酶工程復(fù)習(xí)資料

/第一章緒論★1、酶與酶工程定義酶：具有生物催化功能的生物大分子。酶工程：酶的生產(chǎn)與應(yīng)用的技術(shù)過(guò)程?！?、酶的分類(lèi)與命名原則（圖見(jiàn)書(shū)P3酶的分類(lèi)）一、蛋白類(lèi)酶的分類(lèi)與命名1、習(xí)慣命名法1961年以前使用的酶的名稱(chēng)都是習(xí)慣沿用的，稱(chēng)為習(xí)慣名。主要依據(jù)原則：（1）根據(jù)酶作用的底物命名；淀粉酶、蛋白酶（2）根據(jù)酶催化反應(yīng)的性質(zhì)及類(lèi)型命名；有的酶結(jié)合上述兩個(gè)原則來(lái)命名。脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（3）來(lái)源：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶習(xí)慣命名比較簡(jiǎn)單，應(yīng)用歷史較長(zhǎng)，盡管缺乏系統(tǒng)性，但現(xiàn)在還被人們使用。2、國(guó)際系統(tǒng)命名法國(guó)際系統(tǒng)命名法原則是以酶的整體反應(yīng)為基礎(chǔ)的，規(guī)定每種酶的名稱(chēng)應(yīng)當(dāng)明確標(biāo)明酶的底物及催化反應(yīng)的性質(zhì)。如果一種酶催化兩個(gè)底物起反應(yīng)，應(yīng)在它們系統(tǒng)名稱(chēng)中包括兩個(gè)底物的名稱(chēng)，并以“：”號(hào)將它們隔開(kāi)。若底物之一是水時(shí)，可將水略去不寫(xiě)。3、國(guó)際系統(tǒng)分類(lèi)法及酶的編號(hào)1961年國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)（EnzymeCommission,EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類(lèi)型和機(jī)理，把酶分成6大類(lèi)：氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、合成酶，分別用1、2、3、4、5、6表示。每一個(gè)酶的分類(lèi)編號(hào)由4個(gè)數(shù)字組成，數(shù)字間由“·”隔開(kāi)，編號(hào)之前冠以EC（EnzymeCommission)。乳酸脫氫酶EC1.1.1.27第1大類(lèi)，氧化還原酶第1亞類(lèi)，氧化基團(tuán)CHOH第1亞亞類(lèi)，H受體為NAD+該酶在亞亞類(lèi)中的流水編號(hào)(1)氧化-還原酶氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如乳酸脫氫酶苯丙氨酸氧化酶，催化苯丙氨酸→酪氨酸。如兒童缺乏苯丙氨酸氧化酶，則苯丙氨酸→苯丙酮酸。苯丙酮酸隨血液進(jìn)入大腦，損害大腦發(fā)育，兒童稱(chēng)為弱智——苯丙酮尿癥。(2)轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。

例如，谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。(3)水解酶水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)：(4)裂合酶裂合酶催化從底物分子中移去一個(gè)基團(tuán)或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。(5)異構(gòu)酶異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過(guò)程。

例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。(6)合成酶合成酶，又稱(chēng)為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N以及C-S鍵的形成反應(yīng)。這類(lèi)反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。A+B+ATP+H-O-H===A?B+ADP+Pi例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。丙酮酸+CO2?草酰乙酸二、核酸類(lèi)酶的分類(lèi)與命名1、分子內(nèi)催化R酶：催化本身RNA分子的核酸類(lèi)酶★自我剪切型：在一定條件下催化本身RNA分子進(jìn)行剪切反應(yīng)的R酶。RNA前體→成熟的RNA+RNA片段例：T4噬菌體前體、丁型肝炎病毒RNA前體等。★自我剪接型：在一定條件下催化本身RNA分子進(jìn)行剪切和連接反應(yīng)的R酶。含Ⅰ型IVS的R酶：與四膜蟲(chóng)rRNA前體的IVS結(jié)構(gòu)相似，催化自我剪接需鳥(niǎo)苷（或5′鳥(niǎo)苷酸）和Mg2+參與。含Ⅱ型IVS的R酶：與細(xì)胞核mRNA前體中的IVS相似，催化自我剪接反應(yīng)不需要鳥(niǎo)苷或鳥(niǎo)苷酸參與，但仍需Mg2+。2、分子間催化R酶催化其他分子進(jìn)行反應(yīng)的核酸類(lèi)酶。RNA剪切酶、DNA剪切酶、多肽剪切酶、多糖剪接酶、多功能R酶酶活力概念酶活力的大小可以用一定條件下酶所催化的反應(yīng)初速度表示。在外界條件相同的情況下，反應(yīng)初速度越大，意味著酶活力越高。固定化酶活力的常用測(cè)定方法及注意點(diǎn)（P10見(jiàn)書(shū)上）第二章酶生物合成的基本理論★酶的生產(chǎn)方法1、提取分離法定義：采用各種技術(shù)從動(dòng)植物或微生物細(xì)胞中將酶提取出來(lái)，再與所含雜質(zhì)進(jìn)行分離的技術(shù)過(guò)程。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便缺點(diǎn)：原料的周期長(zhǎng)，來(lái)源有限，并受地理氣候和季節(jié)等因素的影響，受經(jīng)濟(jì)、技術(shù)及倫理各方面的限制。2、生物合成法：最廣泛使用的方法定義：經(jīng)過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)，通過(guò)人工操作，利用微生物細(xì)胞、動(dòng)植物細(xì)胞的生命活動(dòng)而獲得人們所需酶的技術(shù)過(guò)程。分類(lèi)：微生物發(fā)酵產(chǎn)酶（應(yīng)用最廣）、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)周期短，酶的產(chǎn)率高，不受生物資源、地理環(huán)境和氣候條件等影響。缺點(diǎn)：對(duì)發(fā)酵設(shè)備和工藝條件要求高。3、化學(xué)合成法定義：按照酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)中氨基酸或核苷酸的排列順序，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將一個(gè)一個(gè)的單體（氨基酸或核苷酸）連接起來(lái)而獲得所需酶的技術(shù)過(guò)程。缺點(diǎn)：反應(yīng)步驟多，只適于短肽，受試劑、設(shè)備和成本等因素限制。只合成化學(xué)結(jié)構(gòu)十分清楚的少數(shù)酶轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程：（轉(zhuǎn)入的起始、RNA鏈的延伸和RNA鏈合成的終止）轉(zhuǎn)錄以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成RNA分子的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄過(guò)程的特點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱(chēng)性：在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱(chēng)性。（反義鏈，有義鏈）反義鏈antisensestrand（無(wú)意義鏈，負(fù)鏈）：在RNA的轉(zhuǎn)錄中，用作模板的DNA鏈稱(chēng)為反義鏈。有義鏈codingstrand（編碼鏈，正鏈）：在RNA的轉(zhuǎn)錄中，不作為模板的DNA鏈稱(chēng)為有義鏈。轉(zhuǎn)錄所需酶：依賴(lài)DNA的RNA聚合酶又稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄酶，是以DNA為模板的一類(lèi)RNA聚合酶。原核生物：核心酶，全酶（核心酶+σ因子）。真核生物：RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，都屬于寡聚酶，酶的亞基數(shù)目為4～10個(gè)，亞基種類(lèi)有4～6種。轉(zhuǎn)錄過(guò)程起始位點(diǎn)的識(shí)別recognition轉(zhuǎn)錄起始initiation鏈的延伸elongation轉(zhuǎn)錄終止termination轉(zhuǎn)錄后加工modification蛋白質(zhì)的合成過(guò)程（P25）1、氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運(yùn)氨酰-tRNA合成酶AA+tRNA+ATP氨酰-tRNA+AMP+PPi對(duì)于E.coli而言，肽鏈合成時(shí)的第一個(gè)氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。酶生物合成的調(diào)節(jié)（P29）適應(yīng)酶：通過(guò)調(diào)節(jié)酶合成的量來(lái)控制微生物代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的。通過(guò)阻止酶的過(guò)量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。酶在細(xì)胞內(nèi)的含量取決于酶的合成速度和分解速度。細(xì)胞根據(jù)自身活動(dòng)需要，嚴(yán)格控制細(xì)胞內(nèi)各種酶的合理含量，從而對(duì)各種生物化學(xué)過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。酶濃度調(diào)節(jié)的化學(xué)本質(zhì)是基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。在細(xì)胞內(nèi)，所合成的酶的種類(lèi)及數(shù)量是由特殊的基因信息決定的。DNA所攜帶的酶蛋白遺傳信息，需要通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯而合成酶蛋白。在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程都有特定的調(diào)節(jié)控制機(jī)制，其中轉(zhuǎn)錄的調(diào)控占主導(dǎo)地位。因此，基因表達(dá)的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行?！锓纸獯x物阻遏作用（原核生物酶簡(jiǎn)述分解代謝物阻遏作用的原理及解除方法）分解代謝物阻遏作用是指某些物質(zhì)（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）經(jīng)過(guò)分解代謝產(chǎn)生的物質(zhì)阻遏某些酶（主要是誘導(dǎo)酶）生物合成的現(xiàn)象。原理：釋放能量葡萄糖等物質(zhì)分解代謝ATP↑、AMP↓細(xì)胞內(nèi)的cAMP通過(guò)磷酸二酯酶水解生成AMP腺苷酸環(huán)化酶活化受到抑制cAMP的生成受阻胞內(nèi)cAMP↓cAMP-CAP復(fù)合物↓啟動(dòng)基因位點(diǎn)上沒(méi)有足夠的cAMP-CAP復(fù)合物RNA聚合酶無(wú)法結(jié)合在啟動(dòng)基因位點(diǎn)上轉(zhuǎn)錄無(wú)法進(jìn)行，酶合成受阻細(xì)胞生長(zhǎng)、新陳代謝進(jìn)行ATP↓ADP↑、AMP↑、cAMP↑c(diǎn)AMP-CAP復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)基因的特定位點(diǎn)RNA聚合酶結(jié)合到相應(yīng)位點(diǎn)酶生物合成開(kāi)始解除方法：為了減少或解除分解代謝物阻遏作用，可以在培養(yǎng)環(huán)境中控制好某些容易降解物質(zhì)的量或添加一定量的cAMP。★酶生物合成的誘導(dǎo)作用（什么是酶合成的誘導(dǎo)作用？其原理是什么？）酶生物合成的誘導(dǎo)作用是指加入某些物質(zhì)，使酶的生物合成開(kāi)始或加速進(jìn)行的現(xiàn)象。原理？？★酶生物合成的反饋?zhàn)瓒糇饔茫ㄊ裁词敲干锖铣傻姆答佔(zhàn)瓒糇饔?？其原理？）酶生物合成的反饋?zhàn)瓒糇饔糜蟹Q(chēng)為產(chǎn)物阻遏作用，是指酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成受到阻遏的現(xiàn)象。原理？★端粒酶(P33)是催化端粒合成和延伸的酶。端粒酶是一種核糖核蛋白，包含蛋白質(zhì)和RNA兩種基本成分?！锟贵w酶（P34）又稱(chēng)為催化性抗體，是一類(lèi)具有生物催化功能的抗體分子。第三章酶的生物合成法生產(chǎn)（為什么酶制劑的生產(chǎn)主要以微生物為材料？）★產(chǎn)酶工藝條件及其調(diào)節(jié)控制（見(jiàn)P46-47看下）一、細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)將保藏的細(xì)胞接種于新鮮的培養(yǎng)基上，在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞的生命活性得以恢復(fù)的過(guò)程。條件：適合細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖的最適條件時(shí)間控制：培養(yǎng)到細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為宜二、pH的調(diào)節(jié)控制三、溫度的調(diào)節(jié)控制四、溶解氧的調(diào)節(jié)控制★微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的方式及特點(diǎn)（P49）1、固體培養(yǎng)發(fā)酵：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便；勞動(dòng)強(qiáng)度大、原料利用率低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)。2、液體深層發(fā)酵：酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式3、固定化細(xì)胞發(fā)酵4、固定化原生質(zhì)體發(fā)酵★簡(jiǎn)述提高酶產(chǎn)量的措施？1、添加誘導(dǎo)物能使某些酶的生物合成開(kāi)始或加速進(jìn)行的物質(zhì)。酶的作用底物：大腸桿菌在含乳糖的培養(yǎng)基中能大量合成β-半乳糖苷酶酶的反應(yīng)產(chǎn)物酶作用底物的類(lèi)似物進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)廉價(jià)的誘導(dǎo)物具有重要的意義和應(yīng)用前景2、控制阻遏物的濃度阻遏物：能夠引起某些酶的生物合成停止或減速進(jìn)行的物質(zhì)產(chǎn)物阻遏：由酶催化作用的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物引起的阻遏作用。分解代謝物阻遏：有分解代謝物（如葡萄糖或其他容易利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過(guò)分解代謝而產(chǎn)生的物質(zhì)）引起的阻遏作用。控制碳源濃度、添加一定量的環(huán)腺苷酸可以解除（減少）分解代謝物阻遏3、添加表面活性劑細(xì)胞膜高度的選擇透性表面活性劑》增加細(xì)胞的透過(guò)性——》利于胞外酶分泌——》酶產(chǎn)量↑4、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)速度、產(chǎn)物生成速度、基質(zhì)消耗速度以及環(huán)境因素對(duì)這些速度的影響的學(xué)科。★酶生物合成的模式及特點(diǎn)細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)過(guò)程一般經(jīng)歷調(diào)整期、生長(zhǎng)期、平衡期和衰退期等4個(gè)階段。通過(guò)分析比較細(xì)胞生長(zhǎng)與酶產(chǎn)生的關(guān)系,可以把酶生物合成的模式分為4種類(lèi)型。即同步合成型，延續(xù)合成型，中期合成型和滯后合成型。同步合成型：是酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)行的一種生物合成模式。特點(diǎn)：酶的生物合成不受分解代謝物的阻遏作用，也不受產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒糇饔?，而且酶所?duì)應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定。延續(xù)合成型：酶的生物合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開(kāi)始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成的一種生物合成模式。特點(diǎn)：酶的生物合成受分解代謝物的阻遏作用，而且酶所對(duì)應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定。中期合成型：酶的生物合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間以后才開(kāi)始，而在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶的生物合成也隨之停止的一種合成模式。特點(diǎn)：酶的生物合成受到產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒糇饔没蚍纸獯x物阻遏作用，而且酶所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性差。滯后合成型：酶的生物合成在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后才開(kāi)始并大量積累的一種合成模式。特點(diǎn)：酶的生物合成受到阻遏物的阻遏作用，而且酶所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性很好?！锂a(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)（P57）主要研究細(xì)胞產(chǎn)酶速率以及各種環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)酶速率的影響規(guī)律。固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點(diǎn)（P58-59）1、提高產(chǎn)酶率；2、可以反復(fù)使用或連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間；3、穩(wěn)定性好；4、縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率；5、產(chǎn)品容易分離純化；6、適用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)第四章酶的提取與分離純化細(xì)胞破碎方法：機(jī)械破碎、物理破碎、化學(xué)破碎、酶促破碎機(jī)械破碎通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。搗碎法、研磨法、勻漿法★物理破碎（P74）通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎溫度差破碎法；壓力差破碎法；超聲波破碎法★酶的提?。ǜ拍罴白⒁馐马?xiàng)）概念：酶的提取即酶的抽提，是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇ɑ蛉芤海┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑（或溶液的）中的過(guò)程。抽提原則：根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解特性，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中；非極性物質(zhì)易溶于非極性有機(jī)溶劑中；酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷帷⑾A、稀鹽溶液等進(jìn)行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。影響酶提取的主要因素溫度適當(dāng)提高→酶溶解度↑，擴(kuò)散速度↑→提取效果↑；過(guò)度提高→酶失活有機(jī)溶劑提取時(shí)：應(yīng)控制溫度在0~10℃pH影響酶的溶解度和穩(wěn)定性提取液的體積提取液的總量一般為原料體積的3~5倍，最好分幾次提取。★等電點(diǎn)沉淀法79原理：兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低；不同的兩性電解質(zhì)有有不同的等電點(diǎn)。缺點(diǎn)：沉淀不完全。因?yàn)榈入婞c(diǎn)時(shí)兩性電解質(zhì)分子表面的水化膜仍然存在，使酶等大分子仍有一定的溶解性，而使沉淀不完全。注意：調(diào)節(jié)pH時(shí)，防止局部過(guò)酸或過(guò)堿?！镉袡C(jī)溶劑沉淀法80有機(jī)溶劑使酶沉淀析出的原因：1、有機(jī)溶劑的存在使溶液的介電常數(shù)降低，從而使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集。2、有機(jī)溶劑與水作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。操作注意：有機(jī)溶劑的用量一般為酶液體積的2倍；pH一般調(diào)到欲分離酶的等電點(diǎn)附近；一般在低溫條件下操作。凝膠電泳（P104）？？聚丙烯凝膠電泳（為什么SDS-凝膠電泳不受蛋白分子電荷及分子形狀影響？）P106（1）連續(xù)凝膠電泳：只用一層凝膠，采用相同的pH和相同的緩沖液進(jìn)行的電泳。（2）不連續(xù)凝膠電泳：采用2層或3層性質(zhì)不同的凝膠（樣品膠、濃縮膠和分離膠）重疊起來(lái)使用，采用兩種不同的pH和不同的緩沖液進(jìn)行的電泳。第五章酶改性的基本理論★酶的改性：通過(guò)各種方法使酶的催化特性得以改進(jìn)的技術(shù)過(guò)程P123（酶的輔助因子）1、無(wú)機(jī)輔助因子Mg2+,Zn2+,Fe2+,Cu2+,Mn2+,Ca2+等金屬離子。2、有機(jī)輔助因子：分子量較小的有機(jī)化合物；在酶催化過(guò)程中起著傳遞電子、原子和基團(tuán)的作用。P124（1）煙酰胺核苷酸維生素B5，也叫維生素PP，抗賴(lài)皮病維生素，是吡啶的衍生物，有兩種：煙酸（尼克酸，nicotinicacid）煙酰胺（尼克酰胺，nicotinamide），體內(nèi)多以煙酰胺形式存在，性質(zhì)穩(wěn)定。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+，即輔酶Ⅰ）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+，即輔酶Ⅱ）是維生素B5的衍生物。在脫氫酶的催化過(guò)程中參與傳遞氫。氧化型：NAD+，NADP+還原型：NADH+H+，NADPH+H+（2）黃素核苷酸核黃素（VB2），是6,7-二甲基異咯嗪和核糖醇結(jié)合而成的化合物。核黃素的衍生物與磷酸結(jié)合成黃素單核苷酸（FMN）；FMN與一分子AMP縮合，形成黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。氧化型：FMN、FAD還原型：FMNH2、FADH2黃酶（黃素蛋白）的輔酶，參與氧化還原反應(yīng)氫原子傳遞（3）鐵卟啉過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶等氧化酶的輔助因子。通過(guò)共價(jià)鍵與酶蛋白結(jié)合牢固，起傳遞電子的作用。（4）硫辛酸（6,8-二硫辛酸）氧化還原酶催化作用中：傳遞氫；酮酸的氧化脫羧反應(yīng)中：?；鶄鬟f作用。（5）核苷三磷酸：ATP、GTP、CTP、UTP磷酸轉(zhuǎn)移酶的輔助因子。GTP：還是含Ⅰ型IVS的自我剪接酶的輔助因子。（6）鳥(niǎo)苷含Ⅰ型IVS的自我剪接酶的輔助因子（7）輔酶Q是一系列苯醌衍生物，為一些氧化還原酶的輔助因子。短側(cè)鏈的輔酶Q：主要存在于微生物中；長(zhǎng)側(cè)鏈的輔酶Q10：存在于哺乳動(dòng)物中。（8）谷胱甘肽（G-SH）L-谷氨酸、半胱氨酸、和甘氨酸組成的三肽，是一些氧化還原酶的輔助因子。（9）輔酶A3’-磷酸腺苷-5’-焦磷酸-泛酸-β-巰基乙胺泛酸（VB3），由α,γ-二羥基-β,β-二甲基丁酸和β-丙氨酸脫水縮合而成。（9）輔酶A（CoA）輔酶A是?；D(zhuǎn)移酶的輔酶；CoA的巰基可與?；愿吣芰蝓ユI結(jié)合，在糖、脂、蛋白質(zhì)代謝中起傳遞?；淖饔?。作為?；d體蛋白的輔基，參與脂肪酸合成的代謝；輔酶A對(duì)厭食、疲勞等癥狀有明顯的改善效果。（10）生物素（VB7、VH）由噻吩環(huán)和尿素結(jié)合而成，側(cè)鏈有一個(gè)戊酸，有α,β兩種異構(gòu)體.是羧化酶的輔酶，比如丙酮酸羧化酶、乙酰輔酶A羧化酶，參與CO2的固定和羧化作用。（11）硫胺素焦磷酸（TPP）硫胺素（VB1，抗腳氣病因子，抗神經(jīng)炎因子），其衍生物TPP是一個(gè)重要的輔酶，由硫胺素焦磷酸化而生成。作為脫羧酶的輔酶——參與α-酮酸的氧化脫羧；作為轉(zhuǎn)酮醇酶的輔酶——參與磷酸戊糖途徑；（12）磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺：VB6的衍生物VB6（吡哆素），是吡哆的衍生物，有吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺可以作為氨基轉(zhuǎn)移酶、氨基酸脫羧酶和半胱氨酸脫硫酶等的輔酶?！锩傅鞍椎母辨I參與連接蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的副鍵有：氫鍵、鹽鍵、二硫鍵、酯鍵、疏水鍵、金屬鍵和范德華力等。鹽鍵是由蛋白質(zhì)分子中氨基和羧基在一定條件下形成，其結(jié)合力較強(qiáng)，是蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的主要穩(wěn)定因素之一?！锩傅陌被釟埢?類(lèi)(P133-134)接觸殘基：直接與底物接觸的基團(tuán)，它們參與底物的化學(xué)轉(zhuǎn)變，是活性中心的主要必需基團(tuán)。包括結(jié)合基團(tuán)和催化基團(tuán)。輔助殘基：既不直接與底物結(jié)合，也不催化底物的化學(xué)反應(yīng)，但對(duì)接觸殘基的功能有促進(jìn)作用。它可促進(jìn)結(jié)合基團(tuán)對(duì)底物的結(jié)合，促進(jìn)催化基團(tuán)對(duì)底物的催化反應(yīng)。結(jié)構(gòu)殘基：是活性中心以外的必需基團(tuán)，它們與酶的活性不發(fā)生直接關(guān)系，但它們可穩(wěn)定酶的分子構(gòu)象，特別是穩(wěn)定酶活性中心的構(gòu)象，非貢獻(xiàn)殘基：也稱(chēng)為非必需基團(tuán)。對(duì)酶活性的發(fā)揮不起作用，可能在系統(tǒng)發(fā)育的物種專(zhuān)一性方面、免疫方面或者在體內(nèi)的運(yùn)輸轉(zhuǎn)移、分泌、防止蛋白酶降解的方面起一定作用。如果沒(méi)有這些基團(tuán)，酶的壽命、酶在細(xì)胞中的分布等方面受到限制。這些基團(tuán)的存在也可能是酶迄今未發(fā)現(xiàn)的新的活力類(lèi)型的活力中心。第六章酶分子修飾★酶分子修飾(P138)酶分子修飾定義:通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過(guò)程稱(chēng)為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過(guò)人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。酶分子修飾的意義提高酶的活力增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性降低或消除酶的抗原性研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響酶分子修飾的基本要求和條件基本要求：對(duì)酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。如：（1）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。（2）酶活性中心的狀況活性中心基團(tuán)、輔助因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等條件：修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團(tuán)，使修飾率高，同時(shí)酶的活力回收高。（1）pH與離子強(qiáng)度pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。（2）修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除一些非專(zhuān)一性的修飾反應(yīng)。（3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例酶分子的主鏈修飾？？1、定義酶分子主鏈：肽鏈或核苷酸鏈；是酶分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。酶分子的主鏈修飾：利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。2、主鏈的切斷修飾A、主鏈斷裂→酶活性中心破壞→酶催化功能喪失。探測(cè)酶活性中心的位置B、主鏈斷裂→酶活性中心的空間結(jié)構(gòu)不變→酶催化功能不變或損失不多，但抗原性發(fā)生改變。（肽鏈有限水解修飾）提高一些酶特別是藥用酶的使用價(jià)值C、主鏈斷裂→酶活性中心形成→酶分子顯示催化功能。酶原分子轉(zhuǎn)換為具有催化活性的酶3、主鏈連接修飾將兩種或兩種以上的酶通過(guò)主鏈連接在一起，形成一個(gè)酶分子具有兩種或多種催化活性的修飾方法。多酶融合體：在一個(gè)酶分子上具有兩種或多種催化活性的酶。將兩種或兩種以上酶的基因融合在一起→融合基因→克隆、表達(dá)→多酶融合體。★分子內(nèi)交聯(lián)修飾采用含有雙功能基團(tuán)的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等，與酶蛋白分子中兩個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)，形成共價(jià)交聯(lián)，可以使酶分子的空間構(gòu)象更為穩(wěn)定，從而提高酶的穩(wěn)定性的修飾方法稱(chēng)為分子內(nèi)交聯(lián)修飾。★大分子結(jié)合修飾：目前應(yīng)用最廣泛的酶分子修飾方法。采用水溶性大分子與酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的特性與功能的方法。修飾劑：水溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、蔗糖聚合物等；用前要活化。作用：提高酶活力、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性、降低或消除酶蛋白的抗原性。通過(guò)大分子結(jié)合修飾，可以提高酶活力，增加酶的穩(wěn)定性，降低或消除酶的抗原性等。（原因）p147★親和修飾：修飾劑只專(zhuān)一地與酶分子某一個(gè)位點(diǎn)上的某一個(gè)基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，而與此位點(diǎn)以外的同一種或不同中基團(tuán)都不發(fā)生作用的修飾方法。專(zhuān)一性不可逆抑制劑可以分為結(jié)合型（Ks型）不可逆抑制劑和催化型（Kcat型）不可逆抑制劑兩種。Ks型不可逆抑制劑：根據(jù)底物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的，具有與底物相似的結(jié)構(gòu)?？膳c酶專(zhuān)一性的結(jié)合，同時(shí)有一個(gè)與酶活性中心的某個(gè)必需基團(tuán)反應(yīng)的基團(tuán)，從而對(duì)某個(gè)必需基團(tuán)進(jìn)行修飾。Kcat型不可逆抑制劑：根據(jù)酶的催化機(jī)制設(shè)計(jì)的。可以與酶分子結(jié)合并被催化。同時(shí)還有一個(gè)潛在的反應(yīng)基團(tuán)可以在酶的催化作用下被活化，活化的基團(tuán)可與酶活性中心中的基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合修飾，從而導(dǎo)致酶的不可逆喪失催化活性?！锩阜肿拥奈锢硇揎棧ㄔ?、特點(diǎn)）定義：通過(guò)各種方法，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法稱(chēng)為酶分子的物理修飾。作用：可以了解不同物理?xiàng)l件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點(diǎn)：不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。第七章酶固定化★固定化酶：固定在一定載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶?！锇穹ǘx：將酶、細(xì)胞或原生質(zhì)體包埋在各種多孔載體中，使其固定化的方法。分類(lèi)：根據(jù)載體的材料和方法的不同分為凝膠包埋法（網(wǎng)格型包埋法）、半透膜包埋法（微囊型包埋法）1、凝膠包埋法：應(yīng)用最廣泛的固定化方法。定義：以各種多孔凝膠為載體，將酶、細(xì)胞或原生質(zhì)體包埋在凝膠的微孔內(nèi)的固定化方法。載體：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺凝膠等。注意事項(xiàng)：凝膠的孔徑應(yīng)控制在小于酶分子直徑的范圍內(nèi)；不適于那些底物或產(chǎn)物分子很大的酶類(lèi)的固定化。（1）瓊脂凝膠包埋法方法：瓊脂→加水加熱溶解→冷卻至48~55℃→加入酶、細(xì)胞或原生質(zhì)體的懸浮液并迅速攪拌均勻→趁熱將混懸液分散在預(yù)冷的甲苯或四氯乙烯溶液中→制的球狀固定化膠?！蛛x、洗凈、備用特點(diǎn)：瓊脂凝膠的機(jī)械強(qiáng)度差；氧氣、底物、產(chǎn)物的擴(kuò)散較困難。（2）海藻酸鈣凝膠包埋法方法：配制一定濃度的海藻酸鈉溶液→滅菌→與酶、細(xì)胞或原生質(zhì)體懸浮液混合均勻→將懸液滴加到一定濃度的氯化鈣溶液中→制的球狀的固定化膠粒。特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、條件溫和；對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性；通過(guò)改變海藻酸鈉的濃度可以改變凝膠的孔徑；磷酸鹽會(huì)破壞凝膠的結(jié)構(gòu)；一般在培養(yǎng)基中保持一定濃度的鈣離子，以維持凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。（3）角叉菜膠包埋法方法：角叉菜膠懸浮于水中→加熱溶解、滅菌→冷卻至35~55℃→與酶、細(xì)胞或原生質(zhì)體懸浮液混勻→趁熱滴到預(yù)冷的氯化鉀溶液中→制得球狀固定化膠粒。特點(diǎn)：制備簡(jiǎn)便；對(duì)細(xì)胞和原生質(zhì)體無(wú)毒害；通透性能較好；具有一定的機(jī)械強(qiáng)度。（4）明膠包埋法方法：配制一定濃度的明膠懸浮液→加熱溶解、滅菌→冷卻至35℃以上→與酶、細(xì)胞或原生質(zhì)體懸浮液混勻→冷卻制成所需的形狀。特點(diǎn)：不適用于蛋白酶及產(chǎn)生蛋白酶的細(xì)胞或原生質(zhì)體的固定化；如機(jī)械強(qiáng)度不夠，可用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)強(qiáng)化。（5）聚丙烯酰胺凝膠包埋法方法：配制一定濃度的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺溶液→與酶、細(xì)胞或原生質(zhì)體懸浮液混勻→加入過(guò)硫酸鈣及四甲基乙二胺→混合、靜止、制得固定化膠粒。特點(diǎn)：所得固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度高；可通過(guò)改變丙烯酰胺的濃度調(diào)節(jié)凝膠孔徑的大?。槐M量縮短聚合時(shí)間，以減少丙烯酰胺單體對(duì)細(xì)胞的毒害作用。（6）光交聯(lián)樹(shù)脂包埋法方法：選擇一定分子量的光交聯(lián)樹(shù)脂預(yù)聚物→加入1%左右的光敏劑→加水、加熱到50℃左右溶解→與酶、細(xì)胞或原生質(zhì)體懸浮液混勻→鋪成薄層→紫外光照射3min左右→無(wú)菌條件下切成一定的形狀。特點(diǎn)：通過(guò)選擇不同分子量的預(yù)聚物可改變樹(shù)脂孔徑；光交聯(lián)樹(shù)脂強(qiáng)度高，可連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間；短時(shí)的紫外照射即可完成固定化，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖和新陳代謝無(wú)明顯的影響。2、半透膜包埋法定義：將酶或細(xì)胞包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶或固定化細(xì)胞。載體：聚酰胺膜、火棉膠膜等。適用：底物和產(chǎn)物都是小分子物質(zhì)的酶的固定化。方法：將酶液滴分散在與水互不相溶的有機(jī)溶劑中，在酶液滴表面形成半透膜，將酶包埋在微膠囊中?！锝Y(jié)合法定義：選擇適宜的載體，使之通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法。分類(lèi)：根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學(xué)鍵不同分為離子鍵結(jié)合法、共價(jià)鍵結(jié)合法1、離子鍵結(jié)合法定義：通過(guò)離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體：某些不溶于水的離子交換劑，如DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠方法：一定條件下，酶與載體混合攪拌幾小時(shí)，或是將酶液緩緩流過(guò)處理好的離子交換柱。特點(diǎn)：結(jié)合力較弱，在pH、離子強(qiáng)度等條件改變時(shí)，酶容易脫落。使用注意：pH、離子強(qiáng)度、溫度等的控制。2、共價(jià)鍵結(jié)合法定義：通過(guò)共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法。常用載體：纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。特點(diǎn)：結(jié)合牢固、酶不會(huì)脫落、可連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間；載體活化的操作復(fù)雜；共價(jià)結(jié)合可能影響酶的空間結(jié)構(gòu)，從而影響酶的催化活性。共價(jià)鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式”：由于載體上的功能基團(tuán)與酶分子上的側(cè)鏈基團(tuán)間不具有直接反應(yīng)的能力，因此在偶聯(lián)反應(yīng)前，需先進(jìn)行載體活化。首先載體上引進(jìn)活潑基團(tuán)；然后活化該活潑基團(tuán)；最后此活潑基團(tuán)再與酶分子上某一基團(tuán)形成共價(jià)鍵（關(guān)鍵）載體活化的方法：A、重氮法：需要載體具有芳香族氨基。含苯氨基的不溶性載體與亞硝酸反應(yīng)→生成重氮鹽衍生物，載體引入了活潑的重氮基團(tuán)→重氮基團(tuán)可與酶分子中的酚基或咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。B、疊氮法含酰肼基團(tuán)的載體用亞硝酸活化→生成疊氮化合物→疊氮基團(tuán)與酶分子中的氨基、羥基或巰基等反應(yīng)。C、溴化氰法含有羥基的載體用溴化氫活化→生成亞氨基碳酸衍生物→在微堿性條件下，亞氨基碳酸基團(tuán)可與酶分子上的氨基反應(yīng)。D、烷基化法含羥基的載體用多鹵代物進(jìn)行活化→形成含鹵素基團(tuán)的活化載體→鹵素基團(tuán)可與酶分子上的氨基、巰基、羥基等發(fā)生烷基化反應(yīng)?！锕潭ɑ傅奶匦裕▎?wèn)固定化酶穩(wěn)定性的變化？）則需答出其表現(xiàn)和原因＊一、穩(wěn)定性§穩(wěn)定性的表現(xiàn)：1、對(duì)熱穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度。如氨基?；?、保存穩(wěn)定性好，可以在一定條件下保存較長(zhǎng)時(shí)間。3、對(duì)蛋白酶的抵抗力增強(qiáng)，不易被蛋白酶水解。4、對(duì)變性劑的耐受性提高。§穩(wěn)定性的原因固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接，可防止酶分子伸展變形。酶活力的釋放是緩慢的，阻擋不利因素對(duì)酶的侵襲。抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性，限制了酶分子間的相互作用，使酶失去了相互作用的機(jī)會(huì)。＊最適pHP164§1、載體性質(zhì)對(duì)最適pH的影響載體帶負(fù)電荷，最適pH向堿性方向移動(dòng)。載體帶正電荷，最適pH向酸性方向移動(dòng)。影響的原因：因?yàn)楣潭ɑ割w粒在水溶液中，是被一層幾乎不流動(dòng)的液體包圍著，這層不流動(dòng)液體叫做擴(kuò)散層，擴(kuò)散層與其周?chē)獠咳芤褐g存在著Donnan平衡效應(yīng)。若是多陰離子載體就會(huì)吸引溶液中的陽(yáng)離子（如H+），使其附著于載體表面，導(dǎo)致擴(kuò)散層的H+濃度比其周?chē)獠咳芤焊?，于是擴(kuò)散層pH值就比外部溶液pH值低。因此，外部溶液的pH必須向堿側(cè)偏移，才能抵消微環(huán)境作用，使固定化酶達(dá)到最大效率，因此使用帶負(fù)電荷的載體制備的固定化酶，其最適pH比游離酶高。反之，亦然?！?、產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)最適pH的影響表現(xiàn)：產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高；產(chǎn)物為堿性時(shí)，固定化酶的pH值比游離酶的pH值低；產(chǎn)物為中性時(shí)，固定化酶的最適pH一般不改變。原因:擴(kuò)散限制產(chǎn)物為酸性積聚在固定化酶的催化區(qū)域的催化區(qū)域內(nèi)pH降低提高周?chē)磻?yīng)液堿性pH升高降低的pH，能達(dá)到酶所要求的pH葡萄糖氧化酶電極1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出葡萄糖氧化酶電極并把它用于葡萄糖的定量分析。★青霉素酶電極以固定化青霉素酶的酶膜與pH電極結(jié)合而成。將青霉素酶固定在聚丙烯酰胺凝膠或光交聯(lián)樹(shù)脂膜內(nèi)，然后緊貼在玻璃(pH)電極上即成。當(dāng)酶電極浸入含青霉素的溶液中時(shí)，青霉素酶催化青霉素水解生成青霉烷酸，引起溶液中氫離子濃度增加，通過(guò)pH電極測(cè)出pH值變化，即可測(cè)出樣品溶液中青霉素的含量。微生物傳感器可分為呼吸活性測(cè)定型和電極活性測(cè)定型兩種第八章酶的非水相催化酶都溶于水，只有在一定量的水存在的條件下，酶分子才能進(jìn)行催化反應(yīng)。所以酶在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，水是不可缺少的成分之一。有機(jī)介質(zhì)中的水含量多少對(duì)酶的空間構(gòu)象、酶的催化活性、酶的穩(wěn)定性、酶的催化反應(yīng)速度等都有密切關(guān)系，水還與酶催化作用的底物和反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度有關(guān)。酶的水化過(guò)程酶蛋白分子的離子化基團(tuán)水化過(guò)程，水與酶分子表面帶電基團(tuán)結(jié)合。此時(shí)酶自由度很小，沒(méi)有表現(xiàn)出催化活性。酶蛋白分子中的極性部分水簇的生長(zhǎng)過(guò)程，水與酶表面的極性基團(tuán)結(jié)合。酶顯示出活性。水吸附到酶蛋白分子表面相互作用較弱的部位。酶活性隨著水含量的增加而增加。酶分子表面完全水化，被單層水分子覆蓋。水分子在活性位點(diǎn)形成的介電屏蔽作用和水分子聚集造成的傳質(zhì)阻力使酶活力降低。結(jié)合水：緊緊結(jié)合在酶分子表面的少部分水溶劑水：溶解于有機(jī)溶劑的游離水必需水（essentialwater）：緊緊吸附在酶分子表面，維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必需的最低水量。水活度更能準(zhǔn)確描述有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系中水與酶催化活性之間的關(guān)系。水活度（Aw）：在一定的溫度和壓力下，反應(yīng)體系中水的摩爾分?jǐn)?shù)χw與水活度系數(shù)γw的乘積。即Aw=χw×γw(溶劑的疏水性越大，γw越大）熱力學(xué)穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性提高；儲(chǔ)存穩(wěn)定性提高；通常情況下，隨著介質(zhì)中水含量的增加，其熱穩(wěn)定性降低，存在臨界水濃度。1、熱穩(wěn)定性提高的原因：酶結(jié)構(gòu)剛性的增強(qiáng)水介質(zhì)中，酶分子表面的親水區(qū)與水相接觸，溶液中的水分子與酶分子中的功能團(tuán)之間形成氫鍵，使酶蛋白形成具有柔韌性的開(kāi)放型空間結(jié)構(gòu)。非水介質(zhì)中，酶分子的疏水區(qū)暴露，酶分子的折疊受到破壞，帶電基團(tuán)之間的相互作用使酶蛋白形成了活性的封閉構(gòu)象，酶分子的剛性得到增強(qiáng)，對(duì)受熱而引起的折疊松散的抗性也隨之增強(qiáng)。2、熱穩(wěn)定性提高的原因：水含量有限水介質(zhì)中，隨著溫度的升高，酶分子表現(xiàn)出折疊及螺旋結(jié)構(gòu)的松散及一種或多種變性反應(yīng)。無(wú)水或含微量水的非水介質(zhì)中，缺少了足夠的水分子參與，那些變性反應(yīng)受到了有效的抑制?！飌H記憶：在有機(jī)溶劑中酶的最適pH與水相中酶的最適pH相同，即酶能夠記住最后保存其的水溶液的pH。分子記憶：根據(jù)分子識(shí)別理論，酶通過(guò)配體的誘導(dǎo)、相互作用改變酶的構(gòu)象，從而獲得與配體類(lèi)似物結(jié)合的能力，這種有配體誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶的記憶方法就是分子記憶。大題：1、非水介質(zhì)中，水對(duì)酶的影響？酶催化反應(yīng)是在環(huán)繞著酶分子表面的水層內(nèi)進(jìn)行的，所謂非水體系并不是絕對(duì)無(wú)水的，而是一種含有微量水的有機(jī)溶劑體系(水含量≤1％)。在這種體系中，宏觀(guān)上是有機(jī)溶劑，微觀(guān)上是水體系。酶催化反應(yīng)時(shí)，底物分子須先從有機(jī)相進(jìn)入水相，然后才能與酶形成底物—酶復(fù)合物，繼而發(fā)生反應(yīng)。酶蛋白質(zhì)分子表面含有大量帶電基團(tuán)和極性基團(tuán)，在絕對(duì)無(wú)水條件下，這些帶電基團(tuán)因相互作用而形成“鎖定”的失活構(gòu)象。加入適量水充當(dāng)潤(rùn)滑劑，酶分子與水分子之間可形成氫鍵使酶的柔性增大，維持酶的活性。生物反應(yīng)體系中的水絕大多數(shù)(98％)是作為真正的溶劑水(bulkwate)，而少部分的水緊密結(jié)合在酶分子的表面，并被稱(chēng)為結(jié)合水(boundwater)。結(jié)合水的物理性質(zhì)如熔點(diǎn)、熱容、EPR和IR的光譜特征與溶劑水不同。結(jié)合水對(duì)酶的結(jié)構(gòu)和催化活性至關(guān)重要，因此結(jié)合水又被稱(chēng)為結(jié)構(gòu)水(structuralwatert)或稱(chēng)必需水(essentialwater)。據(jù)此可以推測(cè)若用有機(jī)溶劑僅取代溶劑水而不取代結(jié)構(gòu)水，特I不會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生很大影響。1）水對(duì)酶的柔性1、酶分子水化無(wú)水條件→酶分子的帶電基團(tuán)和極性基團(tuán)之間通過(guò)相互作用形成一種非活性的“封閉”結(jié)構(gòu)→加入水→這種相互作用減弱→“封閉”結(jié)構(gòu)“疏松”→柔韌性增加→以非共價(jià)作用力維持酶的催化活性構(gòu)象。酶活性部位保持一定的柔性是酶表現(xiàn)其催化活性所必需的。2、酶的水化過(guò)程酶蛋白分子的離子化基團(tuán)水化過(guò)程，水與酶分子表面帶電基團(tuán)結(jié)合。此時(shí)酶自由度很小，沒(méi)有表現(xiàn)出催化活性。酶蛋白分子中的極性部分水簇的生長(zhǎng)過(guò)程，水與酶表面的極性基團(tuán)結(jié)合。酶顯示出活性。水吸附到酶蛋白分子表面相互作用較弱的部位。酶活性隨著水含量的增加而增加。酶分子表面完全水化，被單層水分子覆蓋。水分子在活性位點(diǎn)形成的介電屏蔽作用和水分子聚集造成的傳質(zhì)阻力使酶活力降低。水參與一些非共價(jià)鍵的形成來(lái)維持酶的構(gòu)象，使酶有一定的柔性，能趨向于最佳催化狀態(tài)所需的構(gòu)象變化。但水含量高，酶柔性過(guò)大，也會(huì)使酶構(gòu)象改變、失活。有機(jī)溶劑中，溶劑無(wú)法提供形成多種氫鍵的能力，甚至還會(huì)使酶帶電基團(tuán)之間靜電作用加強(qiáng)，使酶剛性增加，活性降低。水含量在最適含量時(shí)，酶結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)剛性與熱力學(xué)穩(wěn)定性之間達(dá)到最好的平衡，酶的活力最大。2)水對(duì)酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性提高；儲(chǔ)存穩(wěn)定性提高；通常情況下，隨著介質(zhì)中水含量的增加，其熱穩(wěn)定性降低，存在臨界水濃度。3）水對(duì)酶的活力1、水對(duì)非水介質(zhì)中酶活力的影響在有機(jī)介質(zhì)中，酶的最大催化活力都在相同的最佳水活度下，與溶劑的極性無(wú)關(guān)，而最佳水活度都在0.55左右。對(duì)于固定化酶，多數(shù)載體不直接影響酶分子與水分子的相互作用2、非水介質(zhì)中，有機(jī)溶劑對(duì)酶的影響？在使用不同的酶或者在不同的反應(yīng)體系中，最適于使用的有機(jī)溶劑也是不同的。有機(jī)溶劑影響酶催化的途徑有三種:一是有機(jī)溶劑與酶直接發(fā)生作用，通過(guò)干擾氫鍵和疏水鍵等改變酶的構(gòu)象，從而導(dǎo)致酶的活性被抑制或酶的失活;二是有機(jī)溶劑和能擴(kuò)散的底物或產(chǎn)物相互作用，影響正常酶催化反應(yīng)的進(jìn)行;三是有機(jī)溶劑還可以直接和酶所需的必需水相互作用。一般認(rèn)為在非水介質(zhì)中添加親水性或和水互溶性的有機(jī)溶劑對(duì)反應(yīng)不利，因?yàn)樗鼈儠?huì)奪取酶周?chē)h(huán)境的必需水，從而使酶失活，所以選擇的有機(jī)溶劑疏水性越強(qiáng)越好。有機(jī)溶劑疏水性的強(qiáng)弱通常是用有機(jī)溶劑在水和正辛醇中的分配系數(shù)P表示。Laane等人【20j認(rèn)為，在使用lgP值小于2的有機(jī)溶劑時(shí)酶的活性較低，而在合成反應(yīng)(如酷化反應(yīng))中，所選的lgP值大于4時(shí)被認(rèn)為是有利的。一般所選擇的有機(jī)溶劑為飽和烷烴和芳香烴，如苯、甲苯、己烷和異辛烷等。但是事實(shí)也并非完全如此一些研究表明，當(dāng)以各種有機(jī)溶劑在水相的濃度相等為基礎(chǔ)相比較時(shí)，將呈現(xiàn)上述順序相反的趨勢(shì)，即極性越小(lgP高)的有機(jī)溶劑對(duì)酶活有害。在這些場(chǎng)合中，用于比較的化合物都有較高的lgP。因?yàn)殡S著極性的減小，有機(jī)溶劑在水中溶解度的降低比其使酶失活能力的降低幅度更大，因而此時(shí)高地P的有機(jī)溶劑對(duì)酶的活性具有稍強(qiáng)的抑制能力。1)對(duì)酶的結(jié)構(gòu)與功能2）對(duì)酶的活性有機(jī)溶劑對(duì)酶活性中心的影響:溶劑通過(guò)減少酶活性中心的數(shù)量對(duì)酶的活性產(chǎn)生影響。因?yàn)槿軇┢茐牧嗣傅鞍谆钚灾行牡臍滏I、離子鍵或者造成酶蛋白去折疊而導(dǎo)致活性中心的減少。非極性有機(jī)溶劑與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心的結(jié)合位點(diǎn)，從而降低了活性中心的極性，減弱了底物與活性中心的結(jié)合能力。3）對(duì)底物與產(chǎn)物的影響有機(jī)介質(zhì)中酶的反應(yīng)：底物→進(jìn)入必需水層→進(jìn)入酶的活性中心→發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)物→分布在必需水層→轉(zhuǎn)移出水層→反應(yīng)繼續(xù)有機(jī)溶劑能改變酶分子必需水層中底物和產(chǎn)物的濃度有機(jī)溶劑極性很小，疏水性太強(qiáng)→疏水性底物在有機(jī)溶劑中溶解度大→難于進(jìn)入必需水層→降低催化速度有機(jī)溶劑極性過(guò)大→親水性太強(qiáng)→疏水性底物在有機(jī)溶劑中溶解度低→底物濃度降低→催化速度減慢應(yīng)該選擇極性適中的有機(jī)溶劑作為介質(zhì)使用1、底物選擇性非水介質(zhì)中，有機(jī)溶劑與底物間的疏水作用比底物與酶間的疏水作用強(qiáng)→疏水性強(qiáng)的底物容易受到有機(jī)溶劑的作用→與酶分子的結(jié)合受到影響。可見(jiàn)，有機(jī)溶劑改變，酶的底物專(zhuān)一性也會(huì)發(fā)生改變。極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑中，疏水性強(qiáng)的底物容易進(jìn)行反應(yīng)。極性較弱的有機(jī)溶劑中，疏水性較弱的底物容易進(jìn)行反應(yīng)。第九章酶應(yīng)用的基本理論酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)定義：研究酶催化反應(yīng)速度及其影響因素的學(xué)科，是酶學(xué)研究的重要內(nèi)容，也是酶應(yīng)用的重要理論依據(jù)。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)處理以及動(dòng)力學(xué)常數(shù)的求?。?種方程）Lineweaver-Burk方程：對(duì)米氏方程兩側(cè)取雙倒數(shù)Eadie-Hofstee方程：對(duì)米氏方程進(jìn)行改寫(xiě)Hanes方程：對(duì)米氏方程進(jìn)行改寫(xiě)直接線(xiàn)性作圖法：將米氏方程改寫(xiě)成常用動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)處理方法的比較：Lineweaver-Burk法：最常用的方法，其優(yōu)點(diǎn)是變量v和[S]在不同的軸上；缺點(diǎn)是在圖線(xiàn)上1/v和1/[S]取值范圍內(nèi)存在不均衡的誤差分布。Eadie-Hofstee法和Hanes法：其圖線(xiàn)中誤差分布是均衡的。直接線(xiàn)性作圖法：v和[S]值直接表示在圖線(xiàn)上，不需要計(jì)算就可以得到Vmax和Km值；具有統(tǒng)計(jì)合理性，使用Vmax和Km的中位數(shù)，減少了v和[S]的極端值對(duì)這些參數(shù)的影響。米氏方程1913年Michaelis和Menten在前人工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)酶反應(yīng)的中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)，推導(dǎo)出底物濃度與酶反應(yīng)速率之間的定量關(guān)系，稱(chēng)之為米氏方程：★米氏方程及常數(shù)的意義1.物理意義：Km值等于酶反應(yīng)速度為最大速度一半時(shí)的底物濃度。2.Km值愈大，酶與底物的親和力愈??；Km值愈小，酶與底物親和力愈大。酶與底物親和力大，表示不需要很高的底物濃度，便可容易地達(dá)到最大反應(yīng)速度。3.Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)，酶所催化的底物和酶促反應(yīng)條件(如溫度、pH)有關(guān)，與酶的濃度無(wú)關(guān)。酶的種類(lèi)不同，Km值不同，同一種酶與不同底物作用時(shí)，Km值也不同。4.米氏方程描述了酶催化反應(yīng)速度與底物濃度之間的關(guān)系第十章酶反應(yīng)器的應(yīng)用用于酶進(jìn)行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備稱(chēng)為酶反應(yīng)器。酶反應(yīng)器的分類(lèi)按結(jié)構(gòu)區(qū)分為攪拌罐式反應(yīng)器、填充床式反應(yīng)器、流化