿于37℃下放置2小時，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15分鐘，最后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進行修飾6.RNA提取所用溶液的準備

7.RNA提取中RNase污染的控制實驗操作人員的手是RNase污染最主要的潛在來源。策略是：在準備用于RNA純化的實驗材料和溶液時,以及在涉及RNA的整個提取操作過程中,都應戴一次性手套在RNA提取實驗中，應勤換手套（三）、用于提取RNA的血樣的處理取新鮮抗凝血2－3ml入15ml無菌塑料管，600g離心5分鐘，棄上清。加入6倍細胞體積的紅細胞裂解液（約12ml），輕輕吹打混勻，本步驟在室溫或4度操作均可。裂解時間至4-5分鐘，并且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解。600g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。一般情況下，裂解1次紅細胞應該裂解的差不多，如果有較多紅細胞沒有裂解的話，可以再加點紅細胞裂解液約5ml裂解1次。步驟同3。向得到的細胞團中加Trizol1.0ml，彈勻，將細胞團打散，轉入1.5ml無菌塑料管，封好蓋。標上號，纏上封口膜，－20℃

或－70℃

保存。（四）、RNA提取的常用方法

表面活性劑加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法胍鹽提取結合氯仿-酚抽提法胍鹽提取結合玻璃粉、二氧化硅等顆粒懸浮吸附法等RNA提取實驗前的準備【使用器具】

盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，則使用0