分光光度法測定紅細(xì)胞滲透脆性

生理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計————分光光度法測定紅細(xì)胞滲透脆性分光光度法測定紅細(xì)胞滲透脆性紅細(xì)胞膜，有人稱為鬼影(ghost)，是一種由磷脂、非?；哪懝檀己吞堑鞍椎冉M成膜脂質(zhì)和主體、膜蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和表面抗原)與周圍膜蛋白質(zhì)(膜骨架中的收縮蛋白和肌動蛋白以及膜骨架依靠的錨蛋白)所組成。這些成分要保證紅細(xì)胞在120天壽命內(nèi)50，000次通過“急流旋渦”仍能生存；要控制Na+和K+在細(xì)胞內(nèi)的濃度，任何導(dǎo)致K+漏出增高超過Na+的漏入，均會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)單價陽離子和水分的丟失。這些生理功能的完善與否，可用簡單且明白的膜滲透脆性試驗(yàn)來了解。傳統(tǒng)的測定方法采用目測觀察其溶血情況，觀察需要靜置幾個小時且過程中不能晃動。此法僅能觀察到溶血的大致情況，不能量化紅細(xì)胞破裂的程度。本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法精確測定紅細(xì)胞在低滲氯化鈉溶液中的溶血情況，本實(shí)驗(yàn)操作簡單、準(zhǔn)確可靠、時間短，能消除常規(guī)目測觀察的主觀誤差?！緦?shí)驗(yàn)原理】正常紅細(xì)胞懸浮于等滲的血漿中，若置于高滲溶液內(nèi)，則紅細(xì)胞會因失水而皺縮；反之，置于低滲溶液內(nèi)，則水進(jìn)入紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞膨脹。如環(huán)境滲透壓繼續(xù)下降，紅細(xì)胞會因繼續(xù)膨脹而破裂，釋放血紅蛋白，稱之為溶血。紅細(xì)胞對低滲溶液有一定的抵抗力，這一特征稱為紅細(xì)胞的滲透脆性?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹坷斫饧?xì)胞外滲透壓對維持細(xì)胞正常形態(tài)和功能的重要性。掌握紅細(xì)胞滲透脆性的實(shí)驗(yàn)原理。采用分光光度法精確測定紅細(xì)胞在低滲氯化鈉溶液中的溶血情況?！緦?shí)驗(yàn)材料】儀器與試劑LDZ4-0.8離心機(jī)、722S可見分光光度計、維生素C注射液0.5g/ml、桔梗煎劑0.16g/ml、20％氨基甲酸乙酯、肝素（1000U、ml）。動物家兔，體重（2.5±0.5）kg，雌雄兼用?！緦?shí)驗(yàn)操作】1、不同濃度低滲氯化鈉溶液的配置取口徑相同、清潔干凈的小試管做好編號，制成不同濃度的低滲鹽溶液，每管總量為2.5ml，第14管為蒸餾水。具體見表一。Tab1PreparationofdifferentconcentrationsofhypotonicNaClsolution試管編號1％氯化鈉（ml）蒸餾水（ml）氯化鈉濃度（％）8431.51.00.60628481.01.50.40628401402.502、最大吸收波長的測定取14管加入0.1毫升血液，輕輕顛倒混勻5分鐘，3000r/min離心10分鐘，取上清液至比色皿中，以13管為空白對照，在722S可見分光光度計上掃描，測得其最大吸收波長為535nm。3、紅細(xì)胞在不同濃度低滲氯化鈉溶液中溶血率的測定用20％氨基甲酸乙酯0.75--1.0g/kg麻醉家兔后注射肝素。從耳緣靜脈取血，依次向14支試管內(nèi)各加0.1毫升血液，輕輕顛倒混勻5分鐘，置入干燥離心管中以3000r/min離心10分鐘，取上清液在光度計545nm波長處檢測。用13管生理鹽水的上清液調(diào)零，測其他每管吸光度，分別計算出1到12管的溶血率：溶血率＝樣品吸光度÷最大溶血吸光度×100％。4、桔梗煎劑、維生素C對紅細(xì)胞滲透脆性的影響取血方法同上，依次向14支試管內(nèi)各加0.1毫升血液后，用加樣器加入50微升桔梗煎劑或者維生素C，用上述相同方法分別測定各管溶血率。5、統(tǒng)計結(jié)果計算出每管平均溶血率，與目測法的結(jié)果進(jìn)行比較。【實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果】1、不同濃度低滲氯化鈉溶液對紅細(xì)胞滲透脆性的影響常規(guī)目測法1—6管內(nèi)紅細(xì)胞肉眼觀察無溶血，測其溶血率在9％以下，表明溶血程度很低；7—9管內(nèi)紅細(xì)胞肉眼觀察部分溶血，測其溶血率在30％—67％，表明有部分溶血；9—12管內(nèi)紅細(xì)胞肉眼觀察完全溶血，結(jié)果見表二。溶血率的測量結(jié)果與目測法觀察結(jié)果一致。2、桔梗煎劑、維生素C對紅細(xì)胞滲透脆性的影響在加入桔梗煎劑后家兔紅細(xì)胞對低滲溶液抵抗力降低，0.68％—0.24%NaCl溶液內(nèi)紅細(xì)胞的溶血率均在89%—99%，溶血程度很高，說明紅細(xì)胞大多破裂溶解。在加入維生素C后家兔紅細(xì)胞對低滲溶液抵抗力增大，0.68％—0.24%NaCl溶液內(nèi)紅細(xì)胞的溶血率1%—30%，溶血程度較低，說明紅細(xì)胞破裂明顯減少，見圖一。Fig1effectofcampanulaceaedecoctionandvitaminConredbloodcellosmoticfragility【實(shí)驗(yàn)討論】紅細(xì)胞對低滲鹽溶液具有一定的抵抗力，其大小可用氯化鈉溶液濃度來表示。將血液加入不同濃度的低滲氯化鈉溶液中后，開始出現(xiàn)溶血現(xiàn)象的溶液濃度為該血液紅細(xì)胞最小抵抗力，出現(xiàn)完全溶血現(xiàn)象的溶液濃度為該紅細(xì)胞的最大抵抗力。前者代表最大脆性，后者代表最小脆性。本實(shí)驗(yàn)采用分光光度計測量法代替肉眼觀察法，通過計算溶血率分析了家兔紅細(xì)胞在不同滲透壓的滲透脆性，以量化指標(biāo)客觀地判斷溶血情況。選擇545nm波長為入射光，此處波長吸光系數(shù)高，測定的靈敏度高。此外，在加樣中，改用微量加樣器加樣，加樣準(zhǔn)確。正常紅細(xì)胞為雙凹盤形，在低滲鹽水中吸水膨脹的適應(yīng)性大(可增加70％的體積而不破裂)，遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥(HS)等紅細(xì)胞的S／V比率小，對低滲鹽水的適應(yīng)性小(脆性大)，所以紅細(xì)胞滲透跪性試驗(yàn)是檢測HS最有用的方法，當(dāng)紅細(xì)胞混懸于不同濃度的NaCl低滲溶液時，正常紅細(xì)胞于O．4％一0．44％NaCl濃度時開始溶血，于o．32％一O．36％NaCl濃度時完全溶血。HS病人的紅細(xì)胞大多于0．50％一0．75％NaCl時開始溶血，于0．4％NaCl濃度時完全溶血，患者紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)與正常對照組相比提高0.04％(NaCl液)以上即為陽性，還可見于遺傳性橢圓形紅細(xì)胞增多癥，某些伴有球形紅細(xì)胞增多的自身免疫性溶血性貧血。【非預(yù)期結(jié)果及可能原因分析】實(shí)驗(yàn)因素：血液放置過久；混勻血液或向試管內(nèi)滴加血液時用力過大；肝素抗凝時用量過多；玻璃器皿未干燥等。2、溶血程度不隨NaCl溶液濃度改變而有規(guī)律地變化原因：各試管加血量不準(zhǔn)確；試管編號不準(zhǔn)；溶液濃度配制不準(zhǔn)等?！九R床意義】紅細(xì)胞滲透脆性增加，見于遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、自身免疫性溶血性貧血和遺傳性橢圓形細(xì)胞增多癥。紅細(xì)胞滲透脆性減低，見于缺鐵性貧血、海洋性貧血、地中海貧血、血紅蛋白C、D、E病、肝臟疾病以及阻塞性黃疽等?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1、姚泰，《生理學(xué)》，第二版。人民衛(wèi)生出版社，2005，79—84。2、徐麗萍，