微生物降解香菇栽培料中的棉酚

姓名：包劉媛學(xué)號(hào)：20111052112微生物降解香菇栽培袋料中的棉酚研究可行性分析課題背景、意義、思路材料與方法參考文獻(xiàn)目錄一、課題背景、意義、思路1、背景：①香菇營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，并具有藥用價(jià)值。分布廣，尤其是云南地區(qū)。大量種植香菇給千家萬(wàn)戶帶來(lái)了豐厚的回報(bào)。香菇的栽培方式主要有段木栽培、袋料栽培兩種，而袋料栽培是最為通用的。但是香菇在收獲之后剩下了大量的栽培袋料，雖然香菇栽培袋料中含有大量的蛋白質(zhì)，粗脂肪，纖維素等營(yíng)養(yǎng)成分，是一種非常好的資源，但是由于使用棉籽殼作為其主要原料，它含有一定量的有毒物質(zhì)-棉酚，會(huì)對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)、發(fā)育和繁殖等產(chǎn)生不良的影響，因此不能將其再使用，成為一種廢棄物和污染源，造成巨大的浪費(fèi)。②國(guó)家在飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定肉用仔雞，生長(zhǎng)雞配合飼料中的游離棉酚的允許量不得大于100mg／kg，肉用仔豬，生長(zhǎng)肥育豬配合飼料中的游離棉酚的允許量不得大于60mg/kg．歐盟對(duì)單胃動(dòng)物日糧中游離棉酚允許量的規(guī)定與中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)一樣，除此之外還規(guī)定了反芻動(dòng)物日糧中游離棉酚允許量，其成年牛，山羊，綿羊≤500mg／kg，犢?！?00mg／kg，其他不含棉籽餅粕飼料和配合飼料≤20mg／kg．因此如果將香菇栽培袋料作為飼料再利用，必須除去栽培袋料中的棉酚，既可作為飼料在利用。③傳統(tǒng)棉酚脫毒主要可分為物理脫毒法，化學(xué)處理法等．然而物理脫毒法脫毒率低，化學(xué)法會(huì)造成溶劑殘留等缺點(diǎn)，因此近幾年新興的棉酚脫毒方法主要是微生物發(fā)酵法脫毒．2、意義：本課題嘗試從飼料允許添加的微生物菌種中，篩選出最優(yōu)的菌種和發(fā)酵方式，通過(guò)發(fā)酵過(guò)程條件優(yōu)化，獲得符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的新飼料源，并提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和利用率．3、思路：①、由于棉籽餅發(fā)酵脫毒常用的菌株為黑曲霉，乳酸菌，釀酒酵母，而本研究主要目的是對(duì)香菇栽培袋料中的棉籽殼進(jìn)行脫毒，所以選用以上三種菌種進(jìn)行單菌發(fā)酵及復(fù)合發(fā)酵處理。②、由于溫度、含水量、接種量因素的影響，所以要設(shè)置不同的條件進(jìn)行試驗(yàn)。③、若由上兩點(diǎn)組合控制變量試驗(yàn)，工作量太大，可以先設(shè)定一個(gè)常規(guī)條件用上述三種菌種進(jìn)行單菌發(fā)酵及復(fù)合發(fā)酵處理，看其脫毒效果。若效果明顯再進(jìn)行控制變量單因子優(yōu)化試驗(yàn)。二、材料與方法1、材料①樣品：香菇栽培料（由楚雄種植香菇處提供，樣品均粉碎后備用。）②設(shè)備：培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋，超聲波儀，離心機(jī)，真空抽濾儀，研磨機(jī)，冰箱等．③儀器：陶瓷盤(pán)，量筒，滴管，容量瓶，三角瓶，試管等。⑤試劑：棉酚標(biāo)準(zhǔn)品(含99％純棉酚)，濃鹽酸，丙酮，間苯三酚，95％乙醇等。⑥菌種：干酪乳桿菌(LacticacidbacteriaT7)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，黑曲霉(Aspergillusniger)C（對(duì)照組）R:干酪乳桿菌組J:釀酒酵母組H:黑曲霉組R+J（1:1）R+H（1:1）H+J（1:1）H+J+R（1:1:1)條件：溫度37℃，接種量10%，含水量50%，20g/組香菇栽培袋料①微生物固體發(fā)酵：將栽培袋料和菌種攪拌均勻后，蓋上6層潤(rùn)濕紗布防止灰塵，放人恒溫培養(yǎng)箱中37℃發(fā)酵48h，結(jié)束后60℃烘干，48h后存放于干燥器中待測(cè)。2、方法②、游離棉酚測(cè)定方法：A、棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備．準(zhǔn)確稱取0.005g棉酚標(biāo)準(zhǔn)品，用70％丙酮溶液溶解，并用50mL容量瓶定容，溶液棉酚濃度100μg/mL．B、顯色劑的配置：用100mL量筒量取16.6mL濃鹽酸(12.0mol/L)，加入95％的乙醇至100mL刻度，倒入100mL三角瓶中，搖勻，再加入1g間苯三酚，溶解后混合置于三角瓶中放入冰箱中備用(顯色劑顏色變黃時(shí)不能使用，現(xiàn)配現(xiàn)用)．

C、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制．準(zhǔn)確吸取100μg/mL棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL加入10mL試管內(nèi)，編號(hào)1-6號(hào),再依次加入70％丙酮溶液1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0mL，各試管中再加入2mL顯色劑，搖勻，在55℃恒溫水浴箱中加熱5min．用70％丙酮溶液調(diào)零，在550nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其回歸方程。

D、樣品棉酚含量的測(cè)定．準(zhǔn)確稱取樣品1.0g于具塞錐形瓶中，首先加入約15mL丙酮溶液，蓋上瓶塞，超聲15min，9000rpm條件下離心，將上清液回收于100毫升試管中靜置，重復(fù)以上步驟兩次，用中速濾紙將回收的上清液過(guò)濾于50mL容量瓶中，丙酮溶液洗滌并定容．移取濾液1mL于試管中，各加入2mL顯色劑，搖勻，測(cè)定550nm處吸光值，計(jì)算濾液棉酚含量．

E、樣品棉酚含量計(jì)算．計(jì)算公式：Y=（X*Z）/(n*m)式中，y為樣品中游離棉酚的含量(mg/kg)；X為測(cè)定用樣液中游離棉酚的含量(μg/mL)；Z為樣品提取液體積(mL)；力為稱取的樣品質(zhì)量(g)；m為吸取濾液體積(mL)．脫毒率的計(jì)算：脫毒率(％)=1一樣品棉酚含量/對(duì)照棉酚含量

③單因子優(yōu)化：

稱量20g粉碎過(guò)篩的香菇栽培袋料至陶瓷盤(pán)中，選取合適的發(fā)酵菌種，進(jìn)行含水量，溫度，接種量三個(gè)因素的單因素優(yōu)化試驗(yàn)．接種量：按照5％，10％，15％，20％，25％的接種量接人處理過(guò)的香菇栽培袋料中，含水量50％，37℃發(fā)酵48h，發(fā)酵結(jié)束后烘干48h測(cè)定棉酚含量．

含水量：按照50％，55％，60％，65％，70％的含水量，固定接種量和溫度發(fā)酵48h，發(fā)酵結(jié)束后烘干48h測(cè)定棉酚含量．溫度：按照30℃，35℃，40℃，45℃，50℃的培養(yǎng)溫度，固定接種量和含水量發(fā)酵48h，發(fā)酵結(jié)束后烘干48h測(cè)定棉酚含量．

同時(shí)每一組設(shè)置三個(gè)重復(fù)減小誤差④數(shù)據(jù)分析：用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。三、可行性分析1、取材：取材方便。

①、香菇栽培料，由楚雄種植香菇處提供，11、12月份真是采收時(shí)期，有大量的廢棄栽培料；②、試劑：酚標(biāo)準(zhǔn)品(含99％純棉酚)，耗材不多，可支付范圍內(nèi)；濃鹽酸，丙酮間苯三酚，95％乙醇，實(shí)驗(yàn)室都有。③、菌種：干酪乳桿菌(LacticacidbacteriaT7)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，黑曲霉(Aspergillusniger)實(shí)驗(yàn)室也有；2、設(shè)備：

培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋，超聲波儀，離心機(jī)，真空抽濾儀，研磨機(jī)冰箱等微生物實(shí)驗(yàn)室都有。3、儀器：陶瓷盤(pán)，量筒，滴管，容量瓶，三角瓶，試管等都是實(shí)驗(yàn)室常用儀器。4、操作：

簡(jiǎn)單方便，都是常規(guī)操作；5、耗時(shí)：

一組實(shí)驗(yàn)大約要50h，其中發(fā)酵培養(yǎng)要48h，干燥48h.而標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定需要6h，初步可行的話，加上后面的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)50h，后期數(shù)據(jù)分析大概一星期，準(zhǔn)備工作一星期，若遇問(wèn)題處理時(shí)間三星期SO~~~保守估計(jì)：一之三個(gè)月。當(dāng)然這只是估計(jì)時(shí)間。四、參考文獻(xiàn)[1]春芳，李全豐，王彩玲．生料固態(tài)發(fā)酵法降鰓棉酚的工藝研究[J]．中國(guó)飼料，2011，3：41．[2]王利，汪開(kāi)毓．動(dòng)物棉酚中毒的研究進(jìn)展[J]．飼料與添加劑，2002.5：26-28．[3]閻軼潔，宋維平，等．棉籽餅粕在畜禽中的應(yīng)用及棉酚的脫毒方法研究[J]飼料工業(yè)，2005,26(3)：47—50．[4]石秀俠，程茂基，蔡克周，等．棉籽餅有毒物質(zhì)及其脫毒方法研究進(jìn)展[J]．飼料博覽，2005,(6)：8—10．[5]王紅云，高占峰，付才．棉籽餅粕脫毒方法研究進(jìn)展[J]．河北農(nóng)業(yè)科學(xué),2004,8(1)：67—68．[6]喬國(guó)平，王立，王興國(guó)．棉籽餅粕脫毒方法研究進(jìn)展[J]．糧食與油脂，2002,(3)：27—29．[7]朱德偉，劉志鵬，蔡國(guó)林．高效降解棉酚菌種的篩選及棉粕發(fā)酵脫毒工藝研[J]．中國(guó)油脂，2010，35(2)：24．[8]文舉．高效降解棉酚菌種的選育及棉粕生物發(fā)酵的研究[D]．杭州：浙江大學(xué),2006．[9]顧賽紅，孫建義，李衛(wèi)芬．黑曲霉PES固體發(fā)酵對(duì)棉籽粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響[J]．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2003，18(1)：70．[10]楊繼良，周大云，楊偉華，等．高效降解棉酚菌種的篩選及棉籽餅脫毒參數(shù)的研究[J]．棉花學(xué)報(bào)，2000，12(5)：225．[11]張文舉，許梓榮，孫建義，等．假絲酵母zD3與黑曲霉Zn8復(fù)合固體發(fā)酵對(duì)棉籽餅脫毒及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響研究[J]．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2006，21(6)：129．[12]趙順紅．棉粕生物發(fā)酵脫毒效果[D]．新疆石河子：石河子大學(xué)。2007：31．[13]全鑫，周春雨，范婕妤．草甘麟高效降解菌的篩選鑒定及降解特性研究[J]．四川大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，20lO，47(4)：921．[14]吳嬡瑾，王承明，吳謀成．響應(yīng)面優(yōu)化棉籽餅粕中棉酚的提取條件[J]．棉花學(xué)報(bào)，2009，21(2)：94．[15]李真金，任丹，蘇文濤．L-乳酸高產(chǎn)菌選育及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]．四川大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，48(2)：451．[16]李濤，岳田利，袁亞宏．蘋(píng)果多酚提取的響應(yīng)曲面