高三生物一輪復(fù)習(xí)基因工程基因工程的基本工具和基本操作程序

第6課時(shí)基因工程的基本工具和基本操作程序1.基因工程的概念別名

技術(shù)操作環(huán)境生物體外操作對(duì)象______操作水平

水平結(jié)果創(chuàng)造出更符合人們需要的新的

和__________重組DNA基因DNA分子生物類型生物產(chǎn)品一、重組DNA技術(shù)的基本工具2.重組DNA技術(shù)的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)黏性末端原核生物數(shù)千特定核苷酸序列磷酸二酯鍵限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？細(xì)菌的限制酶不切割自身DNA,原因是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)自身的限制酶識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行了修飾(如果DNA甲基化),或是不存在該酶的識(shí)別序列以避免被限制酶切割。(2)DNA連接酶磷酸二酯鍵大腸桿菌黏性末端黏性末端與DNA有關(guān)的幾種酶的比較歸納提升(3)載體環(huán)狀雙鏈DNA分子噬菌體有一個(gè)至多個(gè)自我復(fù)制受體DNA標(biāo)記注意

天然的質(zhì)粒一般不完全具備上述條件,往往需要進(jìn)行人工改造后才能用作基因工程載體。2.質(zhì)粒是基因工程中最常用的目的基因運(yùn)載工具。下列有關(guān)敘述正確的是A.質(zhì)粒是只存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中能自主復(fù)制的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子B.在所有的質(zhì)粒上都能找到一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)C.攜帶目的基因的重組質(zhì)粒只有整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上才會(huì)隨

后者的復(fù)制而復(fù)制D.質(zhì)粒上的抗性基因常作為標(biāo)記基因供重組DNA的鑒定和選擇√p365(2)切割圖示中的目的基因和質(zhì)粒應(yīng)選用哪類限制酶？請(qǐng)說明理由。

用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒。限制酶Ⅰ的識(shí)別序列包含限制酶Ⅱ的識(shí)別序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位點(diǎn)，故使用限制酶Ⅱ時(shí)，可在目的基因兩端同時(shí)作切割，從而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割質(zhì)粒，會(huì)同時(shí)破壞質(zhì)粒中的兩個(gè)“標(biāo)記基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒。限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)延伸應(yīng)用圖解限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。延伸應(yīng)用(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。1.DNA的粗提取與鑒定(1)基本原理不溶于2mol/L二苯胺二、DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定(2)操作流程95%沸水1.過濾時(shí)應(yīng)選用紗布而不是濾紙,如果用濾紙可能會(huì)把DNA分子吸附在濾紙上。2.低溫操作能防止DNA酶降解DNA。3.粗提取的DNA可能含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。2.PCR

和擴(kuò)增目的基因a.PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))：是一項(xiàng)根據(jù)

的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種

與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行

的技術(shù)。b.PCR反應(yīng)的條件：一定的

、DNA模板、2種

、4種______

、

DNA聚合酶，以及能自動(dòng)調(diào)控

的儀器。獲取DNA半保留復(fù)制組分大量復(fù)制緩沖溶液引物脫氧核苷酸耐高溫的溫度真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR緩沖溶液中一般要添加Mg2+。c.PCR擴(kuò)增的過程90單鏈50引物72由圖可知,理論上通過三次循環(huán)可以得到目的基因。PCR的結(jié)果(1)合成DNA的數(shù)量:a×2n(a:初始數(shù)量;n:循環(huán)的次數(shù))。(2)合成目的基因的數(shù)量:a×(2n-2n)。思考

PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎?mRNA不可以直接擴(kuò)增,需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。（3）PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用

來鑒定。瓊脂糖凝膠電泳知識(shí)拓展

引物的選擇原則1.引物長度適宜、適量的CG含量(保證有較高的復(fù)性溫度)、引物自身及引物之間不存在互補(bǔ)配對(duì)、引物的3'端必須和DNA模板嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì),5'端不需要與DNA模板嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì),5'端可以修飾。5'端修飾方法作用加入限制酶酶切位點(diǎn)可以利用限制酶切割產(chǎn)生末端,方便基因重組放射性同位素、生物素、熒光素等標(biāo)記物方便擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)增添、缺失或替換部分堿基可以產(chǎn)生定點(diǎn)突變3.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(1)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)①PCR原理：利用了

原理。②電泳：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷

的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳。③PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的

等有關(guān)。DNA的熱變性相反大小和構(gòu)象(2)PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟微量移液器底部離心管(3)DNA的電泳鑒定：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為______的紫外燈下被檢測(cè)出來。300nm針對(duì)訓(xùn)練6.(2022山東,13)粗提取DNA時(shí)的過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解。

(

)7.(2022湖北,5)動(dòng)、植物細(xì)胞DNA的提取必須在無菌條件下進(jìn)行。(

)8.(2022遼寧,12)PCR技術(shù)中的DNA延伸過程無需引物參與即可完成半保留復(fù)制。

(

)9.(2019江蘇,10)用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行水浴加熱。

(

)10.(2022全國乙,38)(1)檢測(cè)病毒RNA(核酸檢測(cè))可以采取RT-PCR法。這種方法的基本原理是先以病毒RNA為模板合成cDNA,這一過程需要的酶是

,再通過PCR技術(shù)擴(kuò)增相應(yīng)的DNA片段。(2)為了確保病毒核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性,在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)必須依據(jù)病毒RNA中的

來進(jìn)行。PCR過程每次循環(huán)分為3步,其中溫度最低的一步是

?！??√逆轉(zhuǎn)錄酶特異性核苷酸序列復(fù)性11.(2020山東,25)為檢測(cè)啟動(dòng)子變化對(duì)Wx基因表達(dá)的影響,科研人員需要檢測(cè)Wx基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA(Wx

mRNA)的量。檢測(cè)時(shí)分別提取各品系胚乳中的總RNA,經(jīng)

過程獲得總cD-NA。通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地?cái)U(kuò)增出Wx基因的cDNA,原因是

。逆轉(zhuǎn)錄引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或:引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)12.(2019全國Ⅰ,38)基因工程中可以通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因?；卮鹣铝袉栴}。(1)生物體細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時(shí),解開DNA雙鏈的酶是

。在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí),使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是

。上述兩個(gè)解鏈過程的共同點(diǎn)是破壞了DNA雙鏈分子中的

。(2)目前在PCR中使用TaqDNA聚合酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是

。解旋酶加熱至90~95℃氫鍵TaqDNA聚合酶熱穩(wěn)定性高,而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會(huì)失活13.(2018江蘇,32)(1)為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接,需在引物的

端加上限制性酶切位點(diǎn),且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn),主要目的是

。(2)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí),反應(yīng)的溫度和時(shí)間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定,下列選項(xiàng)中

的設(shè)定與引物有關(guān),

的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長度有關(guān)。(填序號(hào))①變性溫度②復(fù)性溫度③延伸溫度④變性時(shí)間⑤復(fù)性時(shí)間⑥延伸時(shí)間使DNA片段能定向插入表達(dá)載體,減少自連5'②

⑥

15.如圖為RBD基因結(jié)構(gòu)和引物位置示意圖,若利用PCR擴(kuò)增含有限制酶酶切位點(diǎn)的RBD基因時(shí),應(yīng)選擇的引物為

。

14.如圖,應(yīng)選擇引物

擴(kuò)增目的基因。甲和丙引物4和引物51.目的基因的篩選與獲取(1)目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞

或獲得預(yù)期

等的基因。(2)篩選合適的目的基因①從相關(guān)的已知

的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。②利用

和序列比對(duì)工具進(jìn)行篩選。性狀表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能清晰序列數(shù)據(jù)庫三、基因工程的基本操作程序2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因

，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。(2)基因表達(dá)載體的組成及作用在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代啟動(dòng)子標(biāo)記基因知識(shí)歸納

1.有時(shí)為了滿足需要,會(huì)在載體中人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí),可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。2.構(gòu)建乳腺生物反應(yīng)器的表達(dá)載體時(shí),重組表達(dá)載體中需含有在乳腺中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子,以便目的基因在乳腺中特異性表達(dá),從而可在動(dòng)物的乳汁中獲得目的蛋白。?易混易錯(cuò)

啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比

啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子位置DNADNAmRNAmRNA目的基因上游目的基因下游編碼序列首端三個(gè)堿基編碼序列尾端三

個(gè)堿基作用RNA聚合酶識(shí)別

和結(jié)合的部位,起

始基因的轉(zhuǎn)錄使轉(zhuǎn)錄停止翻譯的起始信號(hào)(編碼氨基酸:甲硫氨酸)翻譯的結(jié)束信號(hào)

(不編碼氨基酸)構(gòu)建過程

疑難探究思考構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),常使用兩種不同的限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒,該過程不使用同一

種限制酶的原因是什么?提示防止目的基因自身環(huán)化和質(zhì)粒自身環(huán)化,保證目的基因與質(zhì)粒正確連接。因?yàn)橥N限制酶酶

切產(chǎn)生的末端相同,會(huì)產(chǎn)生正連和反連(反連時(shí),目的基因的轉(zhuǎn)錄從下游到上游,導(dǎo)致密碼子改變,不

能翻譯出正確的蛋白質(zhì))的情況,增大篩選正確重組載體的工作量。正連和反連圖示如下:

方法技巧

圖乙結(jié)合圖甲、圖乙可知:最宜選用BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切。注:若用Ti質(zhì)粒,目的基因必須插入T-DNA序列。圖甲3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類植物動(dòng)物微生物常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、____________顯微注射法

處理法受體細(xì)胞_______________________原核細(xì)胞花粉管通道法體細(xì)胞或受精卵受精卵Ca2＋轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2＋處理細(xì)胞→細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)