細胞工程課件

細胞工程

Cellengineering

緒論提要

細胞工程的主要研究內(nèi)容和技術細胞工程的發(fā)展簡史細胞工程的操作對象細胞工程的基本技術在生物工程中的地位及與其他工程的關系細胞工程簡介概念：細胞工程是按照一定的設計方案，通過在細胞、亞細胞或組織水平上進行實驗操作，獲得重構的細胞、組織、器官以及個體，創(chuàng)造優(yōu)良品種和產(chǎn)品的綜合性生物工程。其操作對象是細胞和組織基本技術是細胞和組織培養(yǎng)

細胞工程簡介類型:

按生物類型：動物細胞工程、植物細胞工程、微生物細胞工程按實驗操作對象細胞與組織培養(yǎng)、細胞融合、細胞核移植、染色體操作、轉(zhuǎn)基因生物細胞工程主要研究內(nèi)容和技術細胞培養(yǎng)(cellculture)與組織培養(yǎng)(tissueculture)

生物細胞和組織在離體條件下的生長和增殖，屬于體外培養(yǎng)(invitroculture)

細胞培養(yǎng)：細胞的離體培養(yǎng)組織培養(yǎng)：組織的離體培養(yǎng)細胞工程主要研究內(nèi)容和技術細胞融合(cellfusion)

又稱細胞雜交(cellhybridization)：是指兩個或兩個以上的細胞融合形成一個細胞的過程。細胞工程主要研究內(nèi)容和技術細胞核移植(nucleartransplantation)：利用顯微操作技術將細胞核與細胞質(zhì)分離，再將不同來源的細胞核與質(zhì)重組，形成雜種細胞。細胞工程主要研究內(nèi)容和技術染色體工程(chromosomeengineering)：把單個的染色體或染色體組轉(zhuǎn)入或移出受體細胞，從而形成新的染色體組合和遺傳構成。細胞工程主要研究內(nèi)容和技術胚胎工程(embryonicenginering)：以生殖細胞或胚胎細胞為對象進行的細胞工程操作。主要包括體外受精、胚胎移植、胚胎切割等。細胞工程主要研究內(nèi)容和技術干細胞與組織工程干細胞(stemcell)：動物體內(nèi)具有分化潛能、并能自我更新的細胞，分胚胎干細胞、組織干細胞。胚胎干細胞：來自囊胚期的內(nèi)細胞團，屬于全能干細胞，每個細胞都可以發(fā)育為一個完整個體。組織干細胞：存在于成體組織中，數(shù)量少，屬于單能或多能干細胞，可以定向分化為一種或幾種不同的組織。細胞工程主要研究內(nèi)容和技術組織工程：在干細胞基礎上發(fā)展起來的，將干細胞與材料科學相結合，將自體或異體組織的干細胞經(jīng)體外擴增后種植在預先構建好的聚合物骨架上，在適宜的生長條件下干細胞沿聚合物骨架遷移、鋪展、生長和分化，最終發(fā)育形成具有特定形態(tài)及功能的工程組織，如人工軟骨、皮膚等。細胞工程主要研究內(nèi)容和技術植物中的干細胞即胚性細胞：合子早期胚胎細胞頂端分生組織中的胚性細胞成熟器官中遺留的胚性細胞細胞工程主要研究內(nèi)容和技術轉(zhuǎn)基因生物與生物反應器轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal)：通過基因工程技術將外源的目的基因?qū)肷臣毎蛟缙谂咛?，并整合到受體細胞的基因組中，經(jīng)發(fā)育形成所有細胞都包含目的基因的動物個體。動物生物反應器(animalbioreactor)：將目的基因在器官或組織中進行特異性高表達的轉(zhuǎn)基因動物。細胞工程主要研究內(nèi)容和技術轉(zhuǎn)基因植物(transgenicplant)：通過基因工程技術將外源的目的基因?qū)胫参锛毎笾苯舆M行誘導培養(yǎng)就可以再生出轉(zhuǎn)基因植物。當這些轉(zhuǎn)基因植物開花結果時，所改變的遺傳性狀就可以通過種子遺傳給下一代植物。

細胞工程的發(fā)展史細胞與組織培養(yǎng)細胞工程的發(fā)展史細胞與組織培養(yǎng)

細胞工程的發(fā)展史細胞與組織培養(yǎng)

1958年Steward由胡蘿卜的韌皮部組織誘導培養(yǎng)成功獲得了再生植株。細胞工程的發(fā)展史細胞融合細胞工程的發(fā)展史細胞核移植1938年，德國胚胎學家Spemann認為早期胚胎細胞具有高度的分化潛能，將胚胎的細胞核移植到去核卵母細胞中可以發(fā)育為新的胚胎。1952年，Briggs和Kings將非洲豹蛙囊胚的細胞核移入去核的卵母細胞中，獲得了非洲豹蛙的胚胎克隆后代。細胞工程的發(fā)展史——轉(zhuǎn)基因生物1974年，Jaenisch和Mintz向小鼠囊胚注射SV40DNA后，在發(fā)育成的小鼠部分組織中檢測到SV40的DNA序列。Gordon通過向小鼠的單細胞胚胎的原核注射純化的DNA后獲得第一只轉(zhuǎn)基因動物1983年，Palmiter、Brinster將大鼠生長激素基因轉(zhuǎn)入小鼠，生產(chǎn)出生長速度極快的超級小白鼠。

植物細胞工程1904年Hanning利用含糖、無機鹽、氨基酸和植物提取物的培養(yǎng)基，使胡蘿卜和辣根菜的未成熟胚在體外發(fā)育成熟。1934年White和Gauthieret利用含有無機鹽、葡萄糖、酵母提取液物的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)離體的三毛柳、黑柳的形成層細胞，成功地誘導出愈傷組織。

植物細胞工程1937年White用煙草的莖段形成層細胞和胡蘿卜根的小塊組織，成功誘導出愈傷組織。1941年荷蘭J.vanOverbeek在愈傷組織培養(yǎng)基中補加椰子乳汁，證實能促進其他種類細胞的分裂和生長。1948年崔徵發(fā)現(xiàn)嘌呤和生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件。

植物細胞工程1954年Wisconsin的Skoog發(fā)現(xiàn)DNA降解產(chǎn)物中含有細胞分裂和生長的活性物質(zhì)-激動素。1958年美國Steward和德國Reinert分別由胡蘿卜韌皮部細胞誘導形成了胚狀體。1965年Vasil和Hildebrandt用單個分離的胡蘿卜細胞培養(yǎng)，獲得整個植株。

植物細胞工程Guha、Maheshwari、Bourgin和Nitsch先后利用煙草和胡蘿卜的小孢子培養(yǎng)獲得單倍體植物，成功實現(xiàn)了染色體加倍。1960年Nottingham大學的Cocking用果膠酶和纖維素酶溶解番茄根尖的細胞壁，得到原生質(zhì)體。1972年Carlson利用甘露糖為誘導劑，成功地在兩種煙草原生質(zhì)體細胞之間誘導融合，獲得雜種細胞。植物細胞工程20世紀70年代發(fā)現(xiàn)土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?？梢宰鳛橥庠椿蜉d體用于植物細胞的轉(zhuǎn)化。

生物工程生物工程（生物技術）：以生命科學為基礎，利用生物體系和工程學原理生產(chǎn)生物制品和創(chuàng)造新物種的一門綜合技術。利用生物有機體或其組成部分發(fā)展新工藝或制造新產(chǎn)品的一種科學技術。

生物工程發(fā)展歷程：第一代生物工程：

4000多年前~20世紀30年代近代生物工程：

20世紀40年代~20世紀60年代現(xiàn)代生物工程：

20世紀70年代~

生物工程特點：

操作對象是有生命的物質(zhì)內(nèi)涵大組成：發(fā)酵工程、酶工程、細胞工程、基因工程、生物化學工程、蛋白質(zhì)工程動物細胞工程單克隆抗體養(yǎng)細胞融合與單克隆抗體細胞培養(yǎng)胚胎工程核移植轉(zhuǎn)基因動物細胞融合與單克隆抗體細胞培養(yǎng)胚胎工程干細胞核移植染色體工程第4章細胞培養(yǎng)4.1培養(yǎng)細胞的生物學特性4.2細胞培養(yǎng)液4.3細胞的基本培養(yǎng)技術4.4細胞系和細胞株的建立4.5細胞的凍存、復蘇和運輸動物細胞與組織培養(yǎng)（cellandtissueculture）是動物細胞工程的重要技術基礎。動物細胞與組織培養(yǎng)是指從活的機體中取出組織或細胞，模擬機體內(nèi)生理條件，在體外建立無菌、適溫和一定營養(yǎng)條件等，使之生長和生存，并維持其結構和功能的技術。組織培養(yǎng)的概念組織培養(yǎng)這一名詞實際上是一個通用名詞，習慣上泛指所有的體外培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)物的不同可概括為三個不同概念：細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。A：細胞培養(yǎng)：將組織塊用機械方法或酶解法分離成單個細胞，做成細胞懸液，再培養(yǎng)于固體基質(zhì)上，成單層細胞生長，或在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)培養(yǎng)的技術稱為細胞培養(yǎng)。B：組織培養(yǎng)：將活體的一小片組織放在盛有培養(yǎng)液的玻璃或塑料培養(yǎng)器皿中，待組織塊粘著后，沿底面平面移動生長的過程稱為組織培養(yǎng)。從組織塊中生長出來的仍然是細胞，細胞在生長的同時也發(fā)生移動，至使組織培養(yǎng)難以長時間維持其原有結構，結果也就成了細胞培養(yǎng)。C：器官培養(yǎng)：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整個器官在體外存活、生長，并保持其原有結構和功能的培養(yǎng)技術。體外培養(yǎng)的種類二、細胞培養(yǎng)的現(xiàn)實意義

生物技術上：生產(chǎn)各種生物技術產(chǎn)品，如：狂犬病、小兒麻痹癥等病毒疫苗，表皮生長因子、干擾素、白細胞介素等生長因子及單克隆抗體等?？茖W研究上：在病毒學、免疫學、遺傳學、腫瘤學等方面。臨床醫(yī)學上：胎兒的遺傳性疾病分析，藥物篩選及某些疾病的治療等三、細胞培養(yǎng)技術的優(yōu)點

1.研究的對象是活細胞

在實驗過程中，根據(jù)要求可始終保持細胞活力，并可長時間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一部分活細胞的情況，包括活細胞的形態(tài)、結構、生命活動等。

2.

研究條件可以人為控制

可以根據(jù)需要，控制包括pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學條件；同時，可以施加化學、物理、生物等因素作為條件而進行實驗觀察，這些因素同樣可以處于嚴格控制之下。3.研究的樣本可以達到比較的均一

通過細胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細胞系則可以達到均一性，屬于同一類型的細胞，需要時，可采用克隆化等方法使細胞達到純化。4.研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄

采用各種研究技術、記錄方法：

研究:

倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細胞術、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學、原位雜交、同位素標記…….

記錄:攝影照片、縮時電影、電視…….5.研究的范圍比較廣泛

學科多：細胞學、免疫學、腫瘤學、生物化學、遺傳學、分子生物學等

對象廣：

各種動物：低等動物--高等動物--人類

一種動物：不同年齡--

不同組織--

正?；虍惓＃[瘤--）

6.研究的費用相對較經(jīng)濟

可提供大量、同一時期、重復性好的、生物學性狀相似的實驗對象。四、細胞培養(yǎng)的缺點

現(xiàn)在人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術已經(jīng)很高,但人工所模擬的條件與體內(nèi)實際情況仍不完全相同。當細胞被置于體外培養(yǎng)后,生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中,時間久了，必然發(fā)生變化。

因此，對于體外培養(yǎng)的細胞，應該把他們視作一種既能保持動物體內(nèi)原細胞一定的性狀、結構和功能又具有某些改變的特定的細胞群體，而不能將之與體內(nèi)的細胞完全等同。五、細胞培養(yǎng)的工作原則有標準化的工作方法。培養(yǎng)用的液體極多（如培養(yǎng)液、胰蛋白酶、HANKS液及抗菌素等），應由專人負責，并保證做到按規(guī)程行事，配制濃度準確，滅菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要標明名稱、濃度、消毒與否和制備日期等。一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點，避免雜亂無章，其中尤其重要的是：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應嚴格分開，已消毒品與未消毒品應分別存放。

4.1組織培養(yǎng)的細胞生物學---培養(yǎng)細胞的生物學特征一、體內(nèi)外細胞的差異和分化（一）體內(nèi)外細胞的差異

培養(yǎng)細胞最多見的表現(xiàn)是：失去原有組織結構和細胞形態(tài)，分化減弱或不顯，出現(xiàn)類似“反祖”現(xiàn)象；表現(xiàn)為細胞趨單一化，或獲得不死性，或變成具有惡性性狀的細胞群。1.與體內(nèi)主要不同

相對孤立、相對單一，

缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞相互間的影響。

2.主要表現(xiàn)

失去原有組織結構和細胞形態(tài)

分化減弱或不顯

細胞趨向單一化

3.提示

要正確認識體外培養(yǎng)細胞是一種特定條件下生長的細胞群體。

（二）培養(yǎng)細胞的分化1．不適應(Deadaption)：表現(xiàn)為，細胞在體內(nèi)時所擁有的分化特性減弱或不顯，如肝細胞產(chǎn)生酪氨酸轉(zhuǎn)移酶(TyrosineAminotranserase)特性的喪失.2．脫分化或去分化(Dedifferentiation)

細胞也可能出現(xiàn)脫分化或去分化，即細胞失掉發(fā)生分化的能力。二、培養(yǎng)細胞形態(tài)分類體外細胞培養(yǎng)物的生長類型

按生長方式:2種類型

粘附型(貼壁型)細胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。

懸浮型細胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。

絕大多數(shù)有機體細胞屬粘附型細胞，只有少數(shù)細胞類型如某些腫瘤細胞和白細胞可在懸浮狀態(tài)下生長。

貼壁(粘附)型細胞

粘附:是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式。體內(nèi)：基于粘附特性，使細胞與細胞之間相互結合形成組織，

有機體的絕大多數(shù)細胞必須粘附于一固相表面

才能生存和生長。

培養(yǎng)時：這些細胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于粘附型細胞。粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細胞。

細胞在體內(nèi)、外粘附方式存在差異：

體內(nèi)：粘附是全方位

外形具有復雜的立體特征。

體外：多數(shù)情況，細胞只有一個附著平面

外形一般與體內(nèi)時明顯不同。

按照培養(yǎng)細胞粘附生長時的主要形態(tài)，可分為幾大類型：

根據(jù)粘附生長時形態(tài)的不同，主要分為4類：

上皮細胞型成纖維細胞型

游走細胞型多形型細胞

1，上皮細胞型名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全等于--來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細胞。

如：皮膚及其衍生物消化道，乳腺，肺泡上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細胞

扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核

生長特點：

易相連成片

相靠—緊密相連—成薄層—

鋪路石狀

生長時呈膜狀移動

很少脫離細胞群而單個活動體外培養(yǎng)細胞類型（1）—上皮細胞型2，成纖維細胞型名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織

如：真正的成纖維細胞、心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮細胞。形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)

胞體梭形或不規(guī)則三角形

胞質(zhì)向外伸出2—3個長短不等的突起

中間有卵圓形核生長特點：

排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細胞—細胞接觸易斷開而單獨行動。游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起。體外培養(yǎng)細胞類型（2）——成纖維細胞型游走細胞型

伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動。形狀不穩(wěn)定。單核細胞、巨噬細胞及某些腫瘤細胞。多形細胞型有一些組織和細胞，如神經(jīng)組織的細胞等，難以確定他們規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，都歸入多形細胞型。貼附生長型--類型1.與體內(nèi)同名的細胞不完全相同

如：形態(tài)相似的成纖維細胞，可不同來源

自同一動物不同組織的成纖維樣細胞相似但

發(fā)展趨向不同2.培養(yǎng)細胞的形態(tài)不穩(wěn)定

條件改變，細胞形態(tài)可有變化培養(yǎng)細胞形態(tài)不穩(wěn)定

血清

Hela高血清低血清

成纖維細胞樣上皮樣細胞

pH

Hela太酸或太堿標準pH

成纖維細胞樣上皮樣細胞

細胞密度

3T3低密度高密度

成纖維細胞樣上皮樣細胞

生長狀態(tài)改變

懸浮或貼附懸浮貼附

圓形成纖維或上皮樣

轉(zhuǎn)化與否未轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化后

成纖維樣可成上皮樣懸浮生長型

概念

培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長

或以機械方法使保持在懸浮狀態(tài)下生長來源

自血，脾或骨髓，尤以血中白細胞癌細胞、腫瘤細胞也可能特點

在懸浮條件下生長良好細胞圓形，單個或小細胞團DT40isaBcelllinederivedfromanavianlymphomainachicken.

優(yōu)點

生存空間大，提供數(shù)量大傳代方便(不需消化)

易于收獲可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點觀察不方便很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細胞)

4.1.2培養(yǎng)細胞的生長特點（一）貼附（二）接觸抑制（三）密度抑制4.1.2培養(yǎng)細胞的生長特點

正常動物細胞培養(yǎng)的典型特征（P39）核型（染色體）正常，表明沒有明顯的基因改變。細胞的傳代次數(shù)大約在50代左右，有限的壽命反應了細胞的生長調(diào)節(jié)。細胞無惡性，表現(xiàn)在將該細胞注入免疫抑制動物不能形成腫瘤。貼壁依賴、接觸抑制和密度抑制表明其增殖受到抑制，當細胞在介質(zhì)表面生長至匯合單層時增殖就停止。接觸抑制細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（ContactInhibition）。細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導致細胞分裂停止。

ContactInhibition

dieproducenewcells4.1.3培養(yǎng)細胞的生長與增殖過程單個細胞的生長過程細胞系的生長過程每代細胞的生長過程1單個細胞的生長過程LivingCellDynamics

TheNeuronalCellLine2細胞系的生長過程組織培養(yǎng)細胞生命期(LifeSpanofCultureCells)所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間，包括原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期三個階段。正常培養(yǎng)細胞的生命期原代培養(yǎng)期(PrimaryCulture)也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。特點：1，細胞呈活躍移動，可見細胞分裂，但不旺盛。2，與體內(nèi)原組織在形態(tài)結構和功能活動上相似性大。3，細胞群是異質(zhì)的，各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強，即細胞獨立生存性差。4，初代培養(yǎng)的細胞多呈二倍體核型。傳代期特點：在整個生命期中此期的持續(xù)時間最長，整個培養(yǎng)過程的主要時期。細胞增殖旺盛，細胞生長活躍，并能維持二倍體核型。傳代：體內(nèi)細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代。初代培養(yǎng)的細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系（CellLine）。

衰退期特點：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。3.體外培養(yǎng)細胞一代生存期（每代細胞的生長過程）潛伏期指數(shù)增生期停滯期所謂“一代”是指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。1，潛伏期細胞對傳代操作所致?lián)p傷的恢復期和對新的生長環(huán)境的適應期，一般為期6~24h。也是原代培養(yǎng)開始時細胞必須經(jīng)歷的時期。接種到培養(yǎng)器皿內(nèi)以后，細胞開始經(jīng)歷黏附、貼壁和鋪展等過程。修復損傷，熟悉環(huán)境，恢復生長，但很少分裂。接種的細胞密度越大，數(shù)量越多，細胞群體越容易適應體外環(huán)境，潛伏期就短。2，指數(shù)生長期又叫對數(shù)生長期（logarithmicgrowthphase），是細胞增生最活躍、活力最旺盛的階段，培養(yǎng)物中的細胞數(shù)量呈指數(shù)增長。細胞群體均一，理想的實驗用細胞。細胞分裂活動（即增殖活性）的衡量指標：有絲分裂指數(shù)（mitoticindex,MI）細胞群體倍增時間：培養(yǎng)物中細胞數(shù)量翻倍的平均時間MTT法、標記核苷酸（H3-TdR）摻入法、BrdU標記法有絲分裂指數(shù)(MI)

指培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計時，每瓶至少需計數(shù)1000個細胞。

一般細胞的MI約為0.1－0.5%。原代培養(yǎng)物的MI比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細胞系和腫瘤細胞高，可達3%－5%。在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細胞數(shù)量不斷增多，生長空間漸趨減少，最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，發(fā)生接觸抑制。發(fā)生接觸抑制以后，雖然運動受到限制，但只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度依賴性細胞生長抑制，導致細胞分裂停止，細胞數(shù)量即不再增加，進入平臺期（停滯期）。3，停滯期也叫平臺期（plateauphase），意即細胞不再分裂增殖，細胞數(shù)量維持在某一水平上，生長活動停滯。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累，pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則脫落死亡，故傳代應越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后，才能再用。4.1.4體外培養(yǎng)細胞的遺傳學特征（一）核型變化（二）永生化和惡變（三）細胞性別體外培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境（一）無污染環(huán)境（二）溫度（三）氣體環(huán)境和氫離子濃度體外培養(yǎng)細胞生存所需基本物質(zhì)（一）糖（二）氨基酸（三）維生素（四）促生長因子（五）其它物質(zhì)4.2細胞培養(yǎng)液4.2.1細胞培養(yǎng)的常用液體水平衡鹽溶液消化液消化酶抑制劑pH調(diào)整液抗生素液谷氨酰胺補充液培養(yǎng)用水體外培養(yǎng)的細胞對水質(zhì)特別敏感，對水的純度要求較高。培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時也會影響細胞的存活和生長，甚至導致細胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會含有某些金屬離子，一般不作為培養(yǎng)用水。配制培養(yǎng)用液應使用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。

平衡鹽溶液平衡鹽溶液主要是由無機鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的pH值。消化液

進行原代培養(yǎng)時常常需要將組織塊消化解離形成細胞懸液，傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁細胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時也用膠原酶（collagenase）溶液等。胰酶溶液

胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液，因為這些物質(zhì)會對胰酶產(chǎn)生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9，配制胰酶溶液應將液體調(diào)至pH8左右，充分溶解，過濾除菌。過濾后可以再調(diào)只pH7.5，也可不調(diào)。分裝于4度保存。

EDTA溶液

EDTA溶液也常用來解離細胞，它的作用機制是破壞細胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時應加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。

消化酶抑制劑血清大豆胰蛋白酶抑制劑

pH調(diào)整液NaHCO3溶液：NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH達到設計標準。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達到平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書所要求加入NaHCO3。此時常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使之達到所要求的pH環(huán)境。pH調(diào)整液HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES?？股爻Ｓ玫氖乔噫溍顾?，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預防絕大多數(shù)細菌污染。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。

谷氨酰胺補充液谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養(yǎng)液內(nèi)。配制時應加溫30℃，完全溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于－20℃。二肽谷氨酰胺

（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）

在細胞培養(yǎng)液中頻繁地補加谷氨酰胺，因而在培養(yǎng)操作過程中經(jīng)常：

（1）頻繁打開蓋子，增加了破壞無菌狀態(tài)的可能性；

（2）過多的追加L-谷氨酰胺，增加了培養(yǎng)基中氨的毒性水平。二肽谷氨酰胺

（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）二肽谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中穩(wěn)定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨最少!二肽谷氨酰胺在細胞內(nèi)被氨肽酶所水解，產(chǎn)生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分細胞系統(tǒng)中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是最優(yōu)替代物，它無需適應；既可用于貼壁細胞培養(yǎng)，也適合于懸浮細胞的培養(yǎng)。4.2.2培養(yǎng)基培養(yǎng)基細胞的生長需要一定的營養(yǎng)環(huán)境，用于維持細胞生長的營養(yǎng)基質(zhì)稱為培養(yǎng)基，即指所有用于各種目的的體外培養(yǎng)、保存細胞用的物質(zhì)，就其本意上講為人工模擬體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境，使細胞在此環(huán)境中有生長和繁殖的能力。它是提供細胞營養(yǎng)和促進細胞生長增殖的物質(zhì)基礎。細胞培養(yǎng)基的基本要求

體外培養(yǎng)的細胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基應能滿足細胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。

營養(yǎng)成分

1.氨基酸

2.單糖：體外培養(yǎng)動物細胞時，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。

3.維生素

4.無機離子與微量元素促生長因子及激素

各種激素、生長因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用，如氫化可的松可促進表皮細胞的生長，泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。

氣體與pH

氣體也是細胞生存的必需條件之一，所需氣體主要是氧和二氧化碳。一般置細胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。動物細胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，pH值約在7.2-7.4pH在細胞生長過程中，隨細胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，PH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以精確地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)，并采用開放培養(yǎng)，使細胞代謝產(chǎn)生的CO2及時溢出培養(yǎng)瓶，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度（5％），與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。滲透壓

細胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg,可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。

無毒、無污染

體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應達到無化學物質(zhì)污染、無微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）、無其他對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補體）。對于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應當嚴格選材，嚴格操作。對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應十分潔凈，配制后應嚴格過濾除菌。

2天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術建立早期，體外培養(yǎng)細胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細胞也是必不可少。

血清(serum)

血清種類:主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。牛血清分為小牛血清(calfserum，CS)、胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)

。胎牛血清應取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新生小牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生10-30天的小牛。fetalbovineserum，F(xiàn)BSWhenthemediaisneeded,add50-mlofFBSand5-mlofantibioticstooneoftheportions.Thiscompletesthemediaforuse.

IneedtodecreasetheconcentrationofFBSinmymedia.Normally,Iuse10%FBSandIwouldliketouse1%.Doesitcauseanyproblemforcellgrowth?胎牛血清的有關問題：胎牛血清：（進口血清）要求剖腹取胎制成。國內(nèi)廠家往往不能做到，經(jīng)常把出生2天以內(nèi)采血稱為胎牛血清。血清污染的檢測(視頻)血清的主要作用

●提供基本營養(yǎng)物質(zhì)●提供激素和各種生長因子●提供結合蛋白●提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。●對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用：血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。

細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點

●對大多數(shù)細胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞）同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）?！裱搴恍毎a(chǎn)生毒性的物質(zhì)血清的缺點●動物個體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致。

●取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產(chǎn)生潛在影響，可能導致實驗失敗或?qū)嶒灲Y果不可靠性。

●血清的使用使得實驗和生產(chǎn)的標準化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。

●大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構成動物細胞培養(yǎng)對生產(chǎn)成本的主要部分之一。

血清的使用使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是滅活血清中的補體和支原體。血清經(jīng)過滅活也會損失一些對細胞有利的成分，如生長因子，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng)，這樣做的前提是確認血清中不含補體成分。對于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細胞培養(yǎng)。

血清的儲存儲存條件：血清一般儲存于-20℃，同時應避免反復凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于-20℃，使用前融化。融化時最好現(xiàn)置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應盡快使用。

3合成培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基包括四大類物質(zhì)：無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。

常用合成培養(yǎng)基(1).MEM細胞培養(yǎng)基系列(2).DMEM細胞培養(yǎng)基系列(3)RPMI-1640細胞培養(yǎng)基系列(4).199細胞培養(yǎng)基系列(5).水解乳蛋白細胞培養(yǎng)基(6)歐氏平衡鹽(7)F-10,F-12細胞培養(yǎng)基系列(8)其它類型細胞培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基沒有一定的標準，有幾點建議可供參考：(1)建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應該是培養(yǎng)這種細胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I，或在購買細胞株時咨詢。(2)其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細胞。(3)根據(jù)細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細胞株多選RPMI1640。(4)用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據(jù)實驗結果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。

干粉培養(yǎng)基的配制

●認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實驗需要決定?！衽渲剖且ＷC充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加?！衽渲扑玫乃畱侨羲?，離子濃度很低。●所用器皿應嚴格消毒?！衽渲坪玫呐囵B(yǎng)基應馬上過濾，無菌保存于4度。配制方法

●加入比預期總體積少50％的三蒸水?！窦尤敫煞叟囵B(yǎng)基，輕輕攪拌，不要加熱?！袼窗b袋的內(nèi)部，轉(zhuǎn)移全部的痕量干粉到容器內(nèi)。●加NaHCO3到培養(yǎng)基中?！裼萌羲♂尩较胍捏w積，攪拌溶解。注意不要過分攪拌。●通過緩慢攪拌加入1NNaOH或1NHCL調(diào)節(jié)pH值，由于pH值在過濾時會上升0.1到0.3，因而調(diào)節(jié)pH值使它比最終想要的pH值低0.2到0.3。培養(yǎng)基在過濾前要保持密封。

無血清培養(yǎng)基

是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基?？赡馨瑐€別蛋白或大量蛋白組分。研制出無血清培養(yǎng)基一直是生物科學工作者努力的目標。4.3細胞的基本培養(yǎng)技術4.3.1原代培養(yǎng)1取材組織:雞胚鼠胚皮膚和黏膜血細胞內(nèi)臟和實體瘤2組織細胞的分離機械法：離心、切割分離、機械分散法消化法：胰酶、EDTA、膠原酶3培養(yǎng)方法組織塊培養(yǎng)法單層細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)視頻雞胚胎成纖維細胞的原代培養(yǎng)

1.取9日齡的雞胚，用酒精消毒，在超凈工作臺內(nèi)，小心取出雞胚，放在培養(yǎng)皿中，除去頭尾、四肢及內(nèi)臟；2.胚體用含雙抗PBS沖洗2~3次，切成1~2mm3的小塊，然后轉(zhuǎn)入容積適量大小的三角瓶內(nèi)（或試管、燒杯）；3.按每個雞胚加入約5mL的EDTA-胰酶消化液，在室溫下消化10min；4.小牛血清終止消化，收集細胞懸液，沒有消化完全的組織塊可再消化一次；5.收集到的細胞懸液經(jīng)100目過濾篩過濾，1000rpm離心5min，去上清；6.細胞沉淀用DMEM培養(yǎng)液重新懸浮，取出少量細胞懸液臺盼藍染色，計算細胞活力；7.以5×105個/mL的密度接種到培養(yǎng)瓶中（30mL細胞液/雞胚），于38.5℃、5%CO2濃度、飽和濕度條件下培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的注意事項：分離組織：使用鋒利的刀具，減少對組織的損傷。在取材時除去脂肪和壞死組織。離心轉(zhuǎn)速要適度。消化及接種：選取合適的消化酶，消化的時間因組織而異，一般為30min。接種的密度應比傳代培養(yǎng)大——選擇營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基和血清胚胎組織在原代培養(yǎng)中容易分離，細胞較易存活，增殖速度快，故比成年組織更可取。4.3.2傳代培養(yǎng)當原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞不斷分裂，一則細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面也會因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。此時就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。對單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細胞是較理想的傳代階段。

體外培養(yǎng)細胞的生長曲線傳代培養(yǎng)第一次傳代常規(guī)傳代：貼壁細胞／懸浮細胞貼壁細胞傳代貼壁細胞傳代-消化過程圖示

胰酶消化雞胚胎成纖維細胞的傳代原代培養(yǎng)的細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部時（約2天），即可進行傳代；吸出原培養(yǎng)液，然后用PBS清洗細胞2~3次，盡量除去殘余的血清；3.加入0.2mL的消化液進行消化，消化程度可在倒置顯微鏡下觀察，一般以細胞突起縮回、細胞間間隙增大、細胞近乎縮成圓形為度；4.吸出消化液，加入適量的含小牛血清的培養(yǎng)液，反復輕輕吹打培養(yǎng)瓶底部，使經(jīng)消化的細胞脫離瓶底并分散為單個細胞；5.收集細胞懸液，1000rpm離心5min，去上清；6.用培養(yǎng)液重新懸浮細胞并計算細胞活力和密度，以5×105個/mL密度（1：3）接種到培養(yǎng)瓶中，于38.5℃、5%CO2濃度、飽和濕度條件下培養(yǎng)。懸浮細胞傳代Wave-bioreactor懸浮細胞傳代常用培養(yǎng)技術懸滴培養(yǎng)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)克隆培養(yǎng)法細胞同步化培養(yǎng)動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)懸滴培養(yǎng)

hanging－dropculture，slidecellculture

Coverslipculture培養(yǎng)瓶培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶

(rollerbottle)克隆培養(yǎng)法指單細胞培養(yǎng)，使之無性繁殖獲得克隆細胞株的方法。有采用在每一毛細管內(nèi)滴一滴培養(yǎng)液，各自放入一個細胞進行培養(yǎng)的方法；但一般是在培養(yǎng)皿中使細胞相互間維持一定的間隔，培養(yǎng)極少量的細胞以使各個細胞得以增殖。細胞克隆技術的方法1.稀釋鋪板法2.飼養(yǎng)層克隆法3.膠原膜板或纖維蛋白膜板克隆法4.瓊脂克隆法5.毛細管克隆法ColonyPicking細胞同步化培養(yǎng)

在一般培養(yǎng)條件下，群體中的細胞處于不同的細胞周期時相之中。為了研究某一時相細胞的代謝、增殖、基因表達或凋亡，常需采取一些方法使細胞處于細胞周期的同一時相，這就是細胞同步化技術。選用DNA合成抑制劑可逆地抑制S期細胞DNA合成而不影響其他細胞周期運轉(zhuǎn)，最終可將細胞群體阻斷在G1／S期交界處；一些抑制微管聚合的藥物，因抑制有絲分裂裝置的形成和功能行使，可將細胞阻斷在有絲分裂中期，即使細胞同步于M期。細胞同步化實際包括用一定的方法獲得一定數(shù)量的同步化細胞群和使細胞進入同步化生長的兩層含義。

動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)分批式流加式半連續(xù)式連續(xù)式灌注式

動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術（large-scaleculturetechnology）是指在人工條件下（設定ph、溫度、溶氧等），在細胞生物反應器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動物細胞用于生產(chǎn)生物制品的技術。目前已實現(xiàn)商業(yè)化的產(chǎn)品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒疫苗、巨細胞病毒疫苗、α及β干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促紅細胞素、松弛素、生長激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶及200種單克隆抗體等。其中，口蹄疫疫苗是動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法生產(chǎn)的主要產(chǎn)品之一。1983年，英國Wellcome公司就已能夠利用動物細胞進行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫疫苗。美國Genentech公司應用SV40為載體，將乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳動物細胞內(nèi)進行高效表達，已生產(chǎn)出乙型肝炎疫苗。英國Wellcome公司采用8000LNamalwa細胞生產(chǎn)α干擾素。英國Celltech公司用氣升式生物反應器生α、β和γ干擾素；用無血清培養(yǎng)液在10000L氣升式生物反應器中培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體。美國Endotronic公司用中空纖維生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞生產(chǎn)出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生長激素等。4.4細胞系和細胞株的建立細胞系和細胞株的種類原代培養(yǎng)細胞系克隆細胞株二倍體細胞遺傳缺陷細胞腫瘤細胞系或株

從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株（Substrain）

細胞株細胞系正常細胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞才能無限生長下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細胞。目前世界上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細胞系就是1951年從一位名叫HenriettaLacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培養(yǎng)而成（宮頸癌上皮細胞）。此細胞系一直延用至今。細胞系或細胞株的命名

HeLa：為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）

CHO：中國地鼠卵巢細胞（ChineseHamsterOvary）宮-743：宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立

NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（NationalInstituteofHealth）建立；每3天傳代，每次接種3×105細胞／毫升。

CellLinesforTherapeuticProteinManufacturing

建立細胞系（細胞株）的要求組織來源細胞生物學檢測培養(yǎng)條件和方法檔案資料及其管理和使用細胞庫：美國標準培養(yǎng)物收集所(ATCC)歐洲動物細胞庫(ECACC)日本細胞庫(RCB)中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會：中科院上海細胞庫昆明細胞庫武漢細胞庫

ATCC:TheAmericanTypeCultureCollection

美國ATCC菌種保藏中心，又稱美國模式菌種收集中心，座落于馬里蘭洲洛克菲勒的一家私營的，非贏利性組織。目前它可以提供以下物品：細胞系（3000種）；細菌和噬菌體（15000種）；動植物病毒（2500種）；原生動物

1200種以及重組物品等。

ATCC:AmericanTypeCultureCollection

ATCC

isanonprofitrepositoryandworldwidedistributorofvariouscelllinesandprimarycelltypesusedforcellbiologyresearch.

ATCCwasestablishedin1925whenacommitteeofscientistsrecognizedaneedforacentralcollectionofmicroorganismsthatwouldservescientistsallovertheworld.

4.5細胞的凍存、復蘇和運輸為了防止因污染或技術原因使長期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異，有時因寄贈、交換和購買，培養(yǎng)細胞從一個實驗室轉(zhuǎn)運到另一個實驗室，最佳的策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要。

細胞低溫保存的基本原理在－70℃－196℃以下時，細胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止狀態(tài)，故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在于通過0~-20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，冰晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。Directcellinjuryfromfreezing

要獲得好的凍存與復蘇效果，必須了解如下幾個問題：1)冷凍速率2)復溫速率3)冷凍保護劑4)冷凍保存溫度

coolingrate

對大多數(shù)有核哺乳類動物細胞來說，在不加冷凍保護劑的情況下，不能獲得活的凍存物。目前冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類。具有滲透性的冷凍保護劑可以滲透到細胞內(nèi)，一般是一些小分子的物質(zhì)，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等，。非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉等。

防凍劑滲透性保護劑

常用的防凍劑是５-２0％

DMSO或甘油，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。加防凍劑無防凍劑懸浮細胞的凍存●計數(shù)將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數(shù)生長期。以大約1000rpm離心5分鐘沉淀細胞，使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細胞。

●以５×106到5×107細胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細胞。

●分裝進凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。

●細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。

懸浮細胞的凍存可以凍存了貼壁細胞的凍存●酶解貼壁細胞，分離時盡可能溫和，使對細胞的損傷減少到最小。

●在完全生長培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細胞，確定有活力細胞數(shù)。

●以大約1000rpm離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細胞。

●以5×106到1×107細胞/ml密度，在凍存液中懸浮細胞。

●分裝進凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中１小時。

●細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中過夜，然后轉(zhuǎn)移到液氮中長期貯存細胞凍存方法細胞凍存方法1．預先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基，10%DMSO，DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細胞；2．取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細胞懸液（５×106～１×10７細胞/ml)；3．加入1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。

凍存和復蘇的原則：慢凍快融

當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結晶很大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。凍存細胞的存放凍存細胞的存放凍存細胞的復蘇凍存細胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細胞要快速融化，并直接加入完全生長培養(yǎng)基中。若細胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基，然后加入完全生長培養(yǎng)基中。

細胞復蘇方法（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）；（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上；（3）低速離心10分鐘；（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。一般來說復蘇速度越快越好，37℃水浴中，1～2分鐘內(nèi)要完成復蘇。思考題名詞解釋ContactInhibitionPrimaryCulture,Barrbody簡答1）簡介體外培養(yǎng)動物細胞的類型？2）簡介正常動物細胞培養(yǎng)的典型特征？3)動物細胞培養(yǎng)經(jīng)常要添加血清,請簡單介紹血清的主要作用和缺點。思考題4)簡介雞胚胎成纖維細胞的原代培養(yǎng)方法5)簡介雞胚胎成纖維細胞的傳代培養(yǎng)方法6)簡介貼壁培養(yǎng)細胞的冷凍保存與復蘇方法鼠源單抗臨床應用的障礙血清半衰期短，20h抗原抗體結合力、親和力不夠募集效應細胞產(chǎn)生副作用HAMA反應：8－10天出現(xiàn)，20－30天高峰,加速單抗清除。過敏休克HAMA反應

HumanAnti-MouseAntibodies

鼠來源的單抗在人體內(nèi)是外源物質(zhì)，很可能會產(chǎn)生人體免疫系統(tǒng)對它的排斥反應：產(chǎn)生抗鼠的抗體，叫做人抗鼠抗體（HAMA）反應。HAMA反應對鼠源的單抗分子有著較強的破壞作用，嚴重影響了鼠源單抗在人體內(nèi)的功效，所以非常有必要改進鼠源單抗。

抗體研究的世代第一代多克隆抗體第二代單克隆抗體第三代基因工程抗體抗體的結構及其多樣性輕鏈重鏈免疫球蛋白的基本結構四條鏈對稱結構互補決定區(qū)complementaritydeterminingregions(CDR)小鼠抗體嵌合抗體重構抗體人源抗體5.2人源性單克隆抗體的制備5.2.1EB病毒轉(zhuǎn)化技術5.2.2細胞工程單克隆抗體技術1人-鼠雜交瘤單克隆抗體2人-人雜交瘤單克隆抗體3EB病毒轉(zhuǎn)化-融合技術4轉(zhuǎn)基因動物制備單克隆抗體5重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠制備單克隆抗體5.2.3人單抗制備技術的發(fā)展（新基因工程技術）5.2.1EB病毒轉(zhuǎn)化技術EB病毒（epstein-barrvirus,EBv）是epstein和barr于1964年首次成功地將burkitt非洲兒童淋巴瘤細胞通過體外懸浮培養(yǎng)而建株，并在建株細胞涂片中用電鏡觀察到皰疹病毒顆粒，故名。EB病毒的形態(tài)與其他皰疹病毒相似。EB病毒僅能在B淋巴細胞中增殖，可使其轉(zhuǎn)化，能長期傳代。

EB病毒轉(zhuǎn)化淋巴細胞5.2.2細胞工程單克隆抗體技術

1人-鼠雜交瘤單克隆抗體

人脾細胞＋鼠骨髓瘤細胞5.2.2細胞工程單克隆抗體技術

2人-人雜交瘤單克隆抗體人脾細胞＋人骨髓瘤細胞細胞種類少5.2.2細胞工程單克隆抗體技術

3EB病毒轉(zhuǎn)化-融合技術利用EB病毒轉(zhuǎn)化B淋巴細胞為永生細胞與鼠骨髓瘤細胞融合5.2.2細胞工程單克隆抗體技術

4轉(zhuǎn)基因動物制備單克隆抗體人抗體基因(除CDR)導入小鼠胚胎轉(zhuǎn)基因小鼠抗原免疫轉(zhuǎn)入人的Ig基因組免疫動物人抗體基因敲除小鼠將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術，產(chǎn)生大量完全人源化抗體5.2.2細胞工程單克隆抗體技術

5重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠制備單克隆抗體SCID:severecombinedimmunodeficiencymouse既無有功能的T細胞也無B細胞的小鼠,對異源移植物不產(chǎn)生任何排斥反應,可以作為良好的載體系統(tǒng)用于醫(yī)學及生物學各個領域的研究,但極易感染病菌,飼養(yǎng)和操作管理十分復雜。SCIDSCID:SevereCombinedImmunodeficiency

1)TumorsfromotherspeciesareeasilytransplantedintoSCIDmiceandwillgrowwithoutbeingrejected.2)

SCIDmiceareevenmoreimmunodeficientthannudemice.3)SCIDmiceareidealforthegrowthofhybridomasinvivotoproduceacontinuoussupplyofantibody.

重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠制備單克隆抗體將人淋巴細胞移植到小鼠體內(nèi)抗原免疫標準雜交瘤方法或制備抗體庫裸鼠T淋巴細胞功能缺陷1962年偶然發(fā)現(xiàn)有個別無毛小鼠，后來證實是由于基因突變造成的并伴有先天性胸腺發(fā)育不良，稱為裸小鼠(nudemice)，用“nu”表示裸基因符號。裸小鼠是由于染色體上等位基因(第11對染色體上)突變引起的，已失去正常胸腺。特性裸小鼠的主要特征表現(xiàn)為無毛(hairless)和無胸腺(athymus)。隨著鼠齡增加皮膚變薄、頭頸部皮皺褶、發(fā)育遲緩。由于無胸腺,僅有胸腺殘跡或異常上皮,這種上皮不能使T細胞正常分化，缺乏成熟T細胞的輔助、抑制及殺傷功能，因而細胞免疫力低下。裸小鼠B淋巴細胞正常，但功能欠正常繁殖裸鼠抵抗力差，易患病毒性肝炎和肺炎，因而飼養(yǎng)和繁殖要求條件比較嚴格，在SPF（無特定病原(SpecificPathogenFree)）環(huán)境下可生存，所用的籠具、墊料、飼料、飲水等都要求經(jīng)過嚴密滅菌消毒并采用隔離器飼養(yǎng)，以保證長期存活并進行繁殖。由于純合型雌裸小鼠nu/nu受孕率低，乳腺發(fā)育不良且有食仔的習慣，因此生產(chǎn)上一般采用純合型雄鼠與雜合型雌鼠交配(♂nu/nu×♀nu/＋)可獲1/2純合型仔代。飼養(yǎng)5.2.3人單抗制備技術的發(fā)展

（基因工程）人-鼠嵌合抗體改型抗體組合抗體庫技術與噬菌體抗體文庫技術表位印模選擇技術基因工程抗體

Geneticengineeringantibody概念：根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或修飾后導入受體細胞進行表達，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體。人-鼠嵌合抗體chimeric

antibody

改型抗體reshaping

antibody

：

鼠單抗可變區(qū)的人源化（CDR移植）

組合抗體庫技術（抗體基因文庫）

采用RT-PCR技術從淋巴細胞克隆出全套抗體輕鏈基因和重鏈基因，將二者分別組建到表達載體中，得到輕鏈基因庫和重鏈基因Fd段基因庫，再通過DNA重組技術將輕鏈基因和Fd隨機重組于一個表達載體中，即形成抗體庫。1989年底，采用PCR方法克隆機體全部的抗體基因，并重組于原核表達載體中，以標記抗原即可篩選到相應抗體，當時稱為組合抗體庫技術。組合抗體庫出現(xiàn)不到一年即被噬菌體展示抗體庫所取代

人淋巴細胞抗原篩選產(chǎn)生特異克隆

RT-PCR

輕鏈重鏈基因轉(zhuǎn)印至NC膜

DNA重組組合抗體庫E.coli隨機表達組合抗體庫噬菌體抗體庫技術1.噬菌體顯示：指將蛋白分子或肽段基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中，使噬菌體表面表達該異源性分子，主要特點是在同一病毒顆粒內(nèi)將特定分子的基因型和表型統(tǒng)一，在噬菌體表面表達特定蛋白，在該噬菌體核心DNA中含有該蛋白的基因。2.噬菌體抗體：將抗體分子片段與噬菌體外殼蛋白融合，使之表達在噬菌體表面，形成噬菌體抗體，將全套抗體可變區(qū)基因，組裝到表達載體，其抗體表達到噬菌體表面，得到噬菌體抗體。

噬菌體抗體文庫技術

噬菌體展示技術

Winter等在1994創(chuàng)建了噬菌體抗體庫（repertoireofantibodiesdisplayedonphages）技術,或稱噬菌體抗體技術（Phagedisplay），克服了人體不能隨意免疫的缺點，而且不用人工免疫動物和細胞融合技術，完全用基因工程技術制備人源性抗體。

噬菌體抗體文庫

噬菌體表達小分子抗體建立噬菌體抗體庫固相化抗原吸附洗脫擴增噬菌體抗體庫小結人源抗體制備技術日臻成熟，全分子人抗體研究具有誘人的前景，臨床應用有望進一步擴大，我國在抗體工程研究中應注重原創(chuàng)性，力爭在國際競爭中占有一席之地。5.3單克隆抗體在醫(yī)學上的應用（一）用作診斷試劑

1.檢測淋巴細胞表面分子，區(qū)分不同分化階段的淋巴細胞，鑒別淋巴細胞。

2.鑒定病原體，準確診斷傳染病。

3.用于腫瘤的診斷和分型。

4.激素類單抗用于測定體內(nèi)激素含量，判斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài)。

（二）用作研究工具純化抗原分析和探查抗原結構分析抗原決定簇分子的功能（三）用于疾病的治療抗細胞表面分子單抗，用于移植排斥反應的防治抗細胞因子單抗用于自身免疫性疾病的治療抗腫瘤單抗用于腫瘤的導向治療生物導彈生物導彈單克隆抗具體有高度專一性，能夠識別細胞表面抗原、各種受體、各種體液成分及細胞內(nèi)和組織內(nèi)的各種成分，能精確地瞄準和捕獲靶目標，特異性地與靶目標發(fā)生反應。

“生物導彈”——單克隆抗體作載體攜帶藥物，使藥物準確地到達癌細胞，以避免化療或放射療法把正常細胞與癌細胞一同殺死的副作用。Newapproaches:There'shopeforthefuture.

抗體治療的機制阻斷和中和作用Fc的免疫效應機制信號傳導和細胞凋亡免疫調(diào)節(jié)靶向抑制腫瘤的生長單克隆抗體用于免疫治療存在的問題單克隆抗體的特異性

由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對腫瘤有嚴格特異性的單抗，對正常組織有交叉反應異種抗體反應

鼠源性單抗用于人體，導致異源性超敏反應1)簡介鼠源性單克隆抗體制備的原理，并繪圖說明其操作流程2)簡介單克隆抗體在醫(yī)學上的應用3)為什么要對鼠源性單克隆抗體進行改造使之人源化，改造的方法有那些？思考題MonoclonalAntibodyseverecombinedimmunodeficiencymouse

什么是干細胞(stemcells)干細胞是具有自我更新(Self-renewal)和分化潛能(Potency)的細胞。Mouseembryonicstemcellswithfluorescentmarker.HumanEmbryonicStemcellcolonyonmouseembryonicfibroblastfeederlayer.干細胞的分類按來源分類胚胎干細胞成體干細胞按分化潛能分類

多能干細胞

全能干細胞

專能干細胞

胚胎干細胞和成體干細胞的比較定義:是從早期胚胎內(nèi)細胞團(或生殖脊)分離，并經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)所獲得的干細胞。特點：具有很強的分化能力，可以無限增加，并且可以分化成全身２００多種細胞類型?？偨Y：它能長成動物的任何組織和器官成體干細胞位于成體的組織和器官特點：在特定條件下，成體干細胞或者產(chǎn)生新的干細胞，或者按一定的程序進行分化，形成新的功能細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。

美國威斯康辛大學（UniversityofWisconsin）科學家湯姆森（JamesA.Thomson）帶領研究團隊首次從人類胚胎組織中提取培養(yǎng)出胚胎干細胞（EmbryonicStemCell，ESCell）株，并且證實此株細胞具有全能干細胞特征，此項研究論文發(fā)表在1998年11月6日出版的頂級學術期刊Science上.這篇論文標著著一個時代的到來，而湯姆森也被人稱作"干細胞研究之父"。JamesA.Thomsonthomson@

1999年12月，美國《科學》雜志公布了當年世界科學進展的評定結果，干細胞的研究成果列在舉世矚目耗資巨大的人類基因組工程之前，名列十大科學進展首位。

7.1胚胎干細胞

（embryonicstemcells,ES細胞）

四個基本問題:什么是ES細胞？（定義）如何分離培養(yǎng)ES細胞（建系）如何鑒定ES細胞？ES細胞有何應用價值？

受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子

合子卵裂球桑椹胚囊胚滋養(yǎng)層

胎盤及胎兒附屬結構囊胚內(nèi)胚層

消化道