沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用

沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用2024/3/11沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)——是可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合所出現(xiàn)的反應(yīng)。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用第一節(jié)液相沉淀反應(yīng)液相沉淀試驗(yàn)是指可溶性抗原與相應(yīng)的抗體在含電解質(zhì)的液體介質(zhì)中反應(yīng)，形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物的試驗(yàn)。類型：絮狀沉淀試驗(yàn)、環(huán)狀沉淀試驗(yàn)、免疫濁度分析。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用一、絮狀沉淀反應(yīng)原理：將抗原抗體溶液混合在一起，在電解質(zhì)存在下，抗原于抗體結(jié)合，形成絮狀沉淀物。技術(shù)類型：1.抗原稀釋法（Dean-Webb法）2.抗體稀釋法（Ramon法）3.棋盤(pán)格法（Checkerboard法)沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用二、環(huán)狀沉淀試驗(yàn)原理：將抗原溶液疊加在細(xì)小玻璃管中抗體溶液上面，抗原與抗體在兩液交界面處特異性結(jié)合，形成白色沉淀環(huán)。Ascoli1902年創(chuàng)立沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用

方法學(xué)評(píng)價(jià)：該方法操作簡(jiǎn)便、快速。敏感性低（3-20mg/L)，只能定性。主要用于鑒定微量抗原，如鑒定血跡，診斷炭疽?，F(xiàn)在很少使用。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用第二節(jié)凝膠內(nèi)的沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀試驗(yàn)是將可溶性抗原和相應(yīng)抗體分別放入凝膠內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散，兩者在比例合適的位置形成肉眼可見(jiàn)的沉淀環(huán)或沉淀線。常見(jiàn)的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺凝膠。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用凝膠內(nèi)的沉淀試驗(yàn)類型一、單向擴(kuò)散試驗(yàn)1.試管法2.平板法二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)1.免疫電泳2.對(duì)流免疫電泳3.火箭免疫電泳4.免疫固定電泳沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用一、單向擴(kuò)散試驗(yàn)1.試管法

1946年Oudin首次報(bào)道。將抗血清或純化抗體混入約50oC的0.7%瓊脂糖溶液中，注入小口徑試管內(nèi)，帶凝固后，在凝膠上面加入抗原溶液，讓抗原自由擴(kuò)散入凝膠內(nèi)，在抗原與抗體比例恰當(dāng)位置形成沉淀環(huán)。

本法多用于排泄物和組織均勻漿中的細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、螺旋體等抗原的檢測(cè)。沉淀線圖16-12種抗血清形成的沉淀線示意圖AgAb沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用一、單向擴(kuò)散試驗(yàn)二、平板法1.原理：待測(cè)抗原從局部含有相應(yīng)定量抗體的凝膠內(nèi)自由向周圍擴(kuò)散，抗原抗體特異性結(jié)合，在兩者比例合適的部位，形成白色沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原的濃度呈正相關(guān)。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)上排為5個(gè)不同的參考血清，下排為待測(cè)血清沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用2.技術(shù)要點(diǎn)：將抗體或抗血清混入0.9%的瓊脂糖內(nèi)，未凝固前傾注呈平板，凝固后在瓊脂板上打孔（直徑約3-5mm），孔中加入抗原溶液，放室溫或37oC讓其向四周擴(kuò)散，24~48后可見(jiàn)孔周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用3.數(shù)據(jù)處理1.Mancini曲線：適用于大分子抗原和長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)散（>48h)的結(jié)果處理。使用方格計(jì)算紙劃線，擴(kuò)散環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系。公式表示：C/d2=K沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用3.數(shù)據(jù)處理2.Fahey曲線：適用于小分子抗原和較短時(shí)間（24h)擴(kuò)散的結(jié)果處理。使用半對(duì)數(shù)紙劃線，濃度的對(duì)數(shù)與擴(kuò)散圈的直徑之間呈線性關(guān)系。公式表示：logC/d=K沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用4.臨床應(yīng)用常用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等定量測(cè)定。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)1.原理：將抗原和抗體溶液分別放在凝膠不同的對(duì)應(yīng)孔中，讓兩者在凝膠內(nèi)自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原與抗體相遇，濃度比例適當(dāng)處形成可見(jiàn)的白色沉淀線。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用2.技術(shù)要點(diǎn)將加熱融化的瓊脂傾注一均勻的凝膠薄層，待瓊脂凝固后，在瓊脂膠板上打孔，在相對(duì)應(yīng)的孔中分別加入抗原或抗體，置室溫或37℃18-24小時(shí)，觀察沉淀線。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用3.方法評(píng)價(jià)是抗原抗體鑒定的最基本的方法之一。本試驗(yàn)是一種穩(wěn)定、簡(jiǎn)便的方法，不需要特殊儀器設(shè)備，重復(fù)性好，但靈敏度稍差（1.25mg/L)。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用4.臨床應(yīng)用1.抗原或抗體的存在與否及其相對(duì)含量的估算出現(xiàn)沉淀線，表明存在相應(yīng)的抗原和抗體，不出現(xiàn)沉淀線則表明抗原或抗體的缺乏。沉淀線的形成是根據(jù)抗原抗體兩者比例所致，沉淀線靠近抗原孔，提示抗體含量高；靠近抗體孔，提示抗原含量較多。出現(xiàn)多條沉淀絨，則說(shuō)明抗原和抗體皆不是單一的成分。因此，雙向免疫擴(kuò)散可用于鑒定抗原或抗體的純度。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用2．分析抗原或抗體的相對(duì)分子量抗原或抗體在瓊脂內(nèi)擴(kuò)散的速度受分子量的影響。分子量大擴(kuò)散慢，擴(kuò)散圈小，局部濃度則較大，因此形成的沉淀線彎向分子量大的一方。如二者分子量相等，則形成直線（圖16-5）。抗體多為IgG，分子量約150kD，據(jù)此可粗略估計(jì)未知抗原的分子量。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用3．用于抗原性質(zhì)的分析

兩種受檢抗原的性質(zhì)可完全相同、部分相同或完全不同。在一塊瓊脂板上打三個(gè)孔，二個(gè)孔中加入抗原，一個(gè)孔中加入抗體，擴(kuò)散后通過(guò)沉淀線的形態(tài)可鑒定兩種抗原的性質(zhì)（圖16-6）。這種技術(shù)作為抗原的分析，是免疫化學(xué)中較常用的鑒定技術(shù)之一。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用4．用于抗體效價(jià)的滴定

雙向擴(kuò)散技術(shù)是抗血清抗體效價(jià)滴定的常規(guī)方法。固定抗原的濃度，稀釋抗體；或者抗原、抗體雙方皆作不同的稀釋，經(jīng)過(guò)自由擴(kuò)散，形成沉淀線。出現(xiàn)沉淀線的最高抗體稀釋度為該抗體的效價(jià)。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用第三節(jié)免疫電泳技術(shù)免疫電用技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。兩大優(yōu)點(diǎn)：1.加快了沉淀反應(yīng)的速度；2.將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開(kāi)，在分別與抗體反應(yīng)，以此作更細(xì)微的分析。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用一、免疫電泳是區(qū)帶電泳與免疫雙擴(kuò)散的結(jié)合。1953年Grabar和Williams首先報(bào)道。根據(jù)各蛋白所出的電泳位置，可分為白蛋白區(qū)、球蛋白a1區(qū)、a2區(qū)、b區(qū)、γ區(qū)。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用其基本原理是將蛋白質(zhì)抗原在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，樣品中不同的抗原成分因所帶電荷、分子量及構(gòu)型不同，電泳遷移率各異，而被分離成肉眼不可見(jiàn)的若干區(qū)帶。停止電泳后，在與電泳方向平行的瓊脂槽內(nèi)加入相應(yīng)抗體進(jìn)行雙向免疫擴(kuò)散。分離成區(qū)帶的各種抗原成分與相應(yīng)抗體在瓊脂中擴(kuò)散后相遇，在二者比例合適處形成肉眼可見(jiàn)的弧形沉淀線。

沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用血漿蛋白各區(qū)帶位置示意圖沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，與已知的標(biāo)準(zhǔn)（或正常）抗原、抗體形成的沉淀線比較，即可對(duì)樣品中所含成分的種類及其性質(zhì)進(jìn)行分析、鑒定。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用二、對(duì)流免疫電泳原理在瓊脂板上打兩排孔，左側(cè)各孔加入待測(cè)抗原，右側(cè)孔內(nèi)放入相應(yīng)抗體，抗原在陰極側(cè)，抗體在陽(yáng)極側(cè)。通電后，帶負(fù)電荷的抗原泳向陽(yáng)極側(cè)，而抗體籍電滲作用流向陰極抗原側(cè)，在二者之間或抗體的另一側(cè)（抗原過(guò)量時(shí)）形成沉淀線。沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用—+沉淀反應(yīng)在化工中的應(yīng)用三、火箭電泳RIE:又稱為單向擴(kuò)散免疫沉淀技術(shù)。操作：在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測(cè)標(biāo)本后，將抗原置陰極端，用橫距2~3mA/cm的電流強(qiáng)度進(jìn)行電泳?？乖鞠蜿?yáng)極，在抗原抗體比例恰