WB原理流程課件

Westernblot實驗技術(shù)WB原理流程定義：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。WesternBlot是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。

1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法WB原理流程WesternBlot基本原理

WesternBlot：采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。WB原理流程WesternBlot一般流程蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交洗滌二抗雜交洗滌底物顯色WB原理流程通過有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。

細(xì)胞裂解液：0.5ml水+0.5ml裂解液+10μl蛋白酶抑制劑+10μl泛酸鈉+1μlpepstain有機(jī)溶劑提取法對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通過層析或電洗脫法制備目的蛋白蛋白樣品的制備WB原理流程細(xì)胞數(shù)量達(dá)5×106個時就可以做WB。將細(xì)胞裂解液再離心，收集上清液，加loading煮樣5min蛋白樣品制備的注意事項：煮沸5-15min，以充分變性蛋白，保證蛋白從空間結(jié)構(gòu)變?yōu)橐患壗Y(jié)構(gòu)（多聚體解散為單聚體，氧化狀態(tài)轉(zhuǎn)化為還原狀態(tài)等）。有的也可以在700C加熱5-10min，尤其適用于多次跨膜蛋白的檢測（這些蛋白在煮沸狀態(tài)下容易聚集，而聚集狀態(tài)則會影響標(biāo)本進(jìn)入凝膠的效率。）WB原理流程純凈水（ddH2O）丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺（Arc-Bis）。30%（29:1）SDS（10%）Tris-HCL四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合）過硫酸銨(APS)（提供引發(fā)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合的自由基）凝膠成份WB原理流程SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳注意事項：做膠：防止漏膠、進(jìn)氣泡以及花膠(水封、插梳子和拔梳子)。加樣：兩邊加loading，加樣量一樣，加樣時間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散電泳：將膠夾好放于電泳槽中，加電泳buffer（內(nèi)外面不能聯(lián)通），將電壓調(diào)到90V開始電泳，待marker開始分離時將電壓調(diào)到120V，直到溴酚蘭前沿跑出膠后停止電泳。WB原理流程膜的選擇WB原理流程轉(zhuǎn)膜注意事項（一）泡膜： 轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移buffer浸泡20min

（1.凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）

轉(zhuǎn)膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板轉(zhuǎn)膜條件： 0.35A250V1h40min冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜

（具體轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，反之則短。）

WB原理流程轉(zhuǎn)膜的注意事項（二）避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并會使膜臟掉。夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全。保證膜和濾紙的大小和凝膠完全一樣，過大和過小都會影響轉(zhuǎn)膜效率。雞來源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強(qiáng)的結(jié)合能力，從而產(chǎn)生較高的背景，故如果選擇雞來源的抗體最好使用硝酸纖維素膜（NC膜）。WB原理流程封閉（30min）(封閉時間過短會導(dǎo)致背景過深

)5％脫脂奶粉（如果用生物素標(biāo)記的二抗，就不能用奶粉封閉，因為奶粉中含有生物素

）BSA（牛血清蛋白）WesternBlot膜封閉液（谷歌生物提供）WB原理流程一抗、二抗孵育加入一抗溶液孵育（抗體濃度過高會導(dǎo)致背景較深，過低會導(dǎo)致和抗原結(jié)合不充分，出現(xiàn)假陰性）。4℃時過夜?；厥找豢谷芤?，用TBST洗膜3次，每次5min（洗滌不充分會導(dǎo)致膜上非特異性條帶處仍有一抗殘留，會影響二抗結(jié)合的位置不準(zhǔn)確）。加入二抗溶液，搖床上緩慢搖動，室溫25min?；厥斩?，TBST洗膜3次，每次5min。

短時間多次洗膜較長時間少次洗膜更有效。Tween有助于去除非特異性的結(jié)合，減少背景。WB原理流程顯色反應(yīng)注意：發(fā)光法檢測的時候曝光時間要恰到好處，過短會導(dǎo)致曝光不徹底，影響條帶亮度，過長會導(dǎo)致熒光信號衰弱，也會使背景顏色加深。WB原理流程關(guān)于磷酸化蛋白檢測的注意事項：保持待測蛋白處于磷酸化狀態(tài)！在標(biāo)本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑（NaF，可以防止去磷酸化），并將標(biāo)本時刻保持在冰浴中！使用5%的BSA作為封閉試劑！不能使用脫脂奶粉!（因為脫脂奶粉中含有酪蛋白，會出現(xiàn)很高的背景。）WB原理流程抗體保存注意事項：1.收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進(jìn)行分裝和保存！2.對于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在-200C。

2.1

分裝的量以一次實驗用完為好，最少不能少于10ul每份。因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。

2.2

復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在40C，避免再凍起來！

2.3

絕對避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。

3.大部分抗體收到后40C短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。4.長期保存，加入疊氮納，防止細(xì)菌污染

任何時候，絕對避免反復(fù)凍融！WB原理流程WesternBlot常見問題分析WB原理流程SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對齊WB原理流程條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩拔梳子要迅速，且豎直的拔樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適WB原理流程轉(zhuǎn)膜及抗體檢測凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個或多個白點？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離