DB21-T 3095-2018犬非結(jié)核細(xì)菌性肺炎診斷技術(shù)規(guī)范

ICS11.220

B41

備案號(hào)：62056-2019DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3095—2018

犬非結(jié)核細(xì)菌性肺炎診斷技術(shù)規(guī)范

ThetechnicalSpecificationfordiagnosticbacterialofNon-tuberculosismycobacteria

pneumoniaeforcanine

DB21/T3095—2018

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草

本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省畜牧獸醫(yī)局提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：錦州醫(yī)科大學(xué)、鞍山動(dòng)物檢疫站、本溪市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心等單位。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：周鐵忠、畢聰明、盛鵬飛、李春宵、陳勇、張建平、馬強(qiáng)、趙巖、郭維軍、楊

麗、趙剛、劉建華、朱緒銀、高蕾、李德臣、金娜、高柏華、張娜、宋志永、宋寶強(qiáng)、高峰、孫傳祿、

徐暢、何禮。

II

DB21/T3095—2018

犬非結(jié)核細(xì)菌性肺炎診斷技術(shù)規(guī)范

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了犬非結(jié)核細(xì)菌性肺炎診斷的技術(shù)方法、診斷依據(jù)和鑒別診斷。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于我省動(dòng)物診療單位及獸醫(yī)工作者對(duì)犬非結(jié)核細(xì)菌性肺炎的診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的

修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用

于本標(biāo)準(zhǔn)。但是，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究使用這些文件的最新版本。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1肺炎pneumonia

指終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)的炎癥，可由病原微生物、理化因素、免疫損傷、過(guò)敏及藥物所致。按

病因可分為細(xì)菌性肺炎（肺炎鏈球菌、支氣管敗血波氏桿菌、金黃色葡萄球菌等），非典型病原體所致

肺炎（支原體、衣原體、軍團(tuán)菌），病毒性肺炎，肺真菌性肺炎，其他病原體所致肺炎（立克次氏體、

弓形體、肺寄生蟲(chóng)等），理化因素所致肺炎。

3.2非結(jié)核細(xì)菌性肺炎bacterialofNon-tuberculosismycobacteriapneumoniae

細(xì)菌性肺炎指由肺炎鏈球菌、支氣管敗血波氏桿菌、金黃色葡萄球菌等主要病原菌引起的肺炎，不

包括結(jié)核分枝桿菌所致的肺結(jié)核。為了嚴(yán)格區(qū)分本標(biāo)準(zhǔn)將細(xì)菌性肺炎定義為“非結(jié)核細(xì)菌性肺炎”。

3.3感染infection

病原微生物侵入動(dòng)物機(jī)體，并在一定部位定居，生長(zhǎng)繁殖，從而引起機(jī)體一系列病理反應(yīng)，這個(gè)過(guò)

程稱為感染。

3.416SrRNA

16SrRNA基因是細(xì)菌上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的基因組中；16SrRNA具有高度

的保守性和特異性以及該基因序列足夠長(zhǎng)（包含約50個(gè)功能域）等特征，所以，16SrRNA基因檢測(cè)技術(shù)

可做為病原菌檢測(cè)和鑒定的主要方法，應(yīng)用該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌進(jìn)行快速、微量、準(zhǔn)確簡(jiǎn)便地分類

鑒定和檢測(cè)。

4診斷

1

DB21/T3095—2018

依據(jù)流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床癥狀及影像學(xué)特征等作出初步診斷，確診需做病原學(xué)檢測(cè)。

4.1流行病學(xué)特點(diǎn)

在發(fā)病前有接觸感染病原微生物的病犬或帶菌犬，如引入新的病犬未隔離就混群，或居住或到過(guò)細(xì)

菌性肺炎流行的區(qū)域；發(fā)病率高，但致死率低，主要為4月齡以內(nèi)的幼犬發(fā)病，成年犬少見(jiàn)發(fā)病；發(fā)病

前有春秋季節(jié)交替、環(huán)境溫度突變、長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激因素，導(dǎo)致抵抗力下降，誘發(fā)條件性致病菌大量繁

殖而發(fā)病。

4.2臨床癥狀診斷

4.2.1呼吸系統(tǒng)癥狀

表現(xiàn)為咳嗽，痰液膿汁樣黃白色或鐵銹樣或帶血，有時(shí)流鼻汁；呼吸急促，呼吸困難，如舌頭青紫

及鼻翼扇動(dòng)，重者呈點(diǎn)頭狀呼吸、呼氣時(shí)間延長(zhǎng)、出現(xiàn)胸壁吸氣性凹陷或呻吟等；胸部聽(tīng)診肺泡呼吸音

消失，支氣管呼吸濕啰音，健康部位則肺泡音高朗，繼發(fā)胸膜炎可聽(tīng)到胸膜摩擦音；胸部叩診有局灶性

或大面積濁音區(qū)。

4.2.2發(fā)熱及相關(guān)癥狀

體溫升高至39.5℃以上，表現(xiàn)精神沉郁，食欲減退或廢絕，結(jié)膜潮紅或藍(lán)紫。

4.2.3其它方面癥狀

重癥肺炎引發(fā)心力衰竭，出現(xiàn)心率加快，心率不齊，脈搏微弱，可視粘膜明顯發(fā)紺，顏面眼瞼或雙

下肢水腫等癥狀。引發(fā)缺氧中毒性腦病時(shí)出現(xiàn)煩躁、眼球上竄、凝視，昏睡、昏迷、驚厥等癥狀，發(fā)生

缺氧中毒性腸麻痹時(shí)出現(xiàn)頻繁嘔吐、嚴(yán)重腹脹等癥狀。

4.3影像學(xué)特征

胸部X線檢查顯示肺紋理增粗，片狀、斑片狀、大片狀陰影和實(shí)變影，可伴有支氣管充氣征、液氣

囊腔和肋膈角胸腔積液。

4.4外周血檢查特征

采集犬前肢頭靜脈（前臂頭靜脈）或后肢隱靜脈或頸靜脈血液樣本1.0ml，采用血液分析儀或人工

計(jì)數(shù)方法進(jìn)行外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)。應(yīng)用血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)方法按其說(shuō)明書(shū)處理血液樣本，進(jìn)

樣檢測(cè)，儀器自動(dòng)分析、打印結(jié)果。人工計(jì)數(shù)方法取1滴外周血，滴于潔凈無(wú)油脂的玻片制取血涂片，

應(yīng)用瑞氏（Wright's）染色法和姬姆薩（Giemsa）染色法進(jìn)行染色，通過(guò)顯微鏡觀察染色血涂片，計(jì)算

血液中各類白細(xì)胞的數(shù)量和百分率。

細(xì)菌性肺炎白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高，其中中性粒細(xì)胞比例顯著升高，并有核左移現(xiàn)象。

4.5病原學(xué)檢測(cè)

4.5.1細(xì)菌分離培養(yǎng)和涂片鏡檢

無(wú)菌操作采取氣管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、膿液和血液，于血液肉湯培養(yǎng)基中37℃增菌10h后

再劃線接種于血液瓊脂平板和胰蛋白胨大豆瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)；

挑取單個(gè)菌落進(jìn)行染色、鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)。

4.5.2生化試驗(yàn)

2

DB21/T3095—2018

挑取單個(gè)分離菌接種于細(xì)菌微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察、記錄生化反應(yīng)結(jié)果。

4.5.3致病性檢驗(yàn)

將分離菌的純培養(yǎng)物接種于腦心浸液中37℃培養(yǎng)18～24h，并計(jì)算活菌數(shù)。選取5只健康小鼠，每只

腹腔注射菌液0.25ml(2.1×108CFU/ml)菌液；另取5只體重相近的健康小鼠，每只腹腔注射等量滅菌腦

心浸液。小鼠攻毒后連續(xù)7天觀察臨床表現(xiàn)及死亡情況。取發(fā)病死亡小鼠的肺、肝接種血液瓊脂平板等

培養(yǎng)基，均生長(zhǎng)出與原分離菌相同的菌。

病原學(xué)檢測(cè)有關(guān)試驗(yàn)使用蒸餾水按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》要求準(zhǔn)備。

4.5.4分子生物學(xué)鑒定

應(yīng)用16SrRNA基因序列分析法鑒定細(xì)菌，首先合成用于擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因序列的通用引

物：

27f:5ˊ-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3ˊ；

1492r:5ˊ-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3ˊ。目的基因1492bp

按照通用型柱式基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取待檢病料所分離培養(yǎng)的細(xì)菌基因組DNA，然后

在PCR反應(yīng)管中按相應(yīng)反應(yīng)體系加入提取的DNA（3μL）、上下游引物（各1μL）、TaqMix（15μL）、

ddH2O（10μL）等試劑；

應(yīng)用PCR擴(kuò)增儀按相應(yīng)反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變5min；94℃變性30s，

55℃退火30s；72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃終止反應(yīng)。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到目的片段后，按照《瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒》（OMEGA）的說(shuō)明及步驟

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，回收產(chǎn)物作為測(cè)序模板進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序要求測(cè)通。

對(duì)所測(cè)出的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，即登陸NCBI網(wǎng)站（）

的Blastn在線軟件，粘貼測(cè)序所得的16SrRNA基因序列，獲取與該基因同源高的序列和相應(yīng)的細(xì)菌名

稱，若同源性大于97%，可以確定為同種細(xì)菌。

16SrRNA基因序列分析法鑒定細(xì)菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳參考圖：

圖1鑒定菌株16SrRNAPCR電泳圖

注：M．DL2000DNAMarker;1.陽(yáng)性對(duì)照；2-6.陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物；N.陰性對(duì)照

細(xì)菌性肺炎主要致病菌分離培養(yǎng)和形態(tài)特征、生化鑒定以及分子生物學(xué)鑒定具體方法和結(jié)果判定依

據(jù)見(jiàn)附錄1

5診斷結(jié)果判定

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5.1初步診斷

根據(jù)流行病學(xué)特征和典型臨床癥狀，結(jié)合外周血、X線影像學(xué)特征，可作出初步診斷。

5.2確診

依據(jù)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果，確定是何種細(xì)菌感染，做出確診。

6鑒別診斷

需要與細(xì)菌性肺炎進(jìn)行鑒別的重點(diǎn)疾病包括上呼吸道感染、犬副流感病毒感染、肺炎支原體肺炎、

肺炎衣原體肺炎、軍團(tuán)菌性肺炎、真菌性肺炎、病毒性肺炎、肺結(jié)核。其它需要鑒別的疾病還包括肺部

腫瘤、肺水腫、肺氣腫、理化因素所致非感染性肺炎等。

需要與細(xì)菌性肺炎鑒別的重點(diǎn)疾病的具體鑒別診斷要點(diǎn)見(jiàn)附錄2

A

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附錄A

（資料性附錄）

細(xì)菌性肺炎主要致病菌分離鑒定具體方法和結(jié)果判定依據(jù)

一、鏈球菌的分離鑒定

1.細(xì)菌學(xué)鑒定

1.1細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無(wú)菌操作采取氣管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、膿液和血液，于血液肉湯培養(yǎng)基中37℃增菌10h后

再劃線接種于血液瓊脂平板和腦心浸出液培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察。在血液瓊脂平板上應(yīng)生長(zhǎng)

出濕潤(rùn)無(wú)色透明邊緣整齊的光滑型菌落。菌落周圍有明顯的β-溶血環(huán)，直徑約5.0mm；在腦心浸出液培

養(yǎng)基上為灰白色光滑菌落。

1.2細(xì)菌形態(tài)觀察

挑取血瓊脂平板中的單個(gè)菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)，結(jié)果應(yīng)為革蘭陽(yáng)性鏈球

菌。

鏈球菌分離培養(yǎng)和涂片鏡檢參考圖片：

圖A.1分離菌在腦心浸出液培養(yǎng)

圖A.2分離菌在血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)

圖A.3鏡檢下分離菌形態(tài)結(jié)構(gòu)

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1.3生化試驗(yàn)

分離菌經(jīng)24h鮮血瓊脂平板純培養(yǎng)后，進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)和其他生化試驗(yàn)，結(jié)果應(yīng)如表A.1中所列。

表A.1鏈球菌的生化反應(yīng)結(jié)果

項(xiàng)目結(jié)果項(xiàng)目結(jié)果項(xiàng)目結(jié)果

V-P試驗(yàn)-山梨醇+甜醇-

6.5%NaCl-阿拉伯糖-半乳糖+

淀粉酶試驗(yàn)+果糖+棉籽糖-

葡萄糖+肌醇-菊糖-

蔗糖+木糖-水楊素+

衛(wèi)矛醇-麥芽糖+海藻糖+

鼠李糖-乳糖+柳醇+

2.分子生物學(xué)鑒定

2.1應(yīng)用16SrRNA基因序列分析法鑒定細(xì)菌，首先合成用于擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因序列的通用引

物：

27f:5ˊ-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3ˊ；

1492r:5ˊ-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3ˊ。目的基因1492bp

2.2按照通用型柱式基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取待檢病料所分離培養(yǎng)的細(xì)菌基因組DNA，然后在

PCR反應(yīng)管中按相應(yīng)反應(yīng)體系加入提取的DNA（3μL）、上下游引物（各1μL）、TaqMix（15μL）、ddH2O

（10μL）等試劑；

2.3應(yīng)用PCR擴(kuò)增儀按相應(yīng)反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變5min；94℃變性30s，55℃

退火30s；72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃終止反應(yīng)。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝

膠電泳檢測(cè)，得到目的片段后，按照《瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒》（OMEGA）的說(shuō)明及步驟對(duì)PCR擴(kuò)

增產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，回收產(chǎn)物作為測(cè)序模板進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序要求測(cè)通。

2.4對(duì)所測(cè)出的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，即登陸NCBI網(wǎng)站（）的

Blastn在線軟件，粘貼測(cè)序所得的16SrRNA基因序列，獲取與該基因同源高的序列和相應(yīng)的細(xì)菌名稱，

若同源性大于97%，可以確定為鏈球菌同種細(xì)菌。

16SrRNA基因序列分析法鑒定鏈球菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳參考圖：

圖A.4鑒定菌株16SrRNAPCR電泳圖

注：M．DL2000DNAMarker;1.陽(yáng)性對(duì)照；2-6.陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物；N.陰性對(duì)照

3.致病性檢驗(yàn)

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DB21/T3095—2018

取10只小鼠隨機(jī)分為2組，即試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。無(wú)菌吸取上述經(jīng)生化鑒定的分離菌的血清

肉湯純培養(yǎng)物腹腔注射實(shí)驗(yàn)組小白鼠，每只注射0.2ml（4×108CFU/ml）對(duì)照組每只小白鼠腹腔注射0.2

ml無(wú)菌肉湯。注射后小鼠隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病及死亡情況，并對(duì)死亡小鼠的心血、腦、肝臟、脾臟進(jìn)

行細(xì)菌分離鑒定。觀察到試驗(yàn)組小鼠注射24h后應(yīng)表現(xiàn)出不同程度的精神萎靡，毛皮粗糙豎起，呼吸急

促、采食減少等現(xiàn)象；對(duì)照組小鼠無(wú)此現(xiàn)象。試驗(yàn)組小鼠72h后全部死亡。將死亡小鼠剖檢，將臟器分

離培養(yǎng)，應(yīng)得到細(xì)菌的培養(yǎng)特性、細(xì)菌形態(tài)、生化特性應(yīng)均與接種細(xì)菌一致，表明分離菌為致病性鏈球

菌。

二、葡萄球菌的分離鑒定

1.細(xì)菌學(xué)鑒定

1.1形態(tài)學(xué)檢查

無(wú)菌操作采取氣管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、膿液和血液直接涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢?？梢?jiàn)

G+球菌，圓形或卵圓形，直徑約1μm，呈葡萄串狀排列，無(wú)鞭毛、無(wú)芽孢、無(wú)莢膜。

葡萄球菌涂片鏡檢參考圖如下：

圖A.5葡萄球菌革蘭氏染色后鏡檢形態(tài)

1.2分離培養(yǎng)

將上述病料于血液肉湯培養(yǎng)基中37℃增菌10h后，再接種于鮮血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18~24h后觀察，

并挑取可疑菌落，涂片鏡檢。該菌在鮮血瓊脂平板上形成圓形、突起、邊緣整齊、表面光滑的白色菌落，

未見(jiàn)有色素沉著，菌落周圍有明顯的β-溶血環(huán)。菌落形態(tài)與鏈球菌類似。

1.3鑒別培養(yǎng)

將鏡檢后的可疑菌落接種于高甘露醇瓊脂平板37℃培養(yǎng)24~48h培養(yǎng)觀察結(jié)果。在高甘露醇瓊脂平板

上形成1mm左右、凸起、黃色菌落，有金黃色色素產(chǎn)生，菌落周圍的培養(yǎng)基由紅色變成黃色。

1.4純培養(yǎng)

挑取可疑菌落轉(zhuǎn)種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18~24h。

1.5生化試驗(yàn)

將純培養(yǎng)菌分別接種于H2S反應(yīng)管和葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、甘露

醇、尿素等微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)24～48h后觀察結(jié)果。該菌能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、

蔗糖、果糖、木糖、阿拉伯糖，不產(chǎn)生H2S，不分解尿素。

2.分子生物學(xué)鑒定

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DB21/T3095—2018

應(yīng)用16SrRNA基因序列分析法鑒定細(xì)菌的通用引物、方法條件同鏈球菌；PCR產(chǎn)物測(cè)序與DNA序

列分析將所得到的序列與GenBank中FJ899095.1金黃色葡萄球菌株16SrRNA序列進(jìn)行對(duì)比，同源性達(dá)

到96%以上即可以確定。

金黃色葡萄球菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳目的條帶參考圖如下：

圖A.6金黃色葡萄球菌16SrRNA序列基因PCR檢測(cè)圖

注：M．DM2000;1、3陽(yáng)性樣本；2.陽(yáng)性對(duì)照（CQHC4CSA002）；4.陰性對(duì)照

3.致病性檢驗(yàn)

3.1血漿凝固酶試驗(yàn)

無(wú)菌采取健康家兔的血液，肝素抗凝，離心后去血細(xì)胞，取上層血漿備用。將新鮮兔血漿用滅菌生

理鹽水作1:4稀釋，分裝于小試管中，每管0.5ml；取12h分離菌株肉湯培養(yǎng)液0.5ml，接種于含有0.5ml血

漿的試管中，37℃培養(yǎng)，每0.5h觀察1次，觀察6h判定結(jié)果；同時(shí)用已知的血漿凝固酶陽(yáng)性和陰性的

葡萄球菌及肉湯培養(yǎng)基作對(duì)照。已知的陽(yáng)性菌株和待檢菌株均使血漿呈膠凍狀凝固，而陰性菌株和肉湯

培養(yǎng)基均無(wú)上述變化，則結(jié)果可判為陽(yáng)性。

3.2.致病性試驗(yàn)

取清潔級(jí)小鼠5只，分離菌株24h肉湯培養(yǎng)液（1.5×108CFU/ml）；經(jīng)不同途徑接種：1只小鼠皮

下注射菌液1.0ml；1只小鼠腹腔注射菌液1.0ml；2只小鼠分別從靜脈注射菌液0.5ml；1只小鼠由靜脈

注射滅菌生理鹽水1ml作為空白對(duì)照。分別隔離觀察，皮下注射菌液小鼠24h后注射部位皮膚應(yīng)發(fā)生潰

瘍性壞死；腹腔接種菌液的小鼠48h后接種部位應(yīng)局部出現(xiàn)化膿灶；靜脈接種菌液的2只小鼠，均應(yīng)在24～

48h死亡。病鼠剖檢后，應(yīng)可見(jiàn)肝臟、腎臟等臟器腫大，腦組織軟化、空虛，與自然病變相似，取病灶

部的病料培養(yǎng)后均分離到接種菌；對(duì)照的小鼠應(yīng)健康存活，剖檢后其器官組織未見(jiàn)上述病變。發(fā)病或死

亡者再進(jìn)行病原菌分離鑒定。

三、支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定

1.細(xì)菌學(xué)鑒定

1.1細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無(wú)菌操作采取氣管吸取物、肺泡灌洗液、胸水、膿液和血液，于血液肉湯培養(yǎng)基中37℃增菌10h后

再劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察。在胰蛋白胨大豆瓊脂平板上生長(zhǎng)出圓

形、光滑、米黃色的小菌落。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行染色、鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)。結(jié)果為革蘭氏陰性中等

大小桿菌，多呈單個(gè)存在。

1.2生化試驗(yàn)

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挑取單個(gè)分離菌接種于細(xì)菌微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)18~24h，觀察、記錄生化反應(yīng)結(jié)果。該菌分解

氨基酸，不分解糖類，不產(chǎn)硫化氫，枸櫞酸鹽、脲酶、氧化酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，ONPG、VP、吲哚試驗(yàn)為陰

性。

2.分子生物學(xué)鑒定

應(yīng)用16SrRNA基因序列分析法鑒定細(xì)菌的通用引物、方法條件同鏈球菌；PCR產(chǎn)物測(cè)序與DNA序

列分析純化、回收PCR產(chǎn)物，送交測(cè)序公司測(cè)序，利用NCBI的BLAST工具對(duì)分離菌的16SrRNA的基

因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果顯示該菌株與序列(GenBank序列號(hào)：AP014582.1)同源性為96%以上，則

可確定分離菌株為支氣管敗血波氏桿菌。

3.致病性檢驗(yàn)

將分離菌的純培養(yǎng)物接種于腦心浸液中37℃培養(yǎng)18~24h，并計(jì)算活菌數(shù)。選取5只健康小鼠，每只

腹腔注射菌液0.25ml（2.1×108CFU/ml）菌液；另取5只體重相近的健康小鼠，每只腹腔注射等量滅菌

腦心浸液。小鼠攻毒后連續(xù)7天觀察臨床表現(xiàn)及死亡情況。試驗(yàn)小鼠于接種菌液后出現(xiàn)精神萎靡，食欲、

飲欲廢絕，被毛雜亂等臨床癥狀，在48h內(nèi)全部死亡。對(duì)照組小鼠在觀察期內(nèi)，全部健康存活。死亡小

鼠眼觀主要病變?yōu)榉闻K、肝臟和腸等出血、壞死。取死亡小鼠的肺、肝接種胰蛋白胨大豆瓊脂平板，均

生長(zhǎng)出與原分離菌相同的菌。

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BB

附錄B

（資料性附錄）

犬細(xì)菌性肺炎的鑒別診斷

一、犬細(xì)菌性肺炎應(yīng)與如下重點(diǎn)疾病進(jìn)行鑒別診斷

1.上呼吸道感染

環(huán)境溫度不穩(wěn)定是本病的主要原因，不同年齡犬均可發(fā)生，幼犬發(fā)病率相對(duì)較高?；既啾憩F(xiàn)為輕

度咳嗽，少數(shù)病例出現(xiàn)干嘔或吐出未消化的食物。體溫正常，肺部聽(tīng)診無(wú)明顯變化。氣管聽(tīng)診，聲音粗

糲。臨床觸診喉部和氣管敏感，人工誘咳后持續(xù)咳嗽，甚至繼發(fā)干嘔；血常規(guī)檢查無(wú)明顯變化，少數(shù)病

例白細(xì)胞水平輕度升高；血清C反應(yīng)蛋白（CRP）輕度升高；X線檢查可見(jiàn)氣管內(nèi)影像增強(qiáng)，肺部影像

無(wú)明顯變化。

2.犬副流感病毒感染

本病是由副粘病毒科，副粘病毒屬的犬副流感病毒（CanineParainfluenzaVirus,CPIV）引起的犬呼

吸道性傳染病，可以侵害任何年齡的犬。此病的病程為一周以上，少數(shù)病例可長(zhǎng)達(dá)數(shù)月之久。大多數(shù)犬

可隨著機(jī)體抵抗力的提高而逐漸康復(fù)，少數(shù)犬會(huì)因?yàn)橹委煵患皶r(shí)繼發(fā)支氣管肺炎?；既憩F(xiàn)為干咳，咳

嗽隨著運(yùn)動(dòng)增加和氣管、喉部誘咳或食物以及寒風(fēng)的刺激而加劇；精神、食欲等均正常；一般不發(fā)熱；

肺部聽(tīng)診和血常規(guī)檢查無(wú)明顯變化；血清C反應(yīng)蛋白（CRP）水平輕度升高；X線檢查可見(jiàn)氣管內(nèi)影像

增強(qiáng)，肺部影像無(wú)明顯變化。

通過(guò)病原分離鑒定和分子生物學(xué)檢測(cè)病毒核酸可區(qū)分其它病原。

3.犬支原體肺炎

本病由支原體（Mycoplasma）引起，潛伏期較長(zhǎng)?；既w況良好時(shí)，不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。發(fā)

病初期，臨床癥狀與犬上呼吸道感染相似。該病起病較慢，少數(shù)病例伴有發(fā)熱、無(wú)力等癥狀。血常規(guī)檢

查一般無(wú)明顯變化，個(gè)別病例出現(xiàn)白細(xì)胞數(shù)輕度升高，中性粒細(xì)胞比率升高。長(zhǎng)期的咳嗽是本病的主要

臨床特征，尤以凌晨時(shí)咳嗽最為重劇，經(jīng)治療后，咳嗽還可持續(xù)1-2周；X線檢查可見(jiàn)氣管內(nèi)影像增強(qiáng)。

應(yīng)用支原體膠體金抗體檢測(cè)卡檢測(cè)患犬血液中支原體抗體可作為重要診斷依據(jù)。通過(guò)通過(guò)病原分離

鑒定和分子生物學(xué)檢測(cè)方法可區(qū)分其它病原。

4.犬衣原體肺炎

本病由衣原體（Chlamydia）引起，潛伏期較長(zhǎng)。患犬體況良好時(shí)，不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。發(fā)病

初期，臨床癥狀與犬上呼吸道感染、犬支原體肺炎相似。即起病較慢，少數(shù)病例伴有發(fā)熱、無(wú)力等癥狀。

血常規(guī)檢查一般無(wú)明顯變化，個(gè)別病例出現(xiàn)白細(xì)胞數(shù)輕度升高，中性粒細(xì)胞比率升高。長(zhǎng)期的咳嗽，尤

以凌晨時(shí)咳嗽最為重劇。經(jīng)治療后，咳嗽還可持續(xù)1-2周。X線檢查可見(jiàn)氣管內(nèi)影像增強(qiáng)。

應(yīng)用支原體膠體金抗體檢測(cè)卡檢測(cè)患犬血液中支原體抗體可作為重要診斷依據(jù)。通過(guò)通過(guò)病原分離

鑒定和分子生物學(xué)檢測(cè)方法可區(qū)分其它病原。

5.犬霉菌性肺炎

犬霉菌性肺炎是由霉菌和霉菌孢子引起的一種慢性炎癥，本病與飼養(yǎng)環(huán)境和季節(jié)密切相關(guān)。臨床上

常見(jiàn)的致病菌有曲霉菌、組織胞漿菌、隱球菌、芽生菌和諾卡氏菌等。本病具有支氣管肺炎的癥狀，但

呈亞急性及慢性經(jīng)過(guò)?；既粑щy，漸進(jìn)性消瘦，并伴有角膜渾濁或潰瘍?；既畯谋强琢鞒鑫鄯x的鼻

液，顯微鏡檢查可見(jiàn)霉菌的菌絲。死亡患犬剖檢可見(jiàn)肺臟上有大小不一的結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)周圍有結(jié)締組織

膜包裹，內(nèi)容物鏡檢可見(jiàn)霉菌菌絲。

6.犬瘟熱

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犬瘟熱是由犬瘟熱病毒（Caninedistempervirus）引起的一種高度接觸性傳染病，傳染性強(qiáng)，死亡

率可高達(dá)80%以上。犬瘟熱癥狀初期狗的體溫高達(dá)39.5～41℃，食欲不振，精神沉郁，眼鼻流出水樣分

泌物，打噴嚏，有腹瀉。在以后2～14天內(nèi)再次出現(xiàn)體溫升高，咳嗽，有膿性鼻涕。同時(shí)繼發(fā)胃腸道疾

病，嘔吐、拉稀，食欲廢絕。精神高度沉郁，嗜睡。犬瘟熱發(fā)病后期就會(huì)出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀，口吐白

沫，抽搐。

應(yīng)用支原體膠體金抗體檢測(cè)卡檢測(cè)患犬血液中支原體抗體可作為重要診斷依據(jù)。通過(guò)通過(guò)病原分離

鑒定和分子生物學(xué)檢測(cè)方法可區(qū)分其它病原。

7.犬結(jié)核性肺炎

犬的結(jié)核?。╰uberculosis）主要由分枝桿菌屬（Mycobacterium）的人型結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核

分枝桿菌感染發(fā)病，極少數(shù)被禽型分枝桿菌感染。本病屬于一種慢性消耗性疾病，潛伏期長(zhǎng)短不一，與

犬的年齡、休質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)和管理情況有關(guān)?；既话懵愿腥?，在相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)不表現(xiàn)癥狀，以后出現(xiàn)

食欲不振、容易疲勞、虛弱、進(jìn)行性消瘦，精神不振等。肺結(jié)核表現(xiàn)咳嗽（干咳），后期轉(zhuǎn)為濕咳，并

有黏液膿性的痰，伴有低熱、消瘦、貧血等癥狀出現(xiàn)。病變部聽(tīng)診有支氣管肺泡呼吸音和濕羅音；結(jié)核

病蔓延到心包和胸膜時(shí)，呼吸困難，發(fā)紺和右心衰竭；伴發(fā)腹部型結(jié)核時(shí)，腹部觸壓可觸到腹腔臟器有

大小不同的腫塊，腸系膜淋巴結(jié)腫大；表現(xiàn)嘔吐、腹瀉，皮膚結(jié)核多發(fā)于喉頭和頸部，病灶邊緣呈不規(guī)

則的肉芽組織潰瘍。骨結(jié)核可表現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙、跛行，并易出現(xiàn)骨折。

肺部結(jié)核通過(guò)放射線透視或照相檢查，可見(jiàn)有鈣化病灶或空洞影。

可用結(jié)核菌素進(jìn)行皮內(nèi)試驗(yàn)，在皮內(nèi)注射結(jié)核菌素250單位，觀察皮膚腫塊是否在判定標(biāo)準(zhǔn)以上。

用鼻腔分泌物、痰液、乳汁、及其他病灶進(jìn)行涂片，抗酸染色后進(jìn)行鏡檢，可以直接看到結(jié)核桿菌。

二、犬細(xì)菌性肺炎與其他肺部疾病的鑒別診斷

臨床上許多肺部疾病，如肺腫瘤、肺水腫、肺氣腫和理化因素所致的非感染性肺炎，在發(fā)病初期同

樣具有細(xì)菌性肺炎的臨床癥狀。但此類疾病均具有特定的致病原因。通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查及影像學(xué)、病理

學(xué)診斷方法可以鑒別診斷。

________________________________

11

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目次

前言............................................................................II

1范圍..............................................................................1

2規(guī)范性引用文件....................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義........................................................................1

3.1肺炎pneumonia...............................................................1

3.2非結(jié)核細(xì)菌性肺炎bacterialofNon-tuberculosismycobacteriapneumoniae....1

3.3感染infection...............................................................1

3.416SrRNA.......................................................................1

4診斷..............................................................................1

4.1流行病學(xué)特點(diǎn)..................................................................2

4.2臨床癥狀診斷..................................................................2

4.2.1呼吸系統(tǒng)癥狀..............................................................2

4.2.2發(fā)熱及相關(guān)癥狀............................................................2

4.2.3其它方面癥狀..............................................................2

4.3影像學(xué)特征....................................................................2

4.4外周血檢查特征................................................................2

4.5病原學(xué)檢測(cè)....................................................................2

4.5.1細(xì)菌分離培養(yǎng)和涂片鏡檢....................................................2

4.5.2生化試驗(yàn)..................................................................2

4.5.3致病性檢驗(yàn)................................................................3

4.5.4分子生物學(xué)鑒定............................................................3

5診斷結(jié)果判定......................................................................3

5.1初步診斷......................................................................4

5.2確診..........................................................................4

6鑒別診斷..........................................................................4

附錄A（資料性附錄）細(xì)菌性肺炎主要致病菌分離鑒定具體方法和結(jié)果判定依據(jù)..............5

附錄B（資料性附錄）犬細(xì)菌性肺炎的鑒別診斷.........................................10

I

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目次

前言............................................................................II

1范圍..............................................................................1

2規(guī)范性引用文件....................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義........................................................................1

3.1肺炎pneumonia............................