血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控及膜聯(lián)蛋白A7促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自噬作用的研究

血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控及膜聯(lián)蛋白A7促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自噬作用的研究一、本文概述血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞內(nèi)自我消化和循環(huán)利用的過程，對于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)血管健康以及預(yù)防心血管疾病具有重要意義。近年來，隨著對自噬機(jī)制的深入研究，血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制逐漸成為研究的熱點(diǎn)。本文旨在探討血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制，并重點(diǎn)研究膜聯(lián)蛋白A7（AnnexinA7，AnxA7）對內(nèi)皮細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用。本文將系統(tǒng)回顧血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的基本概念和調(diào)控機(jī)制，包括自噬的分子信號通路、關(guān)鍵調(diào)控因子以及自噬與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的關(guān)系。通過文獻(xiàn)綜述和實(shí)驗(yàn)研究，分析膜聯(lián)蛋白A7在內(nèi)皮細(xì)胞自噬過程中的作用及其分子機(jī)制。膜聯(lián)蛋白A7作為一種重要的細(xì)胞膜蛋白，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和自噬等過程中發(fā)揮重要作用。本文將通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證膜聯(lián)蛋白A7對內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控作用，并深入探討其可能的作用機(jī)制和生物學(xué)意義。本文還將對血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬調(diào)控的未來研究方向進(jìn)行展望，以期為心血管疾病的預(yù)防和治療提供新的思路和方法。通過深入研究血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制以及膜聯(lián)蛋白A7在其中的作用，有望為心血管疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。二、文獻(xiàn)綜述自噬是一種在進(jìn)化上保守的細(xì)胞內(nèi)降解和再利用蛋白質(zhì)或細(xì)胞器的過程，對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)環(huán)境變化具有重要意義。近年來，自噬在多種生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是在心血管疾病的研究中受到了廣泛關(guān)注。血管內(nèi)皮細(xì)胞，作為血液與血管壁之間的界面，不僅具有屏障功能，還參與了眾多的血管生物學(xué)過程，包括血管生成、炎癥反應(yīng)和血管通透性調(diào)節(jié)等。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬活動(dòng)對于維持血管穩(wěn)態(tài)和預(yù)防心血管疾病的發(fā)生具有關(guān)鍵作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬調(diào)控涉及多個(gè)信號通路和分子機(jī)制。例如，PI3K/Akt/mTOR信號通路是自噬調(diào)控的經(jīng)典途徑，通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因（ATGs）的表達(dá)，影響自噬體的形成和成熟。AMPK、p53等信號分子也在內(nèi)皮細(xì)胞自噬調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。這些信號通路和分子的異常表達(dá)或功能失調(diào)，可能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞自噬功能障礙，進(jìn)而參與心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。膜聯(lián)蛋白A7（AnnexinA7，AnxA7）是一種多功能蛋白，廣泛分布于各種細(xì)胞類型中。近年來，越來越多的研究表明，AnxA7參與了細(xì)胞自噬的調(diào)控過程。AnxA7可以通過與自噬相關(guān)蛋白的相互作用，影響自噬體的形成和降解。例如，AnxA7可以與Beclin1相互作用，促進(jìn)自噬體的形成；同時(shí)，AnxA7還可以與LC3相互作用，參與自噬體的降解過程。這些研究表明，AnxA7在細(xì)胞自噬中發(fā)揮著重要作用。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，AnxA7對自噬的調(diào)控作用尤為顯著。研究發(fā)現(xiàn)，AnxA7可以通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的自噬活動(dòng)。AnxA7還可以通過與自噬相關(guān)蛋白的相互作用，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞自噬體的形成和降解。這些作用不僅有助于維持內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，還可能在預(yù)防心血管疾病中發(fā)揮重要作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過程，涉及多個(gè)信號通路和分子機(jī)制。AnxA7作為一種重要的自噬調(diào)控分子，在血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。深入研究AnxA7在血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬調(diào)控中的具體機(jī)制，將有助于我們更好地理解心血管疾病的發(fā)病機(jī)制，為預(yù)防和治療心血管疾病提供新的思路和方法。三、材料與方法本研究使用的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）購自于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。細(xì)胞在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（EBM-2）中，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。膜聯(lián)蛋白A7（AnnexinA7）的特異性抑制劑、自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（Rapamycin）、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）以及WesternBlot所需抗體等均購自Sigma-Aldrich公司。流式細(xì)胞儀（BDBiosciences）、倒置顯微鏡（Nikon）、WesternBlot電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備（Bio-Rad）、定量PCR儀（AppliedBiosystems）等。將HUVECs以適當(dāng)密度接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁生長至約80%融合度時(shí)，進(jìn)行不同處理。對照組加入等體積的溶劑（DMSO）；實(shí)驗(yàn)組分別加入膜聯(lián)蛋白A7的特異性抑制劑、Rapamycin或3-MA，以觀察其對內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響。收集處理后的細(xì)胞，提取總蛋白。通過SDS電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以自噬相關(guān)蛋白LCBeclin1等作為檢測對象，使用特異性抗體進(jìn)行WesternBlot分析，以評估自噬水平的變化。收集處理后的細(xì)胞，提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以特異性引物進(jìn)行定量PCR檢測，分析自噬相關(guān)基因（如ATGATG7等）的表達(dá)變化。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測自噬流的變化。將處理后的細(xì)胞與熒光標(biāo)記的自噬底物（如GFP-LC3）共孵育，通過流式細(xì)胞儀檢測熒光信號的變化，以評估自噬流的情況。所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P<05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果為了深入了解血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制，我們采用了多種實(shí)驗(yàn)方法。通過WesternBlot分析，我們發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白LC3-II在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平隨著自噬誘導(dǎo)劑的處理而顯著增加，這表明自噬過程被成功激活。同時(shí)，我們還觀察到自噬抑制劑處理后，LC3-II的表達(dá)水平明顯降低，說明自噬過程被有效抑制。進(jìn)一步，我們利用透射電子顯微鏡觀察了血管內(nèi)皮細(xì)胞在自噬過程中的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，自噬誘導(dǎo)劑處理后的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了大量的自噬體，而自噬抑制劑處理后的細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量明顯減少。這些結(jié)果從形態(tài)學(xué)上證實(shí)了自噬過程的調(diào)控效果。為了研究膜聯(lián)蛋白A7對內(nèi)皮細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用，我們在實(shí)驗(yàn)中過表達(dá)了膜聯(lián)蛋白A7。通過WesternBlot分析，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)膜聯(lián)蛋白A7后，LC3-II的表達(dá)水平顯著升高，說明自噬過程被促進(jìn)。同時(shí)，我們還觀察到過表達(dá)膜聯(lián)蛋白A7的細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量也明顯增加。為了進(jìn)一步驗(yàn)證膜聯(lián)蛋白A7對自噬的促進(jìn)作用，我們還進(jìn)行了膜聯(lián)蛋白A7敲除實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，敲除膜聯(lián)蛋白A7后，LC3-II的表達(dá)水平明顯降低，自噬體數(shù)量也顯著減少。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了膜聯(lián)蛋白A7對內(nèi)皮細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬過程可以被有效調(diào)控，并且膜聯(lián)蛋白A7在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮著重要作用。這些發(fā)現(xiàn)為深入研究血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制以及膜聯(lián)蛋白A7在其中的作用提供了重要依據(jù)。五、討論與結(jié)論本研究旨在深入探討血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制以及膜聯(lián)蛋白A7（AnnexinA7，ANA7）在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自噬過程中的作用。通過一系列實(shí)驗(yàn)，我們獲得了有關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞自噬調(diào)控的新認(rèn)識，并揭示了ANA7在內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的重要作用。討論部分，我們首先回顧了血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制。自噬是一種高度保守的細(xì)胞過程，負(fù)責(zé)清除受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，自噬的調(diào)控對于維持血管功能至關(guān)重要。我們的研究發(fā)現(xiàn)，某些信號通路和分子在調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)有助于我們更深入地理解內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。接著，我們重點(diǎn)討論了ANA7在內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的作用。ANA7作為一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，已被報(bào)道在多種細(xì)胞中參與自噬過程。本研究發(fā)現(xiàn)，ANA7在內(nèi)皮細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮促進(jìn)作用，可能通過調(diào)控自噬相關(guān)基因和信號通路來實(shí)現(xiàn)。這一發(fā)現(xiàn)為我們提供了一種新的視角來理解內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制，并為未來的研究提供了新的方向。結(jié)論部分，我們總結(jié)了本研究的主要發(fā)現(xiàn)和意義。我們的研究揭示了血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制，為深入理解內(nèi)皮細(xì)胞自噬的生物學(xué)功能提供了依據(jù)。我們發(fā)現(xiàn)ANA7在內(nèi)皮細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮重要作用，這一發(fā)現(xiàn)為探索內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控提供了新的靶點(diǎn)。我們的研究為未來的研究提供了新的思路和方法，有助于推動(dòng)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬領(lǐng)域的研究進(jìn)展。本研究通過深入探討血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制以及ANA7在內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的作用，為理解內(nèi)皮細(xì)胞自噬的生物學(xué)功能提供了新的視角。這些發(fā)現(xiàn)對于未來的研究具有重要的指導(dǎo)意義，有望為內(nèi)皮細(xì)胞自噬相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供新的思路和方法。七、致謝在此，我要向所有在本研究過程中給予我?guī)椭椭С值娜吮硎局孕牡母兄x。我要感謝我的導(dǎo)師，他的悉心指導(dǎo)和無私奉獻(xiàn)，使我在科研道路上不斷前行，對血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控及膜聯(lián)蛋白A7促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自噬作用的研究有了更深入的理解。他的嚴(yán)謹(jǐn)治學(xué)態(tài)度和科研精神，將永遠(yuǎn)是我學(xué)習(xí)的榜樣。同時(shí)，我要感謝實(shí)驗(yàn)室的同學(xué)們，他們在實(shí)驗(yàn)過程中給予我無私的幫助和支持，我們共同面對挑戰(zhàn)，分享成功的喜悅，這段經(jīng)歷將成為我人生中寶貴的財(cái)富。我還要感謝學(xué)校提供的優(yōu)秀科研平臺和資源，使我能夠順利完成這項(xiàng)研究。同時(shí)，我也要感謝所有參考文獻(xiàn)的作者們，他們的研究成果為我提供了重要的啟示和借鑒。我要感謝我的家人和朋友，他們的鼓勵(lì)和支持是我不斷前行的動(dòng)力。在我遇到困難和挫折時(shí)，他們總是給予我最大的理解和鼓勵(lì)，讓我能夠堅(jiān)定信心，繼續(xù)前行。在此，我再次向所有幫助和支持我的人表示最誠摯的感謝。未來，我將繼續(xù)努力，為科研事業(yè)做出更大的貢獻(xiàn)。參考資料：細(xì)胞自噬是一種生物過程，其通過分解和循環(huán)利用細(xì)胞內(nèi)組件以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和健康。近年來，細(xì)胞自噬的研究已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展，這一領(lǐng)域的研究者們正逐步揭示自噬的復(fù)雜機(jī)制和其在生物體中的重要作用。我們先簡單介紹一下細(xì)胞自噬的基本概念。自噬是源自希臘語的“autophagy”（自我吞噬）一詞，它描述的是細(xì)胞吞噬自身的過程。在這一過程中，細(xì)胞內(nèi)部的雙層膜結(jié)構(gòu)將目標(biāo)物質(zhì)包圍，形成自噬體，然后與溶酶體融合，最終被分解為氨基酸、脂肪酸和其他可再利用的分子。這些分子可以被細(xì)胞重新利用，或者通過分泌和溶質(zhì)形式排出體外。近年來，科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)自噬在許多生物學(xué)過程中起著關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞發(fā)育、免疫應(yīng)答、抗癌和抗衰老等。例如，在免疫應(yīng)答中，自噬可以處理并降解入侵的病原體，幫助清除體內(nèi)的微生物感染。自噬也與抗癌有關(guān)，它可以通過降解有害的突變蛋白和受損細(xì)胞器，防止腫瘤的形成和發(fā)展。然而，細(xì)胞自噬的研究還面臨許多挑戰(zhàn)。例如，我們還需要更深入地理解自噬的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和其在各種生物學(xué)條件下的作用。盡管有許多藥物被設(shè)計(jì)為自噬調(diào)節(jié)劑，但它們的特定作用機(jī)制和副作用仍需進(jìn)一步研究。細(xì)胞自噬是一個(gè)復(fù)雜且重要的生物學(xué)過程，它在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、免疫應(yīng)答和抗癌等方面起著關(guān)鍵作用。隨著我們對自噬機(jī)制的深入理解和藥物的開發(fā)，我們有望在未來更好地利用自噬來治療和預(yù)防一些嚴(yán)重的疾病，包括癌癥和神經(jīng)退行性疾病等。盡管還有許多挑戰(zhàn)需要克服，但我們對細(xì)胞自噬的理解已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)步，我們對未來的研究充滿了希望。細(xì)胞自噬（autophagy）一詞來自希臘單詞auto-，意思是“自己的”，以及phagein，意思是“吃”。所以，細(xì)胞自噬的意思就是“吃掉自己”。細(xì)胞自噬是真核生物中進(jìn)化保守的對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要過程。該過程中一些損壞的蛋白或細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，送入溶酶體（動(dòng)物）或液泡（酵母和植物）中進(jìn)行降解并得以循環(huán)利用。雖然人們早就知道自噬存在，但是只有在大隅良典的精巧實(shí)驗(yàn)之后，人們才意識到它的機(jī)制、懂得了它的重要性。諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)表彰的成就是發(fā)現(xiàn)并闡釋了細(xì)胞自噬的機(jī)理，而細(xì)胞自噬過程是細(xì)胞成分降解和回收利用的基礎(chǔ)。這一概念最早提出于20世紀(jì)60年代，當(dāng)時(shí)研究者們首次觀察到，細(xì)胞會胞內(nèi)成分包裹在膜中形成囊狀結(jié)構(gòu)，并運(yùn)輸?shù)揭粋€(gè)負(fù)責(zé)回收利用的小隔間（名叫“溶酶體”）里，從而降解這些成分。研究這種現(xiàn)象困難重重，人們對其一直所知甚少，直到20世紀(jì)90年代早期，大隅良典做了一系列精妙的實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，他利用面包酵母定位了細(xì)胞自噬的關(guān)鍵基因。之后，他進(jìn)一步闡釋了酵母細(xì)胞自噬背后的機(jī)理，并證明人類細(xì)胞也遵循類似的巧妙機(jī)制。大隅良典的發(fā)現(xiàn)是人類理解細(xì)胞如何循環(huán)利用自身物質(zhì)的典范。他的發(fā)現(xiàn)為理解諸多生化過程——例如適應(yīng)饑餓以及對感染的免疫應(yīng)答——中細(xì)胞自噬的重要性打開了一扇窗。細(xì)胞自噬基因突變會導(dǎo)致疾病，在嚴(yán)重的疾病包括癌癥以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病中都包含了細(xì)胞自噬過程。20世紀(jì)50年代中期，科學(xué)家觀察到細(xì)胞里的一個(gè)新的專門“小隔間”（這種隔間的學(xué)名是細(xì)胞器），包含消化蛋白質(zhì)，碳水化合物和脂質(zhì)的酶。這個(gè)專門隔間被稱作“溶酶體”，相當(dāng)于降解細(xì)胞成分的工作站。比利時(shí)科學(xué)家克里斯汀·德·迪夫（ChristiandeDuve）在1974年因?yàn)槿苊阁w和過氧化物酶體的發(fā)現(xiàn)，被授予諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。克里斯汀·德·迪夫，1974年獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，“自噬”這個(gè)詞的命名人。60年代的新觀察表明，在溶酶體內(nèi)部有時(shí)可以找到大量的細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)，乃至整個(gè)的細(xì)胞器。因此，細(xì)胞似乎有將大量的物質(zhì)傳輸進(jìn)溶酶體的策略。進(jìn)一步的生化和顯微分析發(fā)現(xiàn)，有一種新型的囊泡負(fù)責(zé)運(yùn)輸細(xì)胞貨物進(jìn)入溶酶體進(jìn)行降解（圖1）。發(fā)現(xiàn)溶酶體的科學(xué)家迪夫，創(chuàng)造了自噬（auotophagy）這個(gè)詞來描述這一過程。這種新的囊泡被命名為自噬體。我們的細(xì)胞有不同的細(xì)胞“小隔間”，承擔(dān)不同的作用。溶酶體就是這樣一種隔間，里面有用于消化細(xì)胞內(nèi)容物的消化酶。人們在細(xì)胞內(nèi)又觀察到了一種新型的囊泡，叫做自噬體。自噬體形成的時(shí)候，逐漸吞沒細(xì)胞內(nèi)容物，例如受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器；然后它與溶酶體相融，其中的內(nèi)容被降解成更小的物質(zhì)成分。這一過程為細(xì)胞提供了自我更新所需的營養(yǎng)和材料。在20世紀(jì)70年代和80年代，研究人員集中研究闡明用于降解蛋白質(zhì)的另一個(gè)系統(tǒng)，即“蛋白酶體”。在這一研究領(lǐng)域，阿龍·切哈諾沃（AaronCiechanover），阿夫拉姆·赫什科（AvramHershko）和歐文·羅斯（IrwinRose）因?yàn)椤胺核亟閷?dǎo)的蛋白質(zhì)降解的發(fā)現(xiàn)”被授予2004年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。蛋白酶體降解蛋白質(zhì)的效率很高，一個(gè)個(gè)單個(gè)降解蛋白質(zhì)，但這個(gè)機(jī)制沒有解釋細(xì)胞是怎么解決更大的蛋白質(zhì)復(fù)合物以及破舊的細(xì)胞器的。自噬過程可以提供這個(gè)答案嗎？如果可以的話，其中的機(jī)制又是什么樣的呢？2016年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主大隅良典曾經(jīng)活躍于多個(gè)研究領(lǐng)域，但自從1988年建立了自己的實(shí)驗(yàn)室之后，他就主要研究蛋白質(zhì)在液泡中降解的過程了。液泡也是一種細(xì)胞器，它在酵母中的地位和人體中溶酶體的地位類似。酵母細(xì)胞相對更容易進(jìn)行研究，因而常被用作人類細(xì)胞的模型；尋那些在復(fù)雜細(xì)胞通路中發(fā)揮重要作用的基因時(shí)，酵母特別有用。但大隅面臨著一個(gè)重大挑戰(zhàn)：酵母細(xì)胞很小，在顯微鏡下不容易看清它的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，因此他起初都無法確定自噬現(xiàn)象是否也會發(fā)生在酵母細(xì)胞中。大隅推論，如果他能在自噬行為發(fā)生的時(shí)候阻斷液泡中蛋白質(zhì)分解的過程，那么自噬體將在液泡中累積，從而在顯微鏡下可見。因此，他培育出因突變而缺乏液泡降解酶的酵母細(xì)胞，并通過使細(xì)胞饑餓激發(fā)自噬。實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常驚人！幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，液泡中就充滿了細(xì)小的、未被降解的囊泡（見圖2），這些囊泡就是自噬體。大隅的實(shí)驗(yàn)證明酵母細(xì)胞中也存在自噬現(xiàn)象，然而更重要的是，他發(fā)現(xiàn)了一種方法，能夠識別和鑒定涉及這些過程的關(guān)鍵基因。這是一項(xiàng)重大的突破，大隅在1992年發(fā)表了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖2：在酵母細(xì)胞中（圖2左圖），有一個(gè)大型結(jié)構(gòu)叫做液泡，對應(yīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的溶酶體。大隅培養(yǎng)出缺乏液泡降解酶的酵母，當(dāng)這些酵母細(xì)胞饑餓的時(shí)候，自噬體就會在液泡中迅速累積（圖2中圖）。他的實(shí)驗(yàn)證明了自噬現(xiàn)象也存在于酵母細(xì)胞中。接下來，大隅研究了上千種酵母細(xì)胞的突變型（圖2右圖），識別出15種和自噬有關(guān)的關(guān)鍵基因。大隅良典接著利用了他改造過的酵母菌株——在這些酵母挨餓時(shí)，它們的自噬體會積累起來。如果對自噬過程重要的基因被失活，那么自噬體積累就理應(yīng)不會發(fā)生。大隅良典將酵母細(xì)胞暴露在一種能隨機(jī)在多個(gè)基因里引起突變的藥物中，然后誘導(dǎo)自噬過程。他的策略奏效了！在他發(fā)現(xiàn)酵母自噬一年內(nèi)，大隅良典就鑒定出了第一批對自噬至關(guān)重要的基因。在接下來的眾多巧妙研究中，他對這些基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，自噬過程是由大量蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物所控制的。每種蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)調(diào)控自噬體啟動(dòng)與形成的不同階段。在識別出酵母自噬的機(jī)制之后，依然還有一個(gè)關(guān)鍵問題。其他的生物里有沒有對應(yīng)的機(jī)制來控制自噬過程呢？很快人們發(fā)現(xiàn)，我們細(xì)胞里也有幾乎一樣的機(jī)制在運(yùn)行?，F(xiàn)在我們有了探索人體內(nèi)細(xì)胞自噬所必需的研究工具。在大隅良典發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵機(jī)制之后，研究局面豁然開朗，相關(guān)論文發(fā)表量驟然上升。由于大隅良典和緊隨他步伐的研究者的工作，我們現(xiàn)在知道細(xì)胞自噬控制著許多重要的生理功能，涉及到細(xì)胞部件的降解和回收利用。細(xì)胞自噬能快速提供燃料供應(yīng)能量，或者提供材料來更新細(xì)胞部件，因此在細(xì)胞面對饑餓和其它種類的應(yīng)激時(shí)，它發(fā)揮著不可或缺的作用。在遭受感染之后，細(xì)胞自噬能消滅入侵的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌活病毒。自噬對胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化也有貢獻(xiàn)。細(xì)胞還能利用自噬來消滅受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，這個(gè)質(zhì)檢過程對于抵抗衰老帶來的負(fù)面影響有舉足輕重的意義。遭到擾亂的自噬過程與帕金森氏病、2型糖尿病和老年人體內(nèi)其他疾病都有所關(guān)聯(lián)。自噬基因的突變可以導(dǎo)致遺傳病，自噬機(jī)制受到的擾亂還與癌癥有關(guān)。目前人們正在進(jìn)行緊張的研究以開發(fā)藥物，能夠在各種疾病中影響自噬機(jī)制。人們知道自噬機(jī)制的存在已經(jīng)50年，但是它在生理學(xué)和醫(yī)學(xué)中的核心重要性只有在大隅良典20世紀(jì)90年代開拓性的研究之后才被人們廣泛意識到。因?yàn)檫@些重要發(fā)現(xiàn)，他獲得了2016年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。細(xì)胞自噬主要有三種形式：微自噬（microautophagy）、巨自噬（macroautophagy）和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（Chaperone-mediatedautophagy，CMA）。作用時(shí)間：多在種子成熟時(shí)儲藏蛋白的沉積或萌發(fā)時(shí)儲存蛋白的降解中起作用。定義：在其過程中，底物蛋白被一種雙層膜的結(jié)構(gòu)（粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜）包裹后形成直徑約400~900納米大小的自噬小泡（autophagosome），接著自噬小泡的外膜與溶酶體膜或者液泡膜融合，釋放包裹底物蛋白的泡狀結(jié)構(gòu)到溶酶體或者液泡中，并最終在一系列水解酶的作用下將其降解，我們將這種進(jìn)入溶酶體或者液泡腔中的泡狀結(jié)構(gòu)稱為自噬小體。作用時(shí)間：營養(yǎng)缺乏條件下培養(yǎng)的細(xì)胞、植物的免疫反應(yīng)、葉片衰老及環(huán)境脅迫應(yīng)答。在動(dòng)物細(xì)胞衰老反應(yīng)過程中，往往發(fā)生分子伴侶介導(dǎo)的自噬過程，保存必須的組成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白和其他材料。(1)BredeldinA/Thapsigargin/Tunicamycin：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(2)Carbamazepine/L-690，330/LithiumChloride（氯化鋰）：IMPase抑制劑（即Inositolmonophosphatase，肌醇單磷酸酶）(4)N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：ClassIPI3KPathway抑制劑(1)3-Methyladenine（3-MA）：（ClassIIIPI3K）hVps34抑制劑(3)Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomallumenalkalizer（溶酶體腔堿化劑）除了選用上述工具藥外，一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對自噬相關(guān)基因進(jìn)行干預(yù)：包括反義RNA干擾技術(shù)（Knockdown）、突變株篩選、外源基因?qū)氲?。?xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后，需對自噬過程進(jìn)行觀察和檢測，常用的策略和技術(shù)有：由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體（AV1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體（AV2）的特征為：單層膜，胞漿成分已降解。（autophagicvacuole，AV）由于電鏡耗時(shí)長，不利于監(jiān)測（Monitoring）自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。無自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過計(jì)數(shù)來評價(jià)自噬活性的高低。利用WesternBlot檢測LC3-II/I比值的變化以評價(jià)自噬形成自噬形成時(shí)，胞漿型LC3（即LC3-I）會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。（注意：LC3抗體對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。方法2和3需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。）MDC（Monodansylcadaverine，單丹磺酰尸胺）染色：包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。CellTrackerTMGreen染色：主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。在研究自噬相關(guān)蛋白時(shí)，需對其進(jìn)行定位。由于自噬體與溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體關(guān)系密切，為了區(qū)別，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位：LysoTrackerTM探針：有紅或藍(lán)色可選，顯示所有酸性液泡。pDsRed2-mito：載體，轉(zhuǎn)染后表達(dá)一個(gè)融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號），可用來檢測線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）。MitoTraker探針：特異性顯示活的線粒體，熒光在經(jīng)過固定后還能保留。加州大學(xué)圣地亞哥分校的管坤良教授領(lǐng)導(dǎo)的一支研究團(tuán)隊(duì)揭示了調(diào)控細(xì)胞自噬的一個(gè)關(guān)鍵分子機(jī)制，研究人員發(fā)現(xiàn)，AMPK酶，不僅參與了細(xì)胞的傳感和能量調(diào)控，而且在細(xì)胞自噬酶作用方面，也扮演了重要角色。細(xì)胞自噬是細(xì)胞在惡劣條件下確保其生存的基本應(yīng)激反應(yīng)。研究人員發(fā)現(xiàn)，AMPK能以不同的方式，調(diào)控一種稱為Vps34激酶家族不同的復(fù)合物，一些Vps34酶參與了正常細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸——細(xì)胞中一種重要的分子運(yùn)輸，還有一些Vps34復(fù)合物則參與了細(xì)胞自噬。管教授與其同事們發(fā)現(xiàn)，AMPK能抑制那些未參與細(xì)胞自噬的酶，而激活參與細(xì)胞自噬的Vps34酶。細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老一樣，是十分重要的生物學(xué)現(xiàn)象，參與生物的發(fā)育、生長等多種過程。細(xì)胞自噬的異常導(dǎo)致癌細(xì)胞的出現(xiàn)。內(nèi)皮細(xì)胞也稱為血管內(nèi)皮細(xì)胞，通常指襯于心、血管和淋巴管內(nèi)表面的單層扁平上皮，它形成血管的內(nèi)壁。它們具有吞噬異物、細(xì)菌、壞死和衰老的組織，還參與機(jī)體免疫活動(dòng)功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞通常指襯于心、血管和淋巴管內(nèi)表面的單層扁平上皮，也稱內(nèi)皮細(xì)胞。在炎癥時(shí)高表達(dá)黏附分子，與血流中白細(xì)胞表面黏附分子相互作用，從而介導(dǎo)白細(xì)胞穿越血管壁。亦屬一類非專