2023屆一輪復(fù)習(xí)蘇教版基因工程的基本工具和基本操作程序教案

第6課時基因工程的基本工具和基本操作程序

【課標(biāo)要求】1.闡明DNA重組技術(shù)的實現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三

種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載

體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。3.按照實驗操作步驟,

進行DNA的粗提取與鑒定實驗。4.利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒

定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗。

考點一基因工程的基本操作工具

■梳理歸納夯實必備知識

1.基本工程的概念

(1)供體：提供外源目的基因。

(2)操作環(huán)境：住處。

(3)操作水平：分子水平。

(4)原理：基因重組。

(5)受體：表達(dá)目的基因。

(6)本質(zhì)：性狀在受體體內(nèi)的表達(dá)。

【拓展】基因工程的理論基礎(chǔ)

:①基因是控制生物性狀的遺

理*［傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能單位

外源基因在受如職②遺傳信息的傳遞都遵循中

.體細(xì)胞內(nèi)表.達(dá)基礎(chǔ)1心法則

:③生物界共用一套遺傳密碼

復(fù)(重組DNA：、轉(zhuǎn)錄--翻建」蛋白質(zhì)

制??+B???Ξ/r1~η(??t)

;?DNAS?????≠???

‘四種脫氧核昔酸

g??②DNA分子都遵循堿基互補

`'變flu}I配對原則

，③雙鏈DNA分子的空間結(jié)構(gòu)

;都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)

2.重組DNA技術(shù)的基本工具

(1)限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)

識別雙鏈DNA分子的特定脫氧核甘酸

特點序列

(專一性)使每條鏈中特定部位的兩個脫氧核

甘酸之間的磷酸二酯鍵斷開

限作用斷開兩個核背酸之間的磷酸二酯鍵

制

酶

切割方式錯位切和平切

縫及產(chǎn)生黏性末端和平末端

(2)DNA連接酶

作用將雙鏈DNA片段“黏合”起來,恢復(fù)被限制

酶切開的兩個核甘酸之間的磷酸二酯鍵

DNA

連產(chǎn)圾大腸桿菌

接E.coliDNA

連接的圖紇只“黏合”黏性末端

酶、類型

［義源.T4噬菌體

T4DNA

連接酶邈一“黏合”黏性末端或平

末端

(3)載體

種類質(zhì)粒(常用載體)、入噬菌體的衍生

物、動植物病毒等

復(fù)制原點

特點適合的標(biāo)記基因，鑒定和選擇重組

DNA分子

多種限制酶的切割位點一

作用(攜帶外源DNA片段進入受體細(xì)胞

【延伸應(yīng)用】圖解限制酶的選擇原則

標(biāo)記基因PsU

PStISmaIPstI

Ec。Rl

Sma1抗話EcoRI

基因

甲乙

(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇尸sfl,而不選擇SinciIo

(2)保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所以

所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaI。

(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstI；

為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒,

如圖甲也可選擇PstI和EcoRI兩種限制酶。

■考向突破強化關(guān)鍵能力

考向基因工程的基本工具

1.（2022?青島市高三期中）下表為常用的限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶汲其識別序列和切割位

點，由此推斷以下說法中，錯誤的是（）

限制酶名稱識別序列和切割位點限制酶名稱識別序列和切割位點

BamH1GGATCCKpnIGGTAC1C

EcoRIC1AATTCSaU3AI'GATC

HindHGTY1RACSma【CCC1GGG

注：Y為C或T,R為A或G。

A.HindII?SMzal兩種限制酶切割后形成平末端

B.Sau3AI限制酶的切割位點在識別序列的外部

C.BamW1和SaU3A1兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端

D.一種限制酶一定只能識別一種核甘酸序列

答案D

解析Hind↑[,SHal兩種限制酶沿著中軸線切口切開，切割后形成平末端，A項正確；

SaU3AI限制酶識別GATC序列，切割位點在識別序列的外部，B項正確；BamHI限制酶識

別GGATCC序列，Sα"3AI限制酶識別GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC,C

項正確；H%d∏能識別GTCAAC,也能識別GTTAAC,D項錯誤。

2.（多選）第三代疫苗——DNA疫苗是指將編碼保護性抗原蛋白的基因（如圖甲）插入到適宜的

質(zhì)粒（如圖乙）中得到的重組DNA分子，將其導(dǎo)入人體內(nèi)，在人體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的產(chǎn)物可直接誘

導(dǎo)機體免疫應(yīng)答，且可持續(xù)一段時間。限制性內(nèi)切核酸酶的切點分別是BgllI、ECoRl和

SaU3AI。下列分析錯誤的是（）

保護性抗原蛋白基因

BglIISau3AI

ECoRIECoRI

甲

A.構(gòu)建DNA疫苗時，可用BgIIl和Sau3AI切割目的基因和質(zhì)粒

B.圖乙中只用ECORl切割后的質(zhì)粒，含有1個游離的磷酸基團

C.用EcoRI切割目的基因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶連接，只產(chǎn)生1種連接產(chǎn)物

D.抗原基因在體內(nèi)表達(dá)時不需要解旋酶

答案BC

解析從圖甲看出，用ECORl切割目的基因后兩端各有一個切口，與圖乙中ECoRl切口對

接時，可有兩種可能，即可產(chǎn)生兩種重組DNA,C項錯誤；基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)錄

時不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D項正確。

3.下列有關(guān)基因工程中載體的說法，正確的是()

A.在進行基因工程操作中，被用作載體的質(zhì)粒都是天然質(zhì)粒

B.所有的質(zhì)粒都可以作為基因工程中的載體

C.質(zhì)粒是一種獨立于細(xì)菌染色體外的鏈狀DNA分子

D.作為載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對重組DNA進行鑒定和選擇的標(biāo)記基因

答案D

解析在進行基因工程操作中，被用作載體的質(zhì)粒是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的，

A錯誤；具有一至多個限制酶切點、具有標(biāo)記基因的質(zhì)粒才可以作為基因工程中的載體，B

錯誤；質(zhì)粒是一種獨立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外的環(huán)狀DNA分子，C錯

誤；作為載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對重組DNA進行鑒定和選擇的標(biāo)記基因，而且能在受

體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存，D正確。

考點二基因工程的基本操作程序

■梳理歸納夯實必備知識

1.目的基因的獲取

(1)化學(xué)合成法直接人工合成目的基因：一般為比較小的目的基因。

(2)基因文庫獲取目的基因：來源可分為基因組文庫和CDNA文庫。

①基因組文庫：指含有某種生物體全部基因片段的重組DNA的克隆群體。從基因組文庫中

篩選某種目的基因，一般采用核酸探針雜交法。

②CDNA文庫：從組織細(xì)胞中提取mRNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)化宿主，

包含著細(xì)胞全部mRNA信息的CDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫。

2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建

(D目的：使目的基因進入受體細(xì)胞并有效表達(dá)，而且要能穩(wěn)定存在且遺傳給后代。

(2)基因表達(dá)載體的組成及作用

目的基因：編碼蛋白質(zhì)的基因或具有

.?/調(diào)控作用的因子

位于目的基因上游,RNA聚合酶

《L貝識別和結(jié)合的部位；能驅(qū)動基

‰rχ?因開始轉(zhuǎn)錄

終止子：位于目的基因的下游，終止目

的基因轉(zhuǎn)錄的脫氧核甘酸序列

標(biāo)記基因:初步篩選出接受了目的基因的

受體細(xì)胞

復(fù)制原點：能與特定的受體細(xì)胞相匹配，使外源

基因在受體細(xì)胞中能穩(wěn)定復(fù)制并遺傳

（3）構(gòu)建過程

奧粒DNG分子

?同一種限制醯或能產(chǎn)生相同

,-----^-末-端-的-限-制S.酶切割

一個切口；兩個黏性末端兩個切口；獲得目的基因

[DNA連接酶

重組DNA分子（重組質(zhì)粒）

【易錯提醒1啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比

項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子

本質(zhì)DNADNAmRNAmRNA

位置目的基因上游~目的基因下游~mRNA首端mRNA尾端

RNA聚合酶識別

和結(jié)合的部位，驅(qū)使轉(zhuǎn)錄在所需要的翻譯的起始信號翻譯的結(jié)束信號

功能

動基因轉(zhuǎn)錄出地方停下來（編碼氨基酸）（不編碼氨基酸）

mRNA

3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

生物

植物哺乳動物微生物

種類

常用

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca?+處理法

方法

受體

體細(xì)胞或受精卵受精卵原核細(xì)胞

細(xì)胞

將目的基因插入Ti質(zhì)粒的取卵一將含有目的基因的Ca?+處理細(xì)胞一細(xì)胞處于

轉(zhuǎn)化

T-DNA中f農(nóng)桿菌一導(dǎo)表達(dá)載體注入一受精卵發(fā)一種容易接受外來DNA

過程

入植物細(xì)胞一整合到受體育f獲得具有新性狀的動的生理狀態(tài)一基因表達(dá)載

細(xì)胞的染色體DNA上f物體導(dǎo)入

表達(dá)

辨析（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入

第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T—DNA上,第二次拼接（非人工操作）是指插入目

的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上:第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒

導(dǎo)入農(nóng)桿菌,第二次導(dǎo)入（非人工操作）是指含目的基因的T—DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。

（2）農(nóng)桿菌特點

①能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物,而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。

②農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒,當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移到被侵

染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。

4.目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測鑒定

考向基因工程的基本操作程序

4.（2022?江蘇高三聯(lián)考）戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白（PoRF2）

位于病毒表面，構(gòu)成病毒的衣殼。我國科研人員利用基因工程技術(shù)，在大腸桿菌中表達(dá)

pORF2,制備戊型肝炎疫苗，過程如圖。下列關(guān)于該疫苗的敘述，正確的是（）

戊型肝炎病毒

大肋什困

大腸桿菌

A.過程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C

B.重組基因表達(dá)載體上的啟動子需來源于戊型肝炎病毒

C.過程⑤需要用聚乙二醇處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀

態(tài)

D.過程⑥大量制備PORF2蛋白前應(yīng)做相應(yīng)的檢測與鑒定

答案D

解析戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，過程①是以病毒RNA為模板合成DNA,獲取目的

基因的過程，需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶，原料是四種脫氧核苔酸，A項錯誤；啟動子是一段有特

殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶識別結(jié)合以驅(qū)動目的基因的轉(zhuǎn)錄，啟動子具有

物種或組織特異性，構(gòu)建在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)PORF2蛋白的載體時，需要選擇大腸桿

菌細(xì)胞的啟動子，而不能選擇其他物種和組織細(xì)胞的啟動子，B項錯誤；將目的基因?qū)胛?/p>

生物細(xì)胞的方法是Ca?+處理法，需要用Ca?+處理大腸桿菌，增大大腸桿菌細(xì)胞壁的透過性，

使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，C項錯誤。

5.下列有關(guān)基因表達(dá)載體的敘述，不正確的是()

A.具有復(fù)制原點，使目的基因能在受體細(xì)胞內(nèi)擴增

B.具有啟動子，作為多肽鏈合成的起始信號

C.具有標(biāo)記基因，有利于目的基因的初步檢測

D.具有目的基因，以獲得特定的基因表達(dá)產(chǎn)物

答案B

解析基因表達(dá)載體必須使目的基因能夠在受體細(xì)胞內(nèi)進行表達(dá)，具有啟動子(啟動轉(zhuǎn)錄)，

作為RNA合成的起始信號，B錯誤。

6.(2021?全國乙，38)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需

要的生物產(chǎn)品。在此過程中要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點如圖

所示。

IIII

GAATTCCCCGGGCTGCAGGATATC

CTTAAGGGGCCCGACGTCCTATAG

tttt

限制酶:EcoRISntaIPstIEcoRV

回答下列問題：

(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，上圖中酶切割

后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接，上圖中酶

切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。

(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是。

(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點，可以保

證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能;質(zhì)粒DNA分子上有,便于

外源DNA的插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩

選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是。

(4)表達(dá)載體含有啟動子，啟動子是指。

答案⑴EcoRLPsflECoRI、PSfI、SZnaI和ECoRV(2)磷酸二酯鍵(3)自我復(fù)制

一至多個限制酶切割位點用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)

粒載體的宿主細(xì)胞（4）位于基因上游的一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段,是RNA聚合酶識

別及結(jié)合的部位，能驅(qū)動轉(zhuǎn)錄過程

解析（1）限制酶EcoRI和PstI切割形成的是黏性末端，限制酶SmaI和EcoRV切割形成

的是平末端，E.c?o"DNA連接酶來源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之

間的磷酸二酯鍵連接起來，而T4DNA連接酶來源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平

末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRI和PSfl切割后的DNA片段（黏性末端）可以用E.coli

DNA連接酶連接，除了這兩種限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaI和ECORV切割后的

DNA片段（平末端）也可以用T4DNA連接酶連接。（3）質(zhì)粒是小型環(huán)狀的DNA分子，常作為

基因表達(dá)的載體，首先質(zhì)粒上含有復(fù)制原點，能保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中自我復(fù)制。質(zhì)粒DNA

分子上有一個至多個限制酶的酶切位點，便于目的基因的導(dǎo)入。質(zhì)粒上的標(biāo)記基因是為了鑒

定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，具體做法是用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠

存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞。

考點三PCR技術(shù)、電泳鑒定及DNA的粗提取和鑒定

■梳理歸納夯實必備知識

1.PCR技術(shù)

⑴過程

變性：94°C條件下受熱變性后解鏈為單鏈

I

退火：55°C條件下，引物與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合

I

延伸：72℃條件下在RqDNA聚合酶作用下合成子鏈

【思考分析】

①在PCR過程中實際加入的為dNTP（即dATP、dGTP.dTTP,dCTP）,既可作為合成DNA

工鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。

②引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細(xì)胞內(nèi)的DNA進行復(fù)制時，也需要引物,

一般為RNA片段。

③真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg二激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加

④PCR擴增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律

磔InJULlnnniEgT

??

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5'I?T哩:

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S'?ΠW∣嗎

5'?πτn皿∩ι^W

3'!j,Huu??∑73,

—目標(biāo)序列

--側(cè)翼序列3,?[a≡s?:

口引物A

循環(huán)：循環(huán)：循環(huán)：

口引物B123

變性-復(fù)性-延伸變性+復(fù)性，延伸變性-復(fù)性-延伸

循環(huán)次數(shù)12τ~n

-

DNA分子數(shù)24^8T

含引物A（或

B）的DNA分1372〃一1

子數(shù)

同時含引物

A、B的DNA0=2l-22=22-26=2」22〃一2

分子數(shù)

共消耗的引

2=2rι-26=22+,-214=23「22π+1-2

物數(shù)量

（2）PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較

（PCR技術(shù)）（DNA復(fù)制）

I

體外（PCR擴增-L----細(xì)胞內(nèi)（主要是

儀中）尸細(xì)胞核內(nèi)）

DNA在高溫下J解’旋

變性解旋—1方式一解旋醐催化

?「解旋酶、

耐高溫的聚合酶

DNAT?LDNA聚合酶

I

在較高溫度下進」l?

行，需控制溫度一［藁件一細(xì)胞內(nèi)溫和條件

工

DNA片段"~（合成對到一DNA分子

TZU

（相同《［）

均需要模板（DNA雙鏈）、原料

（四種脫氧核甘酸）、能量

(3)DNA的電泳鑒定

-瓊脂糖凝膠制備：根據(jù)待分離DNA片段的

大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液

凝膠板制備：將溫?zé)岬沫傊侨芤旱谷肽＞?

插入梳子形成加樣孔，凝膠溶液完全凝固后

電拔出梳子,將凝膠放入電泳槽內(nèi)

泳-一點樣：加電泳緩沖液，然后用微量取液器將

滑擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液的

混合液加入加樣孔，一孔加標(biāo)準(zhǔn)參照物

?電泳：接通電源，設(shè)定好電壓，進行電泳

觀察：在紫外燈下觀察和照相

2.DNA的粗提取和鑒定

(1)基本原理

①原理：利用DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA,去

除其他成分。

②DNA的性質(zhì)：DNA不溶于酒精,但某些蛋白質(zhì)溶于酒精;DNA能溶于2mol?L∣的NaCl

溶液。

③DNA的鑒定：在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色。

(2)過程

［制備雞血細(xì)胞液I

/取備好的雞血細(xì)胞液5~l()mL,注入

［獲取濾液卜5()mL燒杯中,加入20mL蒸/水，攪

〔拌5min,用墊有紗布的漏斗過濾

.取物質(zhì)的Ct濃度為2mol?L-∣的NaCl

溶液40mL加入濾液，用玻璃棒沿

同一方向輕輕攪拌,混合均勻，取

IDNA提取適量蒸倒水沿?zé)诰従徏尤耄?/p>

時玻璃棒沿同一方向輕輕攪拌，當(dāng)

絲狀物不再增加時，停止加蒸鐳水,

、用玻璃棒挑起絲狀物

將絲狀物或沉淀物用2mol∕L的NaCl

溶液溶解,然后加入二苯胺試劑，

DNA的鑒定

混勻后置于沸水浴加熱數(shù)分鐘,冷

卻后觀察顏色變化

■考向突破強化關(guān)鍵能力

考向一PCR技術(shù)及電泳鑒定

7.(多選)利用重疊延伸PCR技術(shù)進行定點突變可以實現(xiàn)對纖維素酶基因進行合理性改造,

其過程如下圖所示。下列分析正確的是()

引-物、a引―2物C

XTX二XTXX

PCRl引物b弓T?d

PCR2

'產(chǎn)物AB:一—

lφ產(chǎn)物CD

AB上鏈

CD下鏈

突變位點

突變產(chǎn)物AD

∣PCR3

大量突變產(chǎn)物AD

A.PCRl過程中的產(chǎn)物AB是依賴引物a和引物b擴增的結(jié)果

B.引物C和引物b上均含有與模板鏈不能互補的堿基

C.①過程需要先加熱至約94℃后再冷卻至約55℃左右

D.②過程需要利用引物a和引物d獲得突變產(chǎn)物AD

答案ABC

8.利用PCR可以在體外進行DNA片段的擴增，下列有關(guān)“DNA片段的擴增及電泳鑒定”

實驗的相關(guān)敘述，錯誤的是（）

A.PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸儲水等在使用前必須進行高壓蒸汽滅菌處理

B.PCR利用了DNA的熱變性原理

C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化

D.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換

答案C

解析PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出之后，皮放在冰塊上緩慢融化，這樣才能不破壞緩沖

液中穩(wěn)定性較差的成分，同樣保護酶的活性不被破壞，C錯誤。

考向二DNA的粗提取與鑒定

9.下列有關(guān)“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是（）

A.新鮮豬血、菜花等動植物材料均可用于DNA的粗提取

B.選用洋蔥作為實驗材料時可以使用吸水漲破法破壞細(xì)胞

C.DNA可溶于蒸儲水，也可溶于2mol/L的NaCl溶液

D.溶有DNA的Nael溶液中加入二苯胺試劑后，顏色呈紫色

答案C

解析豬是哺乳動物，其紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核，所以豬血不能用于DNA的粗提取，A錯誤；

植物材料不能使用吸水漲破法破壞細(xì)胞，B錯誤；DNA不溶于95%的冷酒精，可溶于蒸餡水，

也可溶于2mol/L的NaCl溶液，C正確；溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，需沸水

浴加熱后冷卻，再觀察顏色（呈藍(lán)色），D錯誤。

重溫高考真題演練

1.（2019?江蘇，10）下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的敘述，錯誤的是（）

A.用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近

B.DNA析出過程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂

C.預(yù)冷的酒精可用來進一步純化粗提的DNA

D.用二苯胺試劑鑒定DNA需要進行水浴加熱

答案A

解析哺乳動物（如兔）成熟的紅細(xì)胞中無細(xì)胞核和眾多細(xì)胞器，不能提取到DNA,故兔血不

宜作為該實驗的實驗材料，A錯誤；為防止DNA斷裂，在DNA析出過程中攪拌操作要輕柔

且沿著一個方向，B正確；DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精溶液，

預(yù)冷的酒精溶液可用來進一步純化粗提的DNA,C正確；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯

胺呈現(xiàn)藍(lán)色，因此，用二苯胺試劑鑒定DNA需要進行水浴加熱，D正確。

2.（2020.北京，12）為了對重金屬污染的土壤進行生物修復(fù)，研究者將從楊樹中克隆的重金屬

轉(zhuǎn)運蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中（如圖）。為檢測獲得的轉(zhuǎn)基

因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進行PCR擴

增時，應(yīng)選擇的引物組合是（）

左邊界①③右邊界

二

楊樹內(nèi)源〔楊樹內(nèi)源

啟

終

DNA動HMA3DNA

—

子止

基因子

〕

②④

.（注：①、②、③、④表示引物）

A.①+③B.①+②

C.③+②D.③+④

答案B

解析引物①擴增的片段含有啟動子和HM43基因，引物③擴增的片段不含啟動子，引物②

擴增的片段既含有啟動子，又含有HMA3基因序列。圖示中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運蛋白（HMA3）

基因與外源高效啟動子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中，若要檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有

導(dǎo)入的4用43基因和高效啟動子，需要檢測是否含有高效啟動子序列和43基因序列，應(yīng)

選擇的引物組合是①+②，B正確。

3.（2020?浙江7月選考，24）下列關(guān)于基因工程的敘述，正確的是（）

A.若受體大腸桿菌含有構(gòu)建重組質(zhì)粒時用到的限制性內(nèi)切核酸酶，則一定有利于該重組質(zhì)

粒進入受體并保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定

B.抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某抗鹽植物獲得2個穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因品系，抗性鑒定為抗除草劑抗鹽

和抗除草劑不抗鹽。表明一定是抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉(zhuǎn)入無關(guān)

C.抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某植物獲得轉(zhuǎn)基因植株，其DNA檢測均含目的基因，抗性鑒定為抗除

草劑和不抗除草劑。表明一定是前者表達(dá)了抗性蛋白而后者只表達(dá)抗性基因RNA

D.己知不同分子量DNA可分開成不同條帶，相同分子量的為一條帶，用某種限制性內(nèi)切核

酸酶完全酶切環(huán)狀質(zhì)粒后，出現(xiàn)3條帶。表明該質(zhì)粒上一定至少有3個被該酶切開的位置

答案D

解析基因工程中，若受體大腸桿菌含有構(gòu)建重組質(zhì)粒時用到的限制性內(nèi)切核酸酶（簡稱限制

酶），重組質(zhì)粒進入大腸桿菌體內(nèi)后，該限制酶可以切割重組質(zhì)粒，使重組質(zhì)粒不能保持結(jié)構(gòu)

穩(wěn)定，A項錯誤；將抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某抗鹽植物獲得2個穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因品系，抗性鑒定

為抗除草劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽，若抗除草劑基因轉(zhuǎn)入到抗鹽基因的編碼區(qū)，破壞了抗鹽

基因，則會出現(xiàn)由抗鹽到不抗鹽的改變，可說明抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉(zhuǎn)入有關(guān)，

B項錯誤：抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某植物獲得轉(zhuǎn)基因植株，其DNA檢測均含目的基因，抗性鑒

定為抗除草劑和不抗除草劑，則前者應(yīng)表達(dá)了抗性蛋白，而后者可能表達(dá)了抗性基因RNA

但不能進行翻譯過程，也可能沒有表達(dá)出抗性基因RNA,C項錯誤；已知不同分子量DNA

可分開成不同條帶，相同分子量的為一條帶，用某種限制性內(nèi)切核酸酶完全酶切環(huán)狀質(zhì)粒后，

出現(xiàn)幾條帶則表明該質(zhì)粒上一定至少有幾個被酶切開的位置，注意若完全酶切鏈狀DNA后，

出現(xiàn)3條帶，則表明該DNA上一定至少有3個被酶切開的位置，D項正確。

4.（2020?江蘇，33）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序

列兩側(cè)的序列，具體流程如下圖（以EeRI酶切為例）：

染色體DNA

?語切I絲掰臉

昆合的DNA片段

,」未知序列I已知序列I未知J兩廠LI片段F

∏連接［DNA連接前

已知吃、、

盒蒲成環(huán)狀DNA

In擴增ITagDNA聚合醐一，

______________________PCR產(chǎn)物

IV測序、分析I_________片段F的

53完整序列

請據(jù)圖回答問題：

（1）步驟I用的EcoRI是一種酶，它通過識別特定的切割特定位點。

⑵步驟II用的DNA連接酶催化相鄰核甘酸之間的3'一羥基與5'一磷酸間形成

;PCR循環(huán)中，升溫到94℃是為了獲得；ThqDNA聚合酶的作用是催化

（3）若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計的一些PCR引物，步驟HI選用的PCR引物必須是

一（從引物①②③④中選擇，填編號）。

DNA序列（虛線處省略了部分核苜酸序列）

S^AACTATGCGCTCATGA---------GCAATGCGTAGCCTeT-3'

已知序列IiiiiiIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

.V-TTGATACGCGAGTACT---------CGTTACGCATCGGAGA-5'

①5'-AACTATGCGCTCATGA—3'

②5，-GCAATGCGTAGCCTCT-3,

PCR引物

③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'

@5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'

（4）對PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中（虛線處省略

了部分核甘酸序列），結(jié)果正確的是。

A.5,-AACTATGCG...AGCCCTT-3,

B.5,-AATTCCATG..CTGAATT-3,

c.5,-GCAATGCGT...TCGGGAA-3,

D.5,-TTGATACGC...CGAGTAC-3,

答案（1）限制性內(nèi)切核酸（或限制）核甘酸序列（2）磷酸二酯鍵DNA單鏈以DNA為模

板的DNA鏈的延伸⑶②④（4）B

解析（1）步驟I用的EcoRI是一種限制性內(nèi)切核酸酶，它通過識別特定的核菩酸序列來

進行切割。（2）步躲II中用DNA連接酶催化相鄰核甘酸之間的3'-羥基與5'一磷酸間形成

磷酸二酯鍵。PCR循環(huán)中，升溫到94°C是為了解開DNA雙鏈獲得DNA單鏈，7?gDNA聚

合酶的作用是催化以DNA為模板延伸形成子鏈的過程。（3）PCR過程中，根據(jù)已知的DNA

序列合成兩個引物，要注意模板鏈和引物的方向是相反的，引物的核甘酸序列要能夠和相應(yīng)

模板的核甘酸序列發(fā)生堿基互補配對，環(huán)狀DNA圖中顯示PCR過程是從已知DNA序列的

兩端分別向相反方向形成子鏈，一個引物是與已知DNA序列的第一條鏈的左端互補結(jié)合，

向右側(cè)方向延伸形成子鏈，該引物是④，另一個引物是與已知DNA序列的第二條鏈的右端

互補結(jié)合，向左側(cè)方向延伸形成子鏈，該引物是②。（4）圖中由片段F形成的環(huán)狀DNA的未

-GAATTC-

知序列中有一個ECORI限制酶的切割位點，而以。RI識別的位點是一CTTAAf-,因此片段

F的單鏈中的一端應(yīng)含有“AATTC”序列，另一端應(yīng)含有“TTAAG”序列，只有B

項符合題意。

5?（2021?山東，25）人類γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCLllA蛋白結(jié)合位點，該位

點結(jié)合BCLllA蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變該結(jié)合位點的序列，解除對Y基因

表達(dá)的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療?？蒲腥藛T擴增了Y基因上游不同長度的

片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，以確定BCUIA蛋白結(jié)合位點

的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。

注：

調(diào)控序列Fl-F7.R:引物

丫基因

?及啟動子P:雌性激素誘導(dǎo)下發(fā)

../2揮作用的啟動子

J\一IM

限制酶識別序列及

-------IIIIIIIPIIIIIIIIIIIIIIH

flF2IF7I切割位點：

XhoIMunISal\終止子MunI:C1AATTG

1

載體的部終止熒光蛋BCLllA×ho?:CTCGAG

分結(jié)構(gòu)子白基因P基因ECORI:G*AATTC

Sal?:G1TCGAC

NheIEcoRIMiuiIEcoRIXhoI終止子NheI:G*CTAGC

(1)為將擴增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶識別序

列。據(jù)圖可知，在Fl?F7末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是，在R末端添加的

序列所對應(yīng)的限制酶是。本實驗中，從產(chǎn)物擴增到載體構(gòu)建完成的整個過程共

需要種酶。

(2)將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCLIIA基因的受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)l?F6與R擴增產(chǎn)物

的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光。含F(xiàn)7與R

擴增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光的原因是。

(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌性激素，含F(xiàn)l?F4與R擴增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而含

F5?F6與R擴增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若Y基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對應(yīng)的位

置不含有BCLllA蛋白的結(jié)合位點序列，據(jù)此結(jié)果可推測，BCLllA蛋白結(jié)合位點位于

,理由是。

答案(I)SHlEcoRI6(2)F7與R擴增產(chǎn)物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達(dá)

(3)引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上根據(jù)有無熒光情況判斷，F(xiàn)1-F4

與R擴增產(chǎn)物上均有結(jié)合位點，因此結(jié)合位點位于F4所對應(yīng)調(diào)控序列的下游(右側(cè))；F5?

F6與R擴增產(chǎn)物上均無結(jié)合位點，可知結(jié)合位點位于F5所對應(yīng)調(diào)控序列的上游(左側(cè))，所

以結(jié)合位點位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上

解析(1)據(jù)題意可知